Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2005-2006 / La cellule dispose de plusieurs mécanismes de réparation, nécessitant tous l'accès à l'ADN, afin de prévenir les perturbations occasionnées par l'instabilité génomique. La structure des chromosomes eucaryotes (chromatine) forme une barrière physique empêchant l'accessibilité à l'ADN et ainsi les processus biologiques nucléaires tels la transcription, réplication, recombinaison et réparation des dommages de l'ADN. Dans ce dernier processus clé, certaines activités reconfigurant la chromatine pourraient donc s'avérer essentiels en facilitant l'accès à la machinerie de réparation. / Nous avons démontré le recrutement spécifique du complexe histone acétyltransférase NuA4 par immunoprécipitation de chromatine à une cassure double brin de l'ADN, le type de dommage le plus dangereux pour la cellule. Des cinétiques ont permis de déterminer à quel moment NuA4 apparaît au site de cassure en relation avec les modifications de la chromatine environnante et de vérifier l'apparition subséquente de complexes de remodelage ATP dépendant. En parallèle, de nouveaux sites de phosphorylation d'histones qui pourraient être impliqués dans la réparation de dommages sur l'ADN ont été investigués. En conclusion, nos travaux permettent de lier fonctionnellement des complexes de modification/reconfiguration de la chromatine avec le processus de réparation de dommages à l'ADN.

Le génome eucaryote est contenu dans le noyau sous forme de chromatine, le nucléosome étant son unité de base. Le nucléosome est composé d'ADN enroulé autour d'un octamère d'histones. La chromatine permet l'empaquetage de l'ADN, mais module également diverses fonctions cellulaires telles que la transcription, la réplication et la réparation de l'ADN. Il existe différents types de dommages à l'ADN, les plus toxiques étant les cassures d'ADN double brins (DNA double-strand breaks, DSBs) qui si elles ne sont pas réparées, peuvent compromettre l'intégrité du génome. Les histones peuvent être l'objet de modifications post-traductionnelles qui sont essentielles pour réguler la chromatine. NuA4 est un complexe acétyltransférase qui a été bien décrit pour son rôle dans la transcription et la réparation de l'ADN. Au fil des années, diverses études ont montré que NuA4 acétyle les histones, cependant, de nouvelles études ont permis de mettre en évidence des cibles non-histones. Des précédentes études du laboratoire ont montrées comment NuA4 est recruté au site de dommages à l'ADN et comment il régule la réparation de l'ADN en acétylant les histones et les protéines de réparation. Dans ce travail, nous disséquons davantage le rôle de NuA4 dans la réparation des dommages à l'ADN. Ainsi, nous avons pu déterminer qu'il peut être recruté aux DSBs par un mécanisme alternatif reposant sur la protéine Lcd1ᴬᵀᴿᴵᴾ, indépendamment de Xrs2. Nous décrivons également deux nouvelles cibles acétylées par NuA4, Nej1 et Yku80, deux facteurs qui sont impliqués dans la réparation par jonctions d'extrémités non-homologue (non-homologous end-joining, NHEJ). De plus, nous avons établis qu'il existe une relation antagoniste entre NuA4 et les facteurs du NHEJ. L'acétylation de certains de ces facteurs favorise la réparation des DSBs par des voies de réparation qui reposent sur la résection des extrémités de la cassure. Cette régulation semble conservée au cours de l'évolution puisque le complexe mammifère TIP60 antagonise 53BP1 (levure Rad9) qui favorise la réparation par NHEJ et ainsi permet de réguler le choix de la voie de réparation. De plus, nous démontrons, que chez la levure, la queue N-terminale de l'histone H2A contient un site SQ qui est phosphorylé par Mec1ᴬᵀᴿ en présence de dommages à l'ADN. Nos données suggèrent que cette marque d'histone est nécessaire pour maintenir la fidélité de la résection de l'extrémité de l'ADN en modulant la liaison de Rad9⁵³ᴮᴾ¹. Nous supposons que cette phosphorylation agit de façon similaire à l'ubiquitination sur H2A chez les mammifères, mettant en évidence que des modifications d'histones différentes chez plusieurs organismes convergent pour effectuer une même fonction. Enfin, nous décrivons le rôle du domaine YEATS de la sous-unité Yaf9 partagée par