Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2010-2011 / De toutes les lésions qui menacent l'intégrité du génome, les cassures double-brin (CDBs) de l'ADN sont l'une des plus délétères, puisque toute cassure mal réparée suffit à induire des mutations et des translocations chromosomiques pouvant mener au cancer. La recombinaison homologue (RH) est un processus permettant aux cellules de réparer les CDBs de façon fidèle sans créer de mutations. Chez les eucaryotes supérieurs, ce mode de réparation repose en grande partie sur les fonctions catalytiques de la recombinase RAD51 et des évidences génétiques démontrent que ses paralogues, RAD51B, RAD51C, RAD51D, XRCC2 et XRCC3, sont également des acteurs clés dans ce processus. Jusqu'à présent, les paralogues de RAD51 n'ont été que très peu caractérisés sur le plan cellulaire et moléculaire si bien que leurs fonctions précises demeurent mal définies. Dans cette étude, nous apportons des évidences implicant les paralogues de RAD51 humains dans les étapes précoces de la RH. Plus précisément, nous démontrons que le paralogue RAD51C interagit avec la recombinase RAD51 et qu'il est requis pour l'assemblage de cette dernière en foyers de réparation. De plus, nous établissons par des immunoprécipitations de chromatine que les paralogues sont recrutés à proximité d'une CDB unique en phase S-G2 du cycle cellulaire et nous montrons par immunofluorescence que RAD51C s'y accumule en foyers, une signature des enzymes de réparation. Par ailleurs, nous avons découvert que les paralogues de RAD51 jouent un rôle crucial dans la progression du cycle cellulaire. Tandis que l'inhibition par ARN interférence de RAD51B ou RAD51C provoque un arrêt prolongé en G2-M, celle de XRCC3 favorise l'entrée en mitose par le phénomène d'adaptation. La microscopie en temps réel a démontré que la perte de XRCC3 engendre un délai mitotique qui s'accompagne d'une fréquence élevée d'anomalies de centrosomes et de défauts de ségrégation chromosomique (micronoyaux et ponts anaphases). Des phénotypes mitotiques comparables sont obtenus suivant la depletion de la résolvase GEN1. Conséquemment, nous proposons qu'une fonction tardive de XRCC3 et de GEN1 dans la RH, soit au niveau de la résolution des jonctions de Holliday, puisse être à l'origine de ces aberrations mitotiques. L'ensemble de ces données permet d'éclaircir les fonctions distinctes et communes des paralogues de RAD51 lors de la RH ainsi que leur rôle dans le maintien de la stabilité du génome en mitose.

