L’anémie de Fanconi (AF) est une maladie récessive rare associée à un défaut dans la voie de réparation des cassures double-brin de l’ADN causées par des agents pontants (voie de l’AF). Ces agents pontant l’ADN créent un lien covalent entre les deux brins et bloquent les polymérases lors de la réplication ou de la transcription. Mon projet s’intéresse à une protéine importante de la voie de l’AF : FANCI. Celle-ci est décrite comme agissant de pair avec la protéine FANCD2 pour recruter la machinerie de réparation de l’ADN. Nous posons l’hypothèse que FANCI a un rôle important lors du développement, lors de la méiose et est impliquée dans la résistance des cellules aux aldéhydes. Suite à la création d’un modèle murin déplété en FANCI, nous avons effectué des essais comportementaux de mémoire ou d’anxiété pour caractériser le modèle plus en profondeur. Ensuite, des résultats de coupes histologiques de gonades ont mené à la confirmation de la stérilité des souris KO. Plus spécifiquement, un étalage de chromosomes méiotiques et une immunofluorescence ont été effectués pour vérifier la localisation de FANCI sur ces derniers. De plus, le traitement à la mitomycine C (agent pontant) de cellules embryoniques conférant une instabilité génomique, nous avons voulu tester l’effet d’une source endogène, les aldéhydes, sur des cellules déplétées en FANCI. Nous avons observé les foyers des protéines 53BP1 et γ-H2AX pour vérifier l’accumulation de cassures double-brin. Les essais comportementaux montrent une tendance non significative. Une co-localisation de FANCI avec le marqueur de résection RPA est observée. De plus, la déplétion de FANCI rend les cellules résistantes aux aldéhydes. Les foyers 53BP1 et γ-H2AX montrent qu’une petite population de ces mêmes cellules a un nombre très élevé de dommages à l’ADN alors que d’autres ont un niveau de dommages similaire au contrôle. / Fanconi anemia (FA) is a rare recessive disease associated with a defect in the pathway of DNA double strand breaks repair (FA pathway). These double stranded breaks are caused by crosslinking agents by creating a covalent bond between the two opposite strands and blocking polymerases during DNA replication or transcription. My project’s principal interest is a major protein it this pathway : the FANCI protein. It is described as acting together with FANCD2 protein to recruit DNA repair machinery. We hypothesised that FANCI has an important role in development, in meiosis and that it is implicated in cells’ aldehydes resistance. After the creation of a mouse model depleted in FANCI, with did anxiety and memory behavior tests to deeply characterize our mouse model. Also, results of gonad histologic cuts confirmed mouse sterility. More specifically, we did a meiotic spread and immunofluorescence to see FANCI on meiotic chromosomes. We also treated embryonic fibroblasts with mitomycin C, an exogenous crosslinking agent, and then wanted to check with an endogenous source, like aldehydes, on FANCI depleted human cells. We also observed 53BP1 and γ-H2AX foci formation to check for double strand break accumulation. Behavior tests do not show any significative tendancy. We observe a colocalization between FANCI and the resection marker RPA. Moreover, FANCI depletion gives an aldehyde resistance to cells. 53BP1 and γ-H2AX foci show a population of cells with a very high level of foci and others that have the same amount of foci as the control cells.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2007-2008. / Le complexe MRN (MRE11-RAD50-NBS1) est essentiel au maintien de la stabilité du génome chez les eucaryotes supérieurs. Il a été démontré que la sous-unité MRE11 du complexe MRN, qui possède une activité nucléase nécessaire aux mécanismes de réparation des cassures double-brin (CDBs). est méthylée sur les arginines de façon asymétrique. Cette méthylation est effectuée par la protéine PRMT1 et survient sur les arginines du motif GAR (Glycine-Arginine Rich) de la protéine MRE11. Cet événement arrive apparemment avant l'incorporation de MRE11 dans le complexe MRN. Le motif GAR de MRE11 influence la relocalisation in vivo de MRN en réponse aux CDBs. en plus d'affecter la réponse de signalisation des CDBs. De plus, une analyse des mutants ponctuels sur les arginines du motif GAR de MRE11 montre que ces arginines normalement méthylées influencent l'activité nucléase de MRE11 in vitro. Finalement, nous montrons que le domaine GAR de MRE11 permet la liaison de la protéine SMN par son domaine tudor, in vivo et in vitro. Cette interaction suggère la participation de SMN au niveau de la réparation des CDBs, ce qui est supporté par la sensibilité aux CDBs des cellules mutantes pour le gène smnl. Nos résultats démontrent, pour la première fois, une implication possible de SMN dans la réparation de l'ADN.