les complexes SWR1 et NuA4. Nous montrons que ce domaine reconnaît la modification d'histone H3K27ac et est impliqué dans l'échange d'histone Htz1ᴴ²ᴬ·ᶻ. Ainsi cette modification est impliquée dans la régulation de la transcription et de la réparation des dommages à l'ADN. Dans l'ensemble, les résultats présentés dans cette thèse ajoutent des contributions importantes aux connaissances actuelles qui permettront de mieux comprendre le rôle de NuA4 et des modifications d'histones dans la réparation des dommages à l'ADN et dans le maintien de l'intégrité du génome. / The eukaryotic genome is packed in the nucleus in the form of chromatin, with the nucleosome being its basic unit. The nucleosome is composed of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Chromatin not only helps in the packing of DNA but also modulates various cellular functions such as transcription, replication and DNA repair. DNA damage manifests in various forms with DNA double-strand breaks (DSBs) being the most toxic which, if unrepaired, compromises genome integrity. Histones are decorated by various post-translational modifications that are essential for fine-tuning and regulation of chromatin. NuA4 is an acetyltransferase complex which has been well described for its role in transcription and DNA repair. Over the years, various studies have shown that NuA4 acts through acetylation of histones, however, new studies have highlighted non-histone targets. Our previous studies have shown how NuA4 is recruited to the site of DNA damage and how it regulates DNA repair by acetylating histones and repair proteins. Here we further dissect the role of NuA4 in DNA repair and found that it can be recruited to DSBs by an alternative mechanism relying on Lcd1ᴬᵀᴿᴵᴾ, independently of Xrs2. We also describe two new targets of NuA4 acetyltransferase activity, Nej1 and Yku80, both factors involved in repair by non-homologous end-joining (NHEJ). In fact, we observe an antagonistic relationship between NuA4 and NHEJ factors, with acetylation of the latter favouring repair of DSBs by resection-based pathways. This regulation seems evolutionary conserved with the mammalian TIP60complex antagonising pro-NHEJ factor 53BP1 (yeast Rad9) to govern the choice of repair pathway. In line with this, we further show that yeast histone H2A N-terminal tail harbours an SQ-site which is phosphorylated by Mec1ᴬᵀᴿ upon DNA damage. Our data suggests this histone mark is required to maintain the fidelity of DNA end resection by modulating the binding of Rad9⁵³ᴮᴾ¹. We speculate that this phosphorylation acts similarly to ubiquitination of mammalian H2A tail, highlighting different histone modifications across organisms converging to achieve a similar function. Lastly, we describe the role of the YEATS domain found in the Yaf9 subunit shared by SWR1 and NuA4 complexes. We show that this domain recognizes H3K27ac and is involved in histone Htz1ᴴ²ᴬ·ᶻ exchange, thus implicating it in transcription and DNA repair. Al together, the results presented in this thesis make important contributions to better understand the intricate roles played by NuA4 and histone modifications in the repair of DNA to maintain genome integrity.

Le génome mitochondrial montre une grande variabilité de taille et de contenu génique chez les plantes vertes. Près d'une dizaine de génomes mitochondriaux de chlorophytes ont été complètement séquences, incluant le génome de la trebouxiophyte Prototheca wickerhamii. Cette algue est la seule trebouxiophyte qui a été examinée jusqu'à maintenant; puisqu'elle est non-photosynthétique, l'architecture de son génome mitochondrial pourrait ne pas être représentative de la classe Trebouxiophyceae. C'est pour ces raisons que nous avons entrepris le séquençage du génome mitochondrial de Leptosira terrestris, une autre trebouxiophyte. Ce génome, dont la séquence a été déterminée par la méthode shotgun, possède une taille de 111124 pb. Il contient 57 gènes, dont 27 codant pour des ARN de transfert. Dix-huit introns ont été trouvés, faisant de Leptosira l'algue qui possède le plus d'introns au niveau de son génome mitochondrial. Les données phylogénétiques recueillies placent Leptosira comme un intermédiaire chez les trebouxiophytes.