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Dans les derniers 20 ans, les expériences de traction sur molécule unique par l’action d’une force mécanique ont donné plein d’informations autour des propriétés mécaniques des biomolécules, des modifications structurelles induites par des contraintes mécaniques, ainsi qu’éclaircir les mécanismes d’adhésion et décohésion des paires ligand-recepteur. Suivant cette analyse microscopique, outre que révéler des propriétés biologiques intéressantes, plusieurs de ces systèmes ont montré une nouvelle face, celle de nouveaux matériaux aux propriétés parfois uniques, et ont notamment induit des spéculations sur leur possibles utilisations dans des dispositif de nanotechnologie. Dans cette thèse, par le biais de simulations de dynamique moléculaire, notamment avec les méthodes dites “steered molecular dynamics” et “umbrella sampling”, nous avons réalisé des études concernant : (a) la caractérisation structurelle et mécanique de fragments d’ADN atypiques, comme le tétramère dénommé i-motif, ainsi que (b) la reconstruction des profils d’énergie libre de la liaison et dissociation entre des paires bromodomaine – queues d’histone acétylés (H3 et H4). Nous avons ainsi étudié la structure moléculaire de ces nanostructures particulières d’ADN, formées par l’intercalation de quatre brins d’ADN en un tétramère, et nous en avons déterminé pour la première fois les propriétés mécaniques de base : module de Young, module de flexion, longueur de persistance, et résistance mécanique. Dans la dernière partie du travail, nous avons étudié la manière d’appliquer ces mêmes méthodes à l’étude de paires ligand-recepteur dans le processus de transcription de l’ADN. Nous avons montré que les expériences simulées de traction, dans lesquelles la paire ligand-recepteur est séparée de manière contrôlée par une force mécanique aux extrémités, peuvent donner des informations sur l’hypersurface d’énergie libre. Nous avons essayé, avec un partiel succès, l’application au cas de l’interaction entre bromodomaines et queues d’histones, dans des conditions comparables aux expériences. / In the past 20 years, single-molecule pulling experiments of biomolecules under mechanical forces provided a wealth of information about the mechanical properties of such molecules, and the structural changes that may happen under stress in mechanical proteins, as well as shedding light upon many receptor-ligand binding and unbinding mechanism. Upon such microscopic analysis, besides revealing interesting biological properties, many such systems appeared as unique novel materials, and suggested routes to include such materials in nanotechnology assembly processes. This thesis reports on our studies of the structural and mechanical characterization of DNA i-motif and free-energy based profiling of bromodomain and acetylated histone tails (H3 and H4) binding and dissociation, by using molecular dynamics simulations, and in particular steered “molecular dynamics” and “umbrella sampling” methods. We studied the molecular structure of a peculiar class of DNA-based nanostructures, the i-motif, resulting from the intercalation of four DNA strands into a tetramer, and obtained for the first time its basic mechanical properties: Young’s modulus, bending modulus, persistence length and mechanical toughness. In a final part of the work, we also studied the applicability of the same computational methods to ligand-binding interactions in DNA trasncription. We showed that simulated pulling experiments on ligand-binding pairs, in which the pair is taken apart in a controlled way, can give informations about its free-energy landscape. We attempted, with mixed success, the application to the case of bromodomain-histone tail interactions under conditions comparable to the experiments.