Introduction : Les patients atteints de la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC) ont une dysfonction importante au niveau des muscles locomoteurs caractérisés, entre autres, par de la faiblesse, de l’atrophie et des dommages oxydatifs. Certains auteurs ont également suggéré que la fonction mitochondriale soit altérée dans la MPOC, possiblement en lien avec le tabagisme. Objectifs : Évaluer la fonction et le nombre de mitochondries, ainsi que les dommages à l’ADN chez les sujets atteints de la MPOC et déterminer les effets du tabagisme sur les mitochondries et la qualité du muscle, indépendamment de la maladie. Méthodes/Résultats : Nous avons recruté 22 patients atteints de la MPOC et 23 sujets témoins. Tous sont ex-fumeurs et sédentaires. Une biopsie du quadriceps a été effectuée. Nous avons démontré que les sujets atteints de la MPOC ont une plus grande proportion de fibres dont le complexe IV de la chaine de transport des électrons ne fonctionne pas comparativement aux sujets témoins (p=0,032). Ils ont également une diminution de l’expression de la protéine SDHB (succinate dehydrogenase complexe iron sulfur subunit B) (complexe II) comparativement aux sujets témoins (p=0,002), mais celle de la protéine COX4 (cytochrome c oxidase subunit 4) (complexe IV) est similaire entre les deux groupes (p=0,076). Il n’y a pas de différence entre les deux groupes pour la présence de la délétion commune, la quantité de mitochondries, l’expression protéique de MFN1 (mitofusin-1), MFN2 (mitofusin-2), TFAM (mitochondrial transcription factor A) et Mn-SOD (manganese-dependent superoxide dismutase) et la quantité de 8-OHdG (8-hydroxy-2’- deoxyguanosine) présente dans l’ADN. Il y a une corrélation entre l’exposition cumulative au tabac (nombre de paquets-année) et la quantité de 8-OHdG (p=0,026), la proportion de fibres déficientes en COX (p=0,002), l’atténuation musculaire moyenne (p=0,041) et l’atténuation du muscle normal (p=0,020) lorsque tous les sujets (témoins et MPOC) sont regroupés. Conclusion : Nous avons démontré qu’il y a des anomalies de la fonction mitochondriale dans la MPOC. Il est intéressant de noter que le tabac affecte la fonction des mitochondries et la qualité du muscle de façon indépendante à la MPOC. / Rationale : Patients with chronic obstructive pulmonary disease (COPD) demonstrate a locomotor muscle dysfunction characterized by weakness, atrophy and poor oxidative capacity. Some authors also suggested that the mitochondrial function might be altered in this disease, possibly linked with smoking. Objectives : To evaluate the function and the number of mitochondria, and DNA damage in patients with COPD and to determine the effects of smoking on the mitochondria and the quality of the muscle, independently of the disease. Methods/Results : We recruited 22 patients with COPD and 23 healthy subjects. All were exsmokers and sedentary. A biopsy of the quadriceps was performed. We demonstrated that patients with COPD had a larger proportion of COX (cytochrome c oxidase)-deficient fibers than healthy subjects (p=0.032). They also had a decreased expression of the protein SDHB (succinate dehydrogenase complex iron sulfur subunit B) (complex II) compared to controls (p=0.002), but no change in the expression of the protein COX4 (cytochrome c oxidase subunit 4) (complex IV) (p=0.076). There was also no difference between the two groups for the common deletion, the quantity of mitochondria, the protein expression of MFN1 (mitofusin-1), MFN2 (mitofusin-2), TFAM (mitochondrial transcription factor A) and Mn-SOD (manganese-dependent superoxide dismutase) and the quantity of 8-OHdG (8- hydroxy-2’-deoxyguanosine) in the DNA. There was a correlation between the cumulative smoking exposure (pack-year) and the quantity of 8-OHdG (p=0.026), proportion of COX-deficient fibers (p=0.002), mean muscle attenuation (p=0.041) and attenuation of the normal muscle (p=0.020) when all subjects (healthy and COPD) were regrouped. Conclusion : We demonstrated evidences of mitochondrial dysfunction in COPD. Interestingly, there was an effect of smoking on the mitochondria and the quality of the muscle, independently of COPD.