Seminario de Título entregado a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al Título de Bióloga con mención medio ambiente. / Conocer la composición y riqueza de especies que componen un ecosistema dado es uno de los factores más relevantes al realizar estudios de biodiversidad, tanto como para satisfacer los requerimientos legales, como por su valor intrínseco, único e incalculable. Los estudios que contienen información sobre la riqueza y composición íctica en ecosistemas acuáticos continentales se realizan habitualmente con un equipo de pesca eléctrica que deja inconsciente a los peces y estos se pueden capturar e identificar, metodología sesgada por el esfuerzo de muestreo, abundancia y tamaño corporal de los peces, además de ser potencialmente mortal. En los últimos años, se ha usado el ADN extraído desde una muestra ambiental de agua para detectar la presencia de macroorganismos en sistemas acuáticos (e.g. peces, anfibios, macroinvertebrados). Utilizando herramientas de genómica comunitaria, se realiza la técnica de metabarcoding en muestras de ADN ambiental, que consiste en amplificar mediante PCR una porción específica del ADN comunitario usando partidores universales, para secuenciar de forma masiva con tecnologías de próxima generación (Next Generation Sequencing, NGS). En este estudio se evaluó la riqueza y composición íctica en dos ecosistemas lénticos del altiplano chileno y en seis puntos lo largo de la cuenca del Río Maipo realizando metabarcoding del gen COI (Citocromo Oxidasa I) en muestras de ADN ambiental y se comparó lo obtenido con la metodología estándar de pesca eléctrica. Además, se evaluó el desempeño de estas metodologías al comparar la riqueza y composición esperada con información de capturas históricas y recientes. Los resultados mostraron que el metabarcoding de ADN ambiental es una herramienta altamente sensible al detectar igual o mayor riqueza que lo obtenido con pesca eléctrica y detectando los taxa esperados en los ecosistemas estudiados. Un aspecto relevante es que se pudo (i) identificar y diferenciar las especies cripticas Trichomycterus areolatus y Trichomycterus maculatus, (ii) detectar al bagre Nematogenis inermis (EN) y (iii) detectar a especies exóticas invasoras tales como Salmo trutta y Oncorhynchus mykiss. Estos resultados sugieren que el metabarcoding de ADN ambiental es una herramienta con el potencial de aumentar la tasa de detección de especies raras, cripticas, en baja abundancia y/o exóticas en ecosistemas acuáticos continentales de Chile, pudiendo ser en el futuro un elemento importante para el monitoreo de la diversidad con bajo impacto. / Knowing species composition and richness of an ecosystem is one of the key issues in biodiversity studies, to satisfy legal requirements and due to its intrinsic, unique and incalculable value. Studies that contain information about fish species composition and richness in freshwater environments are usually made using an electrofishing equipment. This technique paralyzes fish, and afterwards they can be captured and identified. Unfortunately, this method is biased by sampling effort, body size and abundance, and can be life threatening for fish. In recent years, DNA extracted from an environmental sample of water has been used to detect the presence of macroorganisms in aquatic systems (e.g. fish, amphibians and macroinvertebrates). Using a community genomic approach with environmental DNA (eDNA), the metabarcoding technique consists in amplify a small portion of community DNA through conventional PCR using universal primers, and then sequencing the PCR product using next-generation sequencing technologies (NGS). After a series of computational steps, the identity and taxonomy of each sequence within samples can be known. In this study, fish richness and composition was evaluated with metabarcoding of the gen COI (cytochrome c oxidase subunit I) in two lentic ecosystems of the Chilean Altiplano and from six sites along the Maipo river basin. Number of species obtained through metabarcoding was compared to what was obtained using electro-fishing. Additionally, performance of these methodologies was evaluated by comparing observed with expected richness and composition, as reviewed by data gathered through historical and recent fish survey. Results showed that eDNA metabarcoding is a highly sensitive tool that detects equal or greater species richness than electrofishing, and all expected taxa were identified in the ecosystems studied. It is noteworthy to mention that (i) the cryptic species Trichomycterus areolatus and Trichomycterus maculatus could be identified and differentiated, (ii) the catfish Nematogenis inermis (EN) and (iii) the invasive alien species such as Salmo trutta and Oncorhynchus mykiss could be also detect. These results suggest that environmental DNA metabarcoding is a promising tool with potential to increase detection rates of rare, cryptic, low abundance and exotic species in freshwater ecosystems in Chile, which could be, in the near future, an important element for monitoring diversity with low impact. / Diciembre 2020

Thèse de doctorat : Chimie organique et macromoléculaire : Lille 1 : 2003. / N° d'ordre (Lille) : 3311. Résumé en français et en anglais. Bibliogr. p. 231-240.

