Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2007. / Anglais ou français ; avec des résumés en anglais et en français. Bibliogr.: f. 156-157. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2007. / Bibliogr.: f. 54-68. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

En esta Memoria se informa el estudio de la interacción en solución de nuevas moléculas benzimidazólicas, 2-(o-nitrofenil)-benzimidazol (NB) y N-benzoil-2-(onitrofenil)-benzimidazol (BNB) con ADN. Para esto, se trabajó con moléculas de ADN de simple hebra (ssADN) y doble hebra (dsADN). Mediante voltamperometría de pulso diferencial sobre un electrodo de carbono vítreo se obtuvo una señal analítica para NB y BNB correspondiente a la reducción del grupo nitro presente en cada una de las estructuras estudiadas. Ambos compuestos presentaron una disminución en la intensidad de corriente en presencia de ambos tipos de ADN. Se determinó que cada molécula de ADN, ssADN o dsADN, une un mayor número de moléculas de NB que de BNB y que la constante de equilibrio del complejo formado también es mayor para el caso de NB. Al estudiar el efecto de la fuerza iónica sobre el mecanismo de interacción se pudo determinar que los compuestos interaccionan en forma electrostática con ambos tipos de ADN y que no existe una reactividad preferencial por alguna de las estructura nucléicas estudiadas. Mediante espectroscopía UV-Vis, se observó que los espectros de absorción de ambos compuestos presentan variaciones tanto en la intensidad como en el máximo de absorción en presencia de diferentes concentraciones (50 – 250 ppm) de ADN, confirmando la interacción entre las moléculas. Por otro lado, se estudió la interacción de los nitrocompuestos con ADN mediante biosensores electroquímicos. Para ello, se modificaron electrodos de carbono vítreo con nanotubos de carbono dispersos en una solución de quitosano, sobre los cuales se adsorbió finalmente dsADN (CV/CNT/ADN). La señal analítica de seguimiento fue la señal electroquímica de reducción de cada nitrocompuesto adsorbido sobre el biosensor, determinándose un tiempo óptimo de acumulación de 10 minutos. Bajo estas condiciones la respuesta del biosensor fue lineal con la concentración de nitrocompuesto en un rango de 20 a 80 µM. Finalmente al generar el biosensor con diferentes concentraciones de dsADN (20-100 ppm), se observó una rápida saturación de la superficie del electrodo para ambos compuestos. En conclusión, estas moléculas son capaces de interactuar con el ADN, lo que abre la posibilidad de causar daño a estas estructuras como mecanismo de acción farmacológico.

Magister en biomedicina celular y molecular / El síndrome de Sjögren (SS) es una enfermedad autoinmune, inflamatoria, crónica y sistémica, de etiología desconocida y afecta principalmente a glándulas salivales y lagrimales. Se ha estudiado la respuesta a proteínas mal plegadas (UPR= del inglés Unfolded protein response) en glándulas salivales labiales (GSL) de pacientes SS, evidenciando diferencias en la expresión de componentes de la vía de señalización IRE1α (Inositol-requiring enzyme 1a). En esta tesis se evaluó si los cambios de expresión de proteínas involucradas en la vía IRE1α podría deberse a cambios epigenéticos. En este contexto, se realizó el análisis de metilación global del DNA y de las regiones promotoras de genes de la vía IRE1α en GSL de pacientes SS y controles. También se estudió el efecto de citoquinas pro-inflamatorias, sobre el estado de metilación de promotores de genes de la vía IRE1α en cultivos de células de glándula submandibular humana (HSG). La metilación de los promotores se evaluó mediante PCR sensible a metilación o análisis de disociación de alta resolución sensible a metilación y la metilación global se determinó mediante inmunofluorescencia. Los resultados obtenidos mostraron un aumento significativo en la metilación de los promotores de los genes IRE1α, XBP-1 (del inglés X box-binding protein-1) y GRP78 (del inglés Glucose-Regulated Protein, 78kDa) en GSL de pacientes SS. Se observó una correlación positiva significativa del estado de metilación de los promotores mencionados con los niveles de citoquinas pro-inflamatorias (TNF-α e IFN-γ) presentes en las GSL. La metilación global del DNA en cortes de GSL de pacientes SS mostró una disminución significativa comparada con los individuos controles. La metilación global del DNA se relacionó negativamente con el score de foco. La hipometilación global del DNA de GSL de pacientes SS podría explicar la sobre-expresión de ciertos genes, como se ha demostrado en otras enfermedades autoinmunes, como LES. En células HSG tratadas con TNF-α o IFN-γ (10 ng/mL) se evidenció un aumento en el índice de metilación del promotor de GRP78 luego de 24 hrs de tratamiento, mientras que para el promotor de IRE1α se encontró un aumento en el estado de metilación luego de 48 hrs de estimulación con TNF-α (1 ng/mL). El aumento de la metilación en los promotores de los genes de IRE1α, XBP-1 y GRP78 podría explicar, en parte, los niveles disminuidos de sus respectivos mRNAs en las GSL de pacientes SS. Los análisis de correlación sugieren que las citoquinas podrían regular el estado de metilación de los tres promotores estudiados en GSL de pacientes SS. Más aún, los estudios in vitro muestran que las citoquinas pro-inflamatorias (TNF-α e IFN-γ) aumentan los niveles de metilación en los promotores de IRE1α y GRP78, resultados que validan los análisis de correlación entre los niveles de mRNAs de estas citoquinas y los índices de metilación de los promotores respectivos en GSL de pacientes SS.