L’activation de la poly(ADP-ribose) polymérase-1 (PARP-1) en réponse aux dommages à l’ADN est impliquée dans diverses réponses cellulaires, de la réparation de l’ADN à la mort cellulaire. Dans l'annexe I, nous avons décrit différentes techniques indispensables pour détecter le métabolisme de PARP-1 en réponse aux dommages à l’ADN in vitro et in vivo. Les travaux de cette thèse se concentrent sur le rôle de PARP-1 dans la mort cellulaire. PARP-1 est clivée et inactivée par des caspases pendant l’apoptose ; j’ai donc utilisé une PARP-1 non-clivable pour étudier le rôle de l’activation et de la fragmentation de PARP-1 dans la mort cellulaire induite par les UVB. Nous avons observé que, contrairement aux fibroblastes de peau humaine exprimant la PARP-1, les fibroblastes avec un "knockdown" de PARP-1 sont résistants à l’apoptose induite par les UVB, phénotype pouvant être totalement inversé par ré-expression de PARP-1 sauvage mais pas de PARP-1 non-clivable par les caspases, suggérant un rôle significatif du clivage de PARP-1 en réponse à la mort cellulaire induite par les UVB (chapitre 2). Dans ce contexte, nous avons récemment passé en revue comment les substrats non clivables par des caspases peuvent être utilisés comme outil important pour démystifier le rôle de ce clivage pour la mort comme pour la vie, avec l’exemple spécifique de PARP-1 non-clivable par les caspases (chapitre 3). Curieusement, en utilisant l’ARNi comme outil d’étude du rôle de PARP-1 dans la mort cellulaire, nous avons observé que l’ARNi stable (shRNA) de nombreux gènes, incluant PARP-1, échoue lors de l’apoptose, en raison de l’inactivation catalytique par clivage par une caspase de l’endoribonucléase Dicer-1, indispensable pour la régulation de l’ARNi et des miARN (chapitre 4). Cependant, nous avons découvert que l’ARNi transitoire persiste plusieurs jours même après induction de l’apoptose, soulignant des différences entre les ARNi stable et transitoire dans la dynamique de "knockdown" génétique et dans la dépendance de la fonction de Dicer-1 (chapitre 5). En résumé, mon travail a permis la découverte des avantages et des limites de l’ARNi durant l’apoptose et le rôle de PARP-1 dans la mort cellulaire induite par les UVB.

Les dommages à l'ADN induits par les rayons ultraviolets B (UV) solaires jouent un rôle important dans les cancers de la peau induits par les rayons solaires. Le travail présenté dans cette thèse examine le rôle de l'enzyme nucléaire poly (ADP-ribose) polymérase-1 (PARP-1) dans les réponses cellulaires suite aux dommages à l'ADN induits par les UV. Premièrement, nous avons examiné le mécanisme précis d'activation de la PARP-1 en réponse aux UV. En utilisant des techniques d'irradiation locale d'UV, d'immunocytochimie et d'immunoprécipitation de la chromatine, nous avons démontré que PARP-1 est activée de deux façons distinctes en réponse à deux types de dommages à l'ADN causés par les UV, i.e., les photo-lésions directes et les dommages oxydatifs. Ces deux types de dommages à l'ADN sont réparés par les voies de réparation par excision de nucléotides (NER) et par excision de bases (BER), respectivement. Depuis que le rôle de PARP-1 est bien connu dans le BER, nous nous sommes concentrés à examiner si la PARP pouvait jouer un rôle dans NER en faisant une déplétion stable de la PARP à l'aide de l'ARN interférence (ARNi) dans des fibroblastes de peau humaine qui étaient compétents dans NER ou déficients dans l'étape de reconnaissance des lésions du NER. En utilisant la technique de «host cell réactivation» (HCR), nous avons observé que les cellules déficientes en PARP-1 étaient inefficaces dans l'étape de la reconnaissance des lésions du NER. Durant l'exploration du rôle de PARP-1 dans l'apoptose induite par les UV, nous avons découvert que l'ARNi arrêtait durant l'apoptose. Nous avons trouvé que Dicer, un endonucléase de la famille RNaselII et un élément critique dans la régulation de l'ARNi, était clivé par la caspase-3 durant l'apoptose, ce qui amenait l'inactivation de ses fonctions catalytiques et l'abrogation de l'ARNi. En résumé, cette thèse élucide un important rôle de PARP-1 dans les réponses cellulaires aux UV. De plus, la découverte imprévue de 1' abrogation de l'ARNi durant l'apoptose présente de nouveaux défis dans les domaines relatifs à l'ARNi. / The DNA damages induced by solar ultraviolet B radiation (UV) play an important role in sunlight-induced skin cancers. The work presented in this thesis examines role of a nuclear enzyme, poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) in cellular responses to UVinduced DNA damage. PARP-1 is known to be activated in response to different types of DNA damages, and its activation is known to participate in different cellular responses ranging from DNA repair to cell death. To understand the mechanism of activation of PARP-1 in UV-irradiated cells, we used elegant techniques of local UV irradiation, immunocytochemistry and chromatin immunoprecipitation to demonstrate that PARP-1 is activated in two distinct phases in response