Ingeniero Civil Químico / El presente trabajo tiene como objetivo principal, idear e implementar un algoritmo para guiar el diseño de proteínas recombinantes. Para lo anterior se recopiló y conformó una base de datos de uso de codones y abundancia de ARNt para un variado grupo de organismos, que incluyó eucariontes y procariontes. El algoritmo opera sobre una secuencia de ADN codificante, de manera que: identifica, analiza cuantitativa y cualitativamente, sugiere mutaciones de acuerdo a las bases de datos designadas automática o manualmente, analiza el plegamiento del ARNm, posibilita la disminución de la estabilidad de estructuras secundarias y permite la visualización gráfica del plegamiento. El algoritmo de mutación trabaja bajo el criterio que el sesgo en el uso de codones refleja la selección para la optimización del proceso de traducción guiado por la abundancia de ARNt. El algoritmo está diseñado para maximizar la expresión recombinante de la proteína codificada sin cambiar su secuencia de aminoácidos. Las mutaciones sugeridas son específicas para cada gen y para cada organismo hospedero en donde dicho gen se desea expresar. La principal tarea y mayor desafío del presente trabajo fue trascender los mecanismos de evolución y los inconvenientes asociados a la producción de proteínas recombinantes. Esto se realizó mediante la información y evaluación de resultados experimentales de diversas investigaciones focalizadas a la genética molecular. De este modo, se logró complementar estudios desarrollados en: el uso de codones, abundancia de ARNt, baja eficiencia de traducción en los primeros ~30-50 codones del ARNm, apareamiento de codones sinónimos en el ARNm, uso de codones mayoritarios y formación de estructuras secundarias en el ARNm. Estas características de presencia transversal en la biología celular, se utilizaron como base en el diseño e implementación de la presente herramienta bioinformática, para el análisis de secuencias codificantes de ADN y mutación sinónima en el proceso de optimización de la expresión de proteínas recombinantes.

Varios microsatélites inestables se caracterizan por la presencia de nucleótidos de citosinas en sus unidades de repetición; adoptan estructuras de DNA alternativas a la convencional y en algunos casos, involucran procesos de metilación. El genotipado de tripletes por PCR convencional se fundamenta en la denaturación del DNA y posterior amplificación del triplete repetido. Sin embargo, debido las estructuras alternativas que adoptan estos microsatélites, las reacciones de denaturación y amplificación son ineficientes. En este trabajo desarrollo una alternativa de diagnóstico por PCR para secuencias ricas en citosinas (metiladas y no metiladas) basada en modificación nucleotídica. Previo consentimiento se modificó el gen del retardo mental ligado al fragilidad del cromosoma X tipo 1,cuya siglas en ingles es FMR1(Fragile X Mental Retardation 1) de ocho individuos normales (cuatro mujeres y cuatro varones) empleando bisulfito de sodio, cambiando las citosinas en uracilo. Posteriormente, con el uso de bioinformática, se realizó:1) La simulación de las estructuras alternativas que adopta el microsatélite inestable contenido en la región 5’-UTR del gen. 2) Luego de la ubicación de las islas CpG, se generaron cebadores específicos que hibriden con el microsatélite modificado (Primer T) y cebadores específicos que hibriden con una secuencia modificada del gen FMR1 que contiene las islas CpG (Primer M). Finalmente, ambas secuencias fueron amplificadas por PCR convencional. La modificación del DNA fue evidenciada por espectrofotometría al uracilo, luego de tratamiento químico con bisulfito de sodio. La estructura que fue evidenciada por métodos bioinformaticos fue la estructura llamada hairpins (Horquillas). Se encontraron dos potenciales islas CpG en la región estudiada. La amplificación con los cebadores T confirmó el diseño in silico desarrollado para abordar la estructura en hairpins y el efecto que ejerce la modificación sobre este tipo de estructura. La amplificación con los