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Memoria para optar al título de Químico / En esta tesis se estudió la complejación de los ligandos 6-([1,2,3]Triazolo[1,5-a]piridin-3-il)piridin-2-il)piridin-2-il)metanona (TPPM) y 3-(1H-benzimidazol-2-il)-7-(dietilamino) cromen-2-ona (C7) con 2,6 dimetil-β-ciclodextrina (DMCD); además se analizó su posible aplicación como quimiosensores fluorescentes y las interacciones de estos con ADN. Para ello se determinaron las constantes de asociación de cada complejo mediante técnicas fluorimétricas, a tres temperaturas de trabajo (25, 30 y 35º C). Con esta información se realizó el estudio de las propiedades termodinámicas de los complejos mencionados. Los resultados muestran que el proceso de formación de los complejos tanto TPPM-DMCD como C7-DMCD es espontáneo, ambos procesos son endotérmicos, y el proceso de inclusión está determinado por el factor entrópico. A ambos complejos de inclusión se les realizó el estudio frente a diferentes metales divalentes (Zn (II), Ni (II), Mg (II), Cu (II), Co (II), Cd (II), Mn (II), Ca (II) y Fe (II)). Con el complejo de inclusión C7-DMCD no hubo grandes cambios por la presencia de los diferentes metales. En cambio el complejo TPPM-DMCD frente a Zn (II) presenta un aumento de intensidad de fluorescencia de casi 10 veces, presentándose como un buen quimiosensor fluorescente. Se determinó la unión de los ligandos y complejos con ADN, mediante una titulación de ADN y posterior análisis fluorimétrico. El ligando C7 y el complejo C7-DMCD no presentaron sitios de unión o variaciones frente a ADN. Mientras que el ligando TPPM y el complejo TPPM-DMCD presentan interacción con ADN y un sólo sitio de unión, además se analizó el complejo TPPM-DMCD-Zn, el cual destacó por poseer un sólo sitio de unión y una constante de asociación de 1,2*106 M-1 / In this thesis was studied the complexation of ligands 6 - ([1,2,3] Triazolo [1,5-a] pyridin-3-yl) pyridin-2-yl) pyridin-2-yl) methanone (TPPM) and 3- (1H-benzimidazol-2-yl) -7- (diethylamino) chromen-2-one (C7) with 2,6-dimethyl-β-cyclodextrin (DMCD). The possible application of these complexes as fluorescent chemosensors and the interactions of these with DNA were also analyzed. For that, the association constants of each complex were determined by fluorimetric techniques, at three working temperatures (25, 30 and 35°C). With this information was carried out the study of the thermodynamic properties of the mentioned complexes. The results show that the formation process of the complexes both TPPM-DMCD and C7-DMCD is spontaneous, both processes are endothermic, and the inclusion process is determined by the entropic factor. Both inclusion complexes were subjected to the study of different divalent metals (Zn (II), Ni (II), Mg (II), Cu (II), Co (II), Cd (II), Mn (II), Ca (II) y Fe (II)); With the inclusion complex C7-DMCD there were no major changes in presence of different metals. In contrast, the TPPM-DMCD complex in presence of Zn, exhibits an increase in fluorescence intensity of almost 10 times, presenting as a good fluorescent chemosensor. Binding of the ligands and complexes with DNA was determined by DNA titration and subsequent fluorimetric analysis. The C7 ligand and the C7-DMCD complex did not show binding sites or variations against DNA. While the TPPM ligand and the TPPM-DMCD complex exhibit interaction with DNA and a single binding site, the TPPM-DMCD-Zn complex was also analyzed, Which stands out for having a single binding site and an association constant of 1.2*106 M-1