to two different types of DNA damage caused by UV, i.e., direct photolesions and oxidative DNA damage. These two types of UVinduced DNA lesions are repaired by nucleotide excision repair (NER) and base excision repair (BER) pathways, respectively. Since PARP-1's role in BER is well-known, we focused on examining whether PARP could play a role in NER by stably depleting PARP-1 using DNA vector-based RNAi in human skin fibroblasts which are either proficient in NER or deficient in lesion-recognition steps of NER. Upon analyses of the NER-capacity of these cells by host cell reactivation (HCR) assay using a recombinant adenovirus-based reporter gene, we observed that PARP-1-depleted cells were inefficient in the lesion recognition step of NER. While exploring the role of PARP-1 in UV-induced apoptosis using the above models, we serendipitously discovered that RNAi fails during apoptosis. We find that endonuclease Dicer-1, critical in the regulation of RNAi gets cleaved by caspase-3 during apoptosis, which leads to its catalytic inactivation and failure of RNAi. In summary, this thesis elucidates an important role for PARP-1 in cellular responses to UV. In addition, the RNAi-abrogation during apoptosis is an exciting discovery that presents new challenges in the relatively new field of RNAi.

Titre de l'écran-titre (visionné le 26 juin 2023) / FMRP (Fragile X mental retardation protein) est une protéine de liaison à l'ARN dont l'absence cause le développement du syndrome du X fragile avec retard mental (FXS). Ceci serait dû en partie à la perte de la fonction traductionnelle des formes cytoplasmiques de la protéine. Des isoformes nucléaires de FMRP (nFMRP) ont également été identifiées. Cependant, leurs fonctions demeurent très peu étudiées. Ces isoformes ont été localisées au sein de structure nucléaire de traitement de l'ARN, les corps de Cajal. De plus, nos investigations ont impliqué nFMRP dans la réponse cellulaire aux dommages à l'ADN identifiant nFMRP comme étant un antagoniste de la formation de structures d'instabilité génomique et empêchant l'accumulation des dommages à l'ADN associé. Toutefois, les mécanismes sous-jacents impliquant nFMRP et ses interacteurs demeurent inconnus. L'hypothèse est que nFMRP interagit avec des partenaires nucléaires impliqués dans le métabolisme de l'ARN et dans la signalisation du dommage à l'ADN afin de maintenir l'intégrité génomique cellulaire. Les objectifs sont d'identifier les partenaires de nFMRP chez l'humain et de caractériser leur interaction. Ce travail a permis de localiser nFMRP au sein de sites de réparation du dommage à l'ADN, les foyers de Fanconi et d'investiguer l'effet de la protéine sur les R-loops. Finalement, mes travaux ont identifié la protéine DDX5, une hélicase à ARN, réparant les dommages à l'ADN par la résolution de R-loops, comme étant le premier partenaire de nFMRP. Ce résultat permet de définir le rôle joué par nFMRP dans le maintien de la stabilité génomique. Des études de mutagenèses permettront de caractériser le mécanisme entre nFMRP et DDX5 et de futures analyses de protéomique à large spectre permettront d'établir le premier interactome de nFMRP. Ce travail permettra d'ouvrir des avenues de recherche dans la perspective de mieux comprendre les fonctions de nFMRP ainsi que la physiopathologie du FXS. / FMRP (Fragile X mental retardation protein) is an RNA-binding protein whose absence causes the development of Fragile X syndrome with mental retardation (FXS). This would be due in part to the loss of the translational function of the cytoplasmic forms of the protein. Nuclear isoforms of FMRP (nFMRP) have also been identified. However, their functions remain very little studied. These isoforms have been localized within the nuclear RNA processing structure, the Cajal bodies. Furthermore, our investigations implicated nFMRP in the DNA damage cellular response, identifying nFMRP as an antagonist of the formation of genomic instability structures and preventing the accumulation of associated DNA damage. However, the underlying mechanisms involving nFMRP and its interactors remain unknown. The hypothesis is that nFMRP interacts with nuclear partners involved in RNA metabolism and DNA damage signaling to maintain cellular genomic integrity. The objectives are to identify the partners of nFMRP in humans and to characterize their interaction. This work made it possible to locate nFMRP within DNA damage repair sites, the Fanconi foci, and to investigate the effect of the protein on R-loops. Finally, my work identified the protein DDX5, an RNA helicase, repairing DNA damage by resolving R-loops, as the first partner of nFMRP. This result makes it possible to define the role played by nFMRP in the maintenance of genomic stability. Mutagenesis studies will characterize the mechanism between nFMRP and DDX5 and future broad-spectrum proteomic analyzes will establish the first interactome of nFMRP. This work will open avenues of research to better understanding the functions of nFMRP as well as the pathophysiology of FXS.