cebadores M permitió detectar metilación de la primera isla CpG del gen FMR1 en el cromosoma x inactivo. En conclusión se desarrolló un método alternativo para amplificación de secuencias de microsatélite en rango normal, que contengan citosinas metiladas y no metiladas, que permite la amplificación mediante PCR. Se requieren estudios posteriores con muestras de DNA que contengan microsatélites anormalmente expandidos (metilados y no metilados) para validar su aplicación clínica diagnóstica. -- Palabras clave: metilación, modificación nucleotídica, tripletes repetidos / -- Many unstable microsatellites are characterized by presenting cytosine nucleotides in their repeat units, adopting alternative DNA structures and, in some cases, are involved in methylation processes. Triplet sequences genotyping by PCR methodology is based on DNA denaturation and amplification of the unstable microsatellite. However, due to alternative structures adopted by microsatellites, denaturation and amplification processes are inefficient. This thesis developed an alternative PCR genotyping method for cytosine rich sequences (methylated and unmethylated) based on nucleotide modification. After appropriate informed consent, the FMR1 gene from 8 healthy subjects (four male and four female) was modified with sodium bisulfite. Subsequently, using bioinformatics tools, we performed: 1) simulation of alternative structures of the unstable microsatellite in the 5’-UTR region of the gene. 2) After localization of the CpG islands, we generated specific primers which hybridize with the modified microsatellite (Primers T) and specific primers that hybridize to a new sequence of the FMR1 gene containing CpG islands (Primers M). Finally, both of these sequences were amplified by PCR. Modified DNA was obtained after chemical treatment with sodium bisulfite. Alternative structures of the sequence of the microsatellite were characterized. CpG islands of the gene, that can be methylated, were identified. Amplification confirmed expected results obtained previously by bioinformatics analysis. The T primers amplified the modified microsatellite of the FMR1 gene. The M primers amplified the modified sequence containing the CpG Island of the gene. In conclusion, we developed a potential alternative genotyping method for amplification of microsatellite sequences carrying methylated and unmethylated cytosine Further studies are needed in DNA samples from individual with abnormally expanded microsatellites both methylated and unmethylated to validate clinical application. -- Key words: methylation, nucleotide modification, triplet repeats

Diez microsatélites para alpacas y llamas fueron usados para evaluar parentesco en 47 alpacas registradas de la Estación Experimental IVITA - Maranganí, provenientes de la provincia de Canchis (Cusco - Perú). El análisis se llevo a cabo utilizando dos metodologías: secuenciador automático (ABI 377 DNA sequencersâ) y técnica de tinción con nitrato de plata. Los microsatélites fueron amplificados en tres reacciones de PCR múltiple y diez reacciones de PCR simple. Los 10 microsatélites fueron polimórficos para ambas metodologías. El número de alelos vario entre 4 y 20, las frecuencias alélicas y probabilidad de exclusión (PE) fueron calculadas utilizando el software Cervus 2.0. Todos los loci, a excepción de dos, se encontraron dentro de los rangos publicados por Lang et al. (1996) y Penedo et al. (1998). La probabilidad de exclusión acumulada para los 10 loci de 0.9999. La probabilidad de exclusión acumulada para cada reacción de PCR múltiple fue mayor a 0.90. Ambas metodologías obtuvieron los mismos resultados. Los resultados confirmaron la paternidad en 17 casos, sin embargo, en más de un 22% de los casos, padres alternativos fueron identificados como padres comparando con los registros. / Ten microsatellites for alpacas and llamas were used to evaluate paternity in 47 alpacas registered at IVITA Research Station Maranganí, Canchis Province (Cusco – Perú). Analysis was carried out using both methodologies: Automatic Sequencer (ABI 377 DNA sequencersâ) and silver staining techniques. Microsatellites were amplified in three multiplex reactions and ten single PCR reactions. They were polymorphic for all alpaca samples using both methodologies. The number of alleles varied between 4 and 20, the allelic frequencies and the exclusion probability were calculated using Cervus 2.0. All loci, except for two, were within the range published by Lang et al. (1996) and Penedo et al. (1998). The accumulated exclusion probability for the ten loci was 0.9999. For each multiplex reaction the accumulated exclusion probability was more than 0.90. Both methodologies yielded the same results. It was possible obtain the same results using both methodologies. The results confirmed paternity in 17 cases of parent-offspring pairs, however in a further 22% of cases alternative adults were identified as parents compared with the register.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Memoria para optar al título de Bioquímico / La enfermedad neurológica conocida como Paraparesia Espástica Tropical, mielopatía asociada al HTLV-I (TSP/HAM) se caracteriza por la degeneración axonal de los haces córtico-espinales. Aunque no se conoce mucho como el HTLV-I afecta selectivamente a los axones más largos del sistema nervioso central (SNC), es la proteína viral Tax secretada desde los linfocitos T-CD4+ el principal candidato por su actividad estimuladora de factores transcripcionales a través de varias vías de señalización. Esta proteína, se encuentra presente en forma crónica en el líquido cefalorraquídeo (LCR), pudiendo alterar el transporte axonal actuando extracelularmente, siendo afectados principalmente los axones más largos por su mayor vulnerabilidad. Estudios in vitro de la proteína Tax muestran que se une a varias proteínas celulares que regulan vías relacionadas con la transcripción y el citoesqueleto, incluyendo fosfatasas y quinasas, por lo que se sugiere que en esta patogenia podría haber un desbalance en el nivel de fosforilación/desfosforilación de las proteínas del citoesqueleto. Se han propuesto como biomarcadores de varias enfermedades neurodegenerativas los niveles de Tau total y/o fosfo-Tau en el LCR. Por lo tanto, los objetivos de esta investigación fueron comparar la fosforilación de Tau presente en el LCR de pacientes con TSP/HAM y sujetos controles, a fin de aclarar si estas proteínas están involucradas en la patogenia de esta enfermedad, y aislar la proteína Tau desde el LCR para posteriores estudios de proteómica de sus fosfoformas. Los niveles de Tau en el LCR y la evaluación del patrón molecular de fosforilación de residuos específicos como Tre181, Ser199, Tre205, Tre231, Ser262, Ser356, Ser396, Ser404 y Ser422 fue realizada por “immunowestern blot” utilizando anticuerpos policlonales monoespecíficos. Con todos los anticuerpos ensayados se observó la presencia de una banda principal de 52 kDa. Los niveles de Tau en el LCR de los TSP/HAM no fueron significativamente distintos de los de controles, y aunque no fue significativamente diferente (p = 0,06), se podría sugerir sólo una anormal hiperfosforilación de Tre181. Si se confirmara este mayor nivel fosforilación en Tre181 trabajando con un número mayor de pacientes o utilizando otros métodos más confiables, sugeriría un aumento en la actividad o una sobre-expresión de dos quinasas dirigidas a Ser/Tre-Pro, GSK3-α y β, Cdk5. Una caracterización completa de la fosforilación de los distintos residuos de Tau en el LCR de los controles y pacientes con TSP/HAM requirió la aplicación adicional de la técnica analítica de Espectrometría de Masas (MS). Por lo tanto, se trató de aislar Tau desde LCR utilizando una columna de afinidad por fosfopéptidos de Ga(III), y dos métodos de inmunoprecipitación, uno usando proteínas A/G acopladas a agarosa y una segunda con unión covalente de los anticuerpos (“Sepharose” activada con CNBr). Ni la columna de Ga(III) ni el primer método de inmunoprecipitación fueron adecuados para posterior análisis por MS. Después de demostrar por SDS/PAGE que el método que usaba