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / Las vacunas de ADN son una terapia alternativa altamente atractiva para combatir el cáncer. Esta estrategia consiste en la entrega in vivo de ADN plasmidial codificante de antígenos tumorales que son expresados y presentados por células dendríticas (DC) con el fin de activar linfocitos T capaces de eliminar específicamente células tumorales. Un importante paso hacia la aplicación clínica de las vacunas de ADN ha sido el uso de la electroporación in vivo, un método de entrega altamente eficiente y clínicamente aplicable, que aumenta considerablemente el ingreso de plásmidos al interior de las células. Sin embargo, la mayoría de los antígenos tumorales son antígenos propios expresados en células normales, por lo que el sistema inmune es incapaz de discriminar a los tumores como agentes potencialmente peligrosos. Es así como los esfuerzos para resolver estos inconvenientes se han enfocado, en parte, en la búsqueda y elaboración de nuevas estrategias que sean capaces de promover eficientemente la inducción de linfocitos T específicos contra estos antígenos tumorales poco inmunogénicos. El ADN usado en las vacunas puede ser reconocido por numerosos receptores de la inmunidad innata, los cuales al ser activados, señalizan a través del factor de transcripción NF-κB, induciendo la expresión de citoquinas proinflamatorias e interferones de tipo I. NF-κB es un regulador maestro de la función de las DC y de la inducción de linfocitos T mediada por vacunas de ADN, por lo tanto, el desarrollo de adyuvantes que modulen su actividad representa una estrategia interesante para promover la inducción eficiente de linfocitos T antitumorales. IκBα es uno de los principales inhibidores de NF-κB, el cual además es un gen blanco de NF-κB, por lo que actúa en un sistema de retroalimentación negativa para detener la activación de esta vía. Por otro lado, el uso de shARN que silencian la expresión de reguladores negativos de las DC ha demostrado su capacidad como adyuvantes génicos en vacunas de ADN, al inducir una respuesta inmune antitumoral más potente. Por tanto, nuestra hipótesis plantea que un shARN contra IκBα es capaz de potenciar la activación de la inmunidad innata mediada por NF-κB y, como consecuencia, la magnitud de la respuesta inmune adaptativa específica contra el antígeno tumoral codificado. En este proyecto se utilizaron plásmidos codificantes de un shARN contra IκBα como adyuvantes génicos para ser administrado junto a una vacuna de ADN que codifica para el antígeno tumoral TRP2. Se evaluó el efecto del silenciamiento de IκBα sobre la migración de las células dendríticas de la piel, particularmente sobre las células de Langerhans y sobre las células dendríticas dermales CD103+. La generación de linfocitos T específicos contra TRP2 se analizó en ratones vacunados mediante citometría de flujo y el efecto antitumoral in vivo se evaluó usando un modelo de profiláctico de melanoma metastásico y un modelo terapéutico de melanoma subcutáneo. Los resultados de este trabajo indican que la administración de ADN plásmidial en la piel incrementa la migración de células dendríticas hacia los nódulos linfáticos drenantes y que la inhibición de la expresión de IκBα con un shARN en el sitio de vacunación incrementa la migración de células dendríticas dermales CD103+ hacia el nódulo linfático drenante. Además se observó que la coadministración del shARN contra IκBα en conjunto con una vacuna de ADN dirigida contra el antígeno tumoral TRP2 potencia la generación de linfocitos T CD8 específicos e incrementa la respuesta inmune antitumoral en ensayos de metástasis pulmonar y crecimiento tumoral utilizando el modelo de melanoma murino B16F10. Dada la gran capacidad de las células dendríticas dermales CD103+ para activar linfocitos T CD8 es posible correlacionar su incremento en los nódulos linfáticos drenantes del sitio de vacunación con una mayor generación de linfocitos T CD8 específicos contra TRP2 y con un incremento en la respuesta inmune antitumoral contra melanoma cuando se coadministra el shARN contra IκBα junto con una vacuna de ADN dirigida contra el antígeno tumoral TRP2 / DNA vaccines are a highly attractive therapeutic alternative to treat cancer. This strategy consists of in vivo delivering plasmid vectors encoding tumor antigens, which are expressed and presented by dendritic cells (DC) in order to activate T cells capable of specifically eliminating tumor cells. An important step towards the clinical application of DNA vaccines has been the use of in vivo electroporation, a highly efficient delivery method that is clinically applicable and considerably increases plasmid uptake in cells. However, most of tumor antigens are self-antigens expressed by normal cells, so that the immune system is unable to recognize tumors as potentially dangerous agents. Thus, the efforts to solve these inconvenient have been focused on developing new strategies to promote the induction of T cells responses specific against such poorly immunogenic tumor antigens. DNA used for vaccines can be recognized by several innate immune receptors that, upon activation, signal through the transcription factor NF-κB which induces the expression of proinflamatory cytokines and type I interferons. NF-κB is a master regulator of both DC function and DNA vaccine-mediated induction of T cell responses, therefore the development of adjuvants that modulate NF-κB activity represents an interesting strategy to promote the efficient induction of antitumor T cell responses. IκBα is one of the major inhibitors and downstream target genes of NF-κB, therefore acting in a negative feedback loop to stop NF- κB activation. The use of shRNA silencing negative regulators of DC function has demonstrated its potential as genetic adjuvants for DNA vaccines by inducing enhanced antitumor immune responses. Hence, our hypothesis states that a shRNA targeting IκBα is able to promote the NF-κB innate immune activation and, as a consequence, the magnitude of tumor antigen-specific adaptive immune responses. In this project, plasmid-encoded shRNA targeting IκBα were generated as genetic adjuvants to be coadministrated with a DNA vaccine encoding the tumor antigen TRP2.The effect of IκBα silencing was analyzed over the migration of skin dendritic cells, particularly Langerhans cells and CD103+ dermal dendritic cells. Generation of TRP2-specific T cells was studied in vaccinated mice by flow cytometry and the in vivo antitumor effect was evaluated using prophylactic model of metastatic melanoma and a subcutaneous model of melanoma. The results obtained in this work shows that the inhibition of IκBα using a shRNA increases the migration of CD103+ dermal dendritic cells to the skin draining lymph nodes. Also the coadministration of the shRNA against IκBα and a DNA vaccine against TRP2 enhance the generation of TRP2 specific CD8 T cells increasing the antitumor immune response against melanoma. Finally due to the high ability of CD103+ dermal dendritic cells to cross-present antigens and activate CD8 T cell is possible to correlate their increase in the migration with higher levels of TRP2 specific CD8 T cells and higher antitumor immune response when the shRNA against IκBα is coadministered with a DNA vaccine against TRP2