L'assemblage d'objets microscopiques est actuellement un verrou majeur au c÷ur de domaines aussi importants et variés que les nanosciences, les MEMs ou la médecine. Le projet européen GOLEM s'inscrit dans une démarche novatrice pour résoudre cette problématique et propose d'utiliser des processus biologiques pour assembler des micro-objets de façon parallèle. Dans le cadre de ce projet, cette thèse aborde l'étude et l'analyse des méthodes d'assemblage bioinspirées pour assembler de façon réversible et contrôlée ces objets. L'approche proposée est multidisciplinaire, puisqu'il s'agit d'exploiter des connaissances issues de la biologie dans un contexte microrobotique. Le rapprochement entre ces deux domaines est une étape importante pour les développements futurs en micro et nanotechnologies et ouvre des perspectives intéressantes. Le choix de processus biologiques pour assurer l'assemblage de façon sélective et contrôlable entre les objets est crucial dans ce travail, et dépendent de deux propriétés fondamentales identitées : la stabilité et la spéci cité de l'interaction biologique. La stabilité concerne la capacité des composants à garder un état assemblé, sur une période de temps donnée et dans un environnement déstructuré. La spécificité concerne la reconnaissance mutuelle entre les composants à assembler. L'intégration de ces propriétés dans un processus d'assemblage rend envisageable la conception d'une méthode d'auto-assemblage, massive et parallèle, où les diférents composants, formant un système complexe, se positionnent et s'assemblent dans un processus stochastique sans intervention individuelle. L'intégration des ces propriétés biologiques sur la matière inorganique est abordée en plusieurs étapes : le choix d'un processus biologique, dont la stabilité et la spéci cité sont intrinsèques et contrôlables, l'étude théorique et expérimentale de la stabilité et la spéci cité de cette adhésion biologique sur des composants fonctionalisés, et la détermination des paramètres des contrôle de l'assemblage et leur optimisation. Ainsi, cette thèse cherche dans un premier temps à analyser les di érents travaux dans le domaine et principalement l'auto-assemblage aux échelles micro et nanoscopiques. Cet état de l'art multidisciplinaire ouvre sur le choix de l'ADN avec ses propriétés particulières, capables de répondre aux besoins de l'auto-assemblage. Les propriétés de stabilité et de spécificité du processus d'hybridation d'ADN sont ensuite étudiées. La stabilité est abordée selon deux angles, l'échelle individuelle et l'échelle populationnelle. L'échelle individuelle s'intéresse à l'interaction entre deux brins d'ADN simple avec une approche empruntée aux travaux en modélisation moléculaire. L'échelle d'étude est ensuite élargie à deux populations de brins complémentaires, fixées sur des surfaces à assembler. Cette configuration géométriquement contrainte est étudiée avec une approche thermodynamique au regard des différents paramètres extrinsèques comme la température et la concentration saline du milieu. Cette thèse aborde aussi la validation expérimentale des modèles développés. Dans un premier temps, un modèle est proposé pour coupler les résultats exprimés en termes d'énergie et les mesures expérimentales en termes de force. La première campagne expérimentale effectuée à Londres au NPL cherche à déterminer la stabilité de l'hybridation. Des outils méthodologiques d'analyse statique et énergétique sont mis en place pour l'appréhender et la quantiffier. La méthode énergétique est originale et couple des outils de simulation, de prédiction et d'analyse. Elle montre ainsi que la stabilité et la spécifficité sont intrinsèquement liées par la composition de la séquence en bases azotées des brins d'ADN. Il apparaît donc que celle-ci peut être optimisée pour produire des configurations plus favorables statistiquement. Un algorithme original de génération de séquences, basé sur le caractère programmable de l'ADN, est alors proposé pour disposer de couples de brin d'ADN dont les propriétés de stabilités et de spécifficités sont optimisées. Une validation expérimentale est ensuite entreprise en collaboration avec le laboratoire AMIR à Oldenburg en Allemagne. Ces expériences valident l'approche de conception de séquences et met en évidence l'inffluence de paramètres clefs comme la vitesse d'approche et le temps d'attente sur l'assemblage. Le premier chapitre est ainsi dédié à un état de l'art en auto-assemblage et couvre plusieurs domaines. Il vise à proposer une approche synthétique des différents thèmes de recherche abordés dans ce travail. Le deuxième chapitre aborde l'étude des propriétés de stabilité et de spécifficité à travers une modélisation multi-échelle et les paramètres de contrôle et environnementaux. Le troisième chapitre s'intéresse à la validation expérimentale et propose des méthodes d'analyse statistique et énergétique originales pour comprendre et classifier les interactions en termes de stabilité et de spécifficité. Le dernier chapitre s'attache à définir l'outil logiciel développé pour concevoir des séquences spéci ques optimisées du point de vue de l'auto-assemblage. Une seconde validation expérimentale est entreprise et montre l'intérêt de cette approche, l'optimisation des propriétés fondamentales de stabilité et de spécifficité pour résoudre le problème de l'auto-assemblage d'objets microscopiques à partir de l'ADN.

Étude de la régulation transcriptionnelle du virus de la leucémie bovine : rôle des facteurs de transcription Sp1/Sp3 et de la méthylation de l’ADN

Thèse de doctorat : Médecine. Virologie : Université de Nantes : 2004. / Bibliogr. f. 144-172.

Thèse de doctorat : Physique : Lyon, École normale supérieure (sciences) : 2007. / Bibliogr. p. 151-156.

Thèse doctorat : Mécanique des fluides : Ecully, Ecole centrale de Lyon : 2008. / 123 références.

Thèse doctorat : Mécanique des fluides : Ecully, Ecole centrale de Lyon : 2008. / Titre provenant de l'écran-titre. 123 références.

Thèse de doctorat : Génétique cellulaire et moléculaire : Evry-Val d'Essonne : 2008. / Titre provenant de l'écran-titre.