los anticuerpos unidos covalentemente mostraba una banda principal de 52 kDa, se eluyó la proteína del gel, tripsinizó y analizó por MS MALDI-TOF. Se observó la posible presencia de proteínas asociadas al citoesqueleto que podrían haber coinmunoprecipitados con Tau. Estos resultados no fueron confirmatorios por el bajo “score” observado. En conclusión, dos de los resultados muestran diferencias entre TSP/HAM y varias enfermedades neurodegenerativas: el no aumento en los niveles de Tau total, y la posible hiperfosforilación de sólo Tre181. Fue importante lograr aislar Tau desde el LCR para futuros estudios de MS / The neurological disorder known as tropical spastic paraparesis / HTLV-I-associated myelopathy (TSP/HAM) is characterized by axonal degeneration of the cortico-spinal tracts. Although the selectivity of HTLV-I towards the longest axons of the central nervous system (CNS) is not fully understood, the main candidate is the secreted viral protein Tax from lymphocytes T-CD4+ that shows a stimulatory activity of transcriptional factors acting through several signaling pathways is the main candidate. This protein, chronically present in CSF, could extracellularly alter axonal transport. The longest axons are mainly affected because they are more vulnerable. In vitro studies on Tax protein have shown the binding of this protein to many cellular proteins that regulate transcription and cytoskeleton related pathways including phosphatases and kinases, therefore an imbalance in the level of cytoskeleton phosphorylated/unphosphorylated proteins could be involved in this pathogeny. Levels of total Tau and/or phospho-Tau in the CSF have been proposed as biomarkers of various neurodegenerative diseases. Hence, the aims of this investigation were to compare Tau phosphorylation present in CSF of TSP/HAM patients and control subjects, to elucidate if these proteins are involved in the pathogeny of this disease, and to isolate Tau protein from CSF for further proteomic studies of its phosphoforms. Levels of Tau in CSF and evaluation of the molecular pattern of phosphorylation of selected residues such as Thr181, Ser199, Thr205, Thr231, Ser262, Ser356, Ser396, Ser404 and Ser422 were performed by immunowestern blot, using monospecific polyclonal antibodies. With all the antibodies tested we observed a main band with 52 kDa. The CSF levels of Tau in TSP/HAM were not significantly different from those of controls. Only an abnormal hyperphosphorylation on Thr181, although it was not significantly different (p = 0.06), could be suggested in TSP/HAM patients. If a high phosphorylation level in Thr181 is confirmed by working with a larger number of patients or other more reliable methods, it would suggest an increase in activity or over-expression of two Ser/Thr-pro-directed kinases GSK3-α and β, and Cdk5. A complete characterization of Tau phosphorylation sites in CSF from control and TSP/HAM patients required the use of the additional analytical technique of Mass Spectrometry (MS). Therefore, we tried to isolate Tau from CSF samples using the phosphopeptide affinity column with Ga(III), and two immunoprecipitation methods, one using protein A/G-coupled agarose beads and a second one with covalently bound antibodies (Sepharose activated with CNBr). Neither the Ga(III) column nor the first immunoprecipitation method were adequated for MS analysis. After demonstrating by SDS/PAGE that the method that used covalently bound antibodies showed a main band of 52 kDa, the sample was eluted, trypsinized and analyzed in a Mass Spectrometer MALDITOF. This preliminary study suggested the presence of Tau and of some other cytoskeleton associated proteins that could have been coimmunoprecipited with Tau. The low “score” obtained did not allow reach confirmatory results. In conclusions, two of the results showed differences with various neurodegenerative diseases: lack of changes in Tau levels in CSF, and possible hyperphosphorylation of only threonine 181. It was important to have been able to isolate a Tau form from CSF for further studies of MS