Objetivo: Seleccionar e identificar aptámeros de ADN capaces de reconocer con alta afinidad y de forma específica péptidos de proteínas de membrana de Leishmania braziliensis. Diseño: El presente estudio es un estudio experimental in vitro que involucra las áreas de biomedicina y biotecnología debido a que se usará péptidos sintéticos para evaluar la afinidad de unión a los aptámeros seleccionados usando la plataforma ELONA.

Memoria para optar al título de Antropóloga Física / El ADN mitocondrial como marcador genético uniparental ha sido utilizado con éxito para estudiar el poblamiento, historia y orígenes de distintas poblaciones. Es dentro de este contexto, donde el estudio del poblamiento americano, y en particular el continente suramericano cobran vital importancia debido a una serie de eventos que han marcado una heterogeneidad geográfica, cultural, y una estructuración genética que es diferenciada, destacando zonas como los Andes y el Amazonas. Bajo la premisa anterior, el sector del Norte Grande de Chile dentro del contexto sur andino se convierte en un punto válido de interés de estudio, ya que evidencias arqueológicas, etnohistóricas e históricas lo vinculan fuertemente en el área circumpuneña. Desde un punto de vista genético, las investigaciones en materias moleculares en población chilena han usado el ADN mitocondrial como herramienta de estudio para caracterizar mayoritariamente a las poblaciones del centro y sur del país, a diferencia de las poblaciones del Norte Grande. En base al análisis de la región hipervariable del ADN mitocondrial de muestras de saliva de individuos provenientes de las ciudades de Antofagasta y Calama; se registró la predominancia de haplogrupos amerindios y, en particular, una alta proporción del haplogrupo B2, siendo las localidades aledañas a Calama las que muestran una mayor representación de linajes derivados de B2. La ejecución del presente estudio permitió inferir que las ciudades de la costa de la región de Antofagasta se relacionan genéticamente con otras poblaciones nativas del centro y sur del país, mientras que los pueblos aledaños a Calama son cercanos genéticamente a poblaciones nativas del norte de Chile, Noroeste de Argentina (NOA) y Andes bolivianos

L’intégrité des gènes de la famille FANC est essentielle au bon fonctionnement de la réparation des dommages à l’ADN. Récemment, différents variants d’épissage du gène FANCC ont été identifiés. Nous avons donc étudié l’impact du transcrit alternatif sur le processus de réparation des bris de l’ADN. Le transcrit FANCCΔ7 est présent dans toutes les lignées de cancer du sein analysées. L’analyse des fractions ribosomales confirma la traduction de FANCCΔ7 en protéine fonctionnelle. La protéine FANCCΔ7 semble séquestrée dans le cytoplasme des cellules HEK293T transfectées suite à un traitement à la MMC comparé à FANCC qui migre majoritairement au noyau. Nous avons démontré que les cellules déficientes infectées avec FANCCΔ7 sont bloquées en G2/M en présence de MMC. Finalement, FANCCΔ7 est incapable de mener à la monoubiquitination de FANCD2. Cette étude a permis de déterminer que le variant d’épissage FANCCΔ7 ne permet pas la réparation des pontages interbrins induits par la MMC.