La cryoconservation du sperme a des avantages évidents pour l'industrie animale. Cependant, ce processus semble affecter les propriétés du sperme ainsi que son pouvoir fécondant. La présente thèse vise à étudier l'hypothèse que la congélation du sperme a un impact négatif sur son pouvoir fécondant. Cet impact pourrait être dû à des dommages à l'ADN causés par le stress oxydatif qui accompagne la congélation. Il pourrait aussi découler de l'altération d'autres paramètres fonctionnels suite au processus du congélation-décongélation. Le sperme ovin utilisé provenait de cinq béliers de race Dorset, logés au Centre d'expertise en production ovine du Québec (CEPOQ, La Pocatière, Qc, Canada). Le sperme bovin congelé provenait de 14 taureaux ayant un pouvoir fécondant connu par L'Alliance Boviteq (St-Hyacinthe, Qc, Canada). Immédiatement après la décongélation (0 h) et durant 24 h d'incubation dans un milieu similaire au tractus génital femelle, les semences bovines et ovines ont été soumises au SCSA (Sperm Chromatin Structure Assay) et aux tests d'évaluation de qualité du sperme incluant les paramètres de motilité, de viabilité, l'état physiologique (patron de CTC), la peroxydation lipidiques ainsi que les niveaux cytosoliques du calcium. Le premier objectif a porté sur l'étude des effets de la cryoconservation et de l'incubation dans un milieu similaire au tractus génital femelle sur l'intégrité de l'ADN du sperme. Les résultats montrent une altération de l'intégrité de l'ADN juste après la décongélation et durant l'incubation dans le milieu SOF (synthetic oviductal fluid). Cette altération est plus significative dans la semence congelée, par rapport à la semence fraîche. De tels dommages à l'ADN du sperme ovin pourraient être dus au stress oxydatif. Pour tester cette hypothèse, la stabilité de l'ADN ainsi que la peroxydation lipidique (LPO) ont été évaluées dans le sperme de béliers frais et congelé, traité ou non avec du H2O2. Alors que la congélation n'a pas d'effet sur la LPO, le H202 (150 ou 300 uM) affecte l'intégrité de l'ADN après 24 h d'incubation. Également, et malgré la baisse de la motilité et l'augmentation du pourcentage de spermatozoïdes ayant un patron AR de réaction à l'acrosome à 1 h, ni la LPO ni la viabilité du sperme ont été affectées par le H2O2. Cette LPO était corrélée avec l'instabilité de l'ADN. Ces résultats montrent clairement que la cryoconservation facilite l'instabilité de l'ADN de la semence de bélier. Cet effet est, en partie, dû au stress oxydatif. Concernant les essais avec le sperme bovin, deux expériences ont été menées sur 14 taureaux (1 à 4 éjaculats/taureau) classés en deux groupes de haute ou de faible fertilité in vivo évaluée par le taux de non-retour en chaleurs des vaches inséminées. L'essai 1 portait sur l'étude des corrélations entre la stabilité de l'ADN du sperme du taureau et sa fertilité durant une incubation dans le Talp-BSA à 0 et à 7 h. L'essai 2 a porté sur l'étude des corrélations entre les niveaux cytosoliques de calcium du sperme bovin cryopréservé et la fertilité du taureau in vivo. Les résultats montrent que l'altération de l'ADN était significativement plus élevée chez le groupe de faible fertilité à 0 h. En revanche, les niveaux de calcium cytosolique ont été similaires à 0 h et réduites significativement chez les taureaux les plus fertiles à 7 h d'incubation dans le Talp-BSA. À la lumière de ces résultats, il découle que la réduction de la fertilité du taureau in vivo est due aux dommages à l'ADN du sperme cryoconservé. Également, la cytométrie en flux semble être un outil de choix permettant une analyse objective et rapide de plusieurs paramètres spermatiques d'un grand nombre de spermatozoïdes en même temps. Pour ces raisons, il est recommandé d'utiliser l'analyse de cytométrie en flux (y compris le test de l'intégrité de l'ADN) dans l'industrie de l'insémination artificielle afin d'évaluer la qualité du sperme et sa relation avec la fertilité masculine.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2004-2005 / Les cancers cutanés sont associés à la formation des dimères cyclobutyliques de pyrimidine (DCP) générés par les ultraviolets (UV) du soleil. Nos résultats indiquent que les transversions T-->G retrouvées suite aux UVA sont dues aux DCP formés majoritairement sur les TT. Nous avons également démontré que, contrairement au dogme établi, les protéines réparant les mésappariements n'influencent pas la réparation des DCP. p53 a indéniablement une influence sur la réparation des DCP. Cependant, la lignée SW480, contenant un gène p53 double-muté, est fonctionnelle en réparation par excision de nucléotides des DCP. Normalement, un stress est nécessaire à l'activation des effecteurs de p53. Cependant, la protéine p53 double-mutée des SW480 active constitutivement p21, un effecteur de p53. L'activation des protéines réparant les DCP par p53 se fait probablement de la même façon que p21. L'éclaircissement de ces mécanismes a amené une meilleure compréhension de l'induction des cancers.

Adult Stem Cells (SCs) have been found in almost every organ. They are responsible for<p>homeostasis and tissue repair after injury. SCs reside and self-renew in the adult body<p>throughout the life of the organism. In rapid self-renewing organs, such as the skin, the<p>intestine and the blood, SCs divide many times during the life of the animal in order to sustain<p>the homeostatic needs of the tissue.<p>All cells of the body, including SCs, are constantly subjected to DNA assaults arising from<p>endogenous sources, such as reactive oxygen species (ROS) generated by cellular<p>metabolism, or exogenous assaults arising from the environment. The DNA damage response<p>(DDR) and DNA repair mechanisms protect cells from accumulating DNA damage by<p>inducing transient cell cycle arrest allowing DNA repair, triggering senescence or apoptosis.<p>DNA damages trigger the activation of the effectors of the DDR inducing a transient cell<p>cycle arrest, allowing DNA repair, or triggering a permanent arrest of the cell cycle or<p>apoptosis if damages are too extensive.<p>As skin is the outermost barrier of the body, epidermal cells, including SCs, are<p>continuously subjected to genotoxic stress, such as UV rays, ionizing radiation (IR) and<p>chemicals. The skin epidermis is composed of hair follicles (HFs), its associated sebaceous<p>gland (SG) and the surrounding inter-follicular epidermis (IFE). Different types of SCs<p>maintain the homeostasis of the skin; multipotent adult bulge SCs ensure the cyclic<p>regeneration of the HF and the repair of the epidermis after injury, while individual unipotent<p>SCs ensure homeostasis of the SG and the IFE.<p>In tissues with high cellular turnover, such as the epidermis, the numerous divisions that a<p>SC undergoes could result in the accumulation of replication-associated DNA damage. It has<p>been suggested that adult SCs may undergo asymmetric divisions in which the daughter SC<p>retains the older (thus “immortal”) DNA strand, while the daughter cell committed to<p>differentiation inherits the newly synthesized strand that may have incorporated replicationderived<p>mutations. The in vivo relevance of this mechanism is still a matter of intense debate.<p>We used multiple in vivo experimental approaches to investigate precisely how bulge SCssegregate their chromosomes during HF morphogenesis, SC activation and skin homeostasis.<p>Using pulse-chase experiments with two different uridine analogs together with DNAindependent<p>chromatin labelling, we showed that multipotent HF SCs segregate their<p>chromosomes randomly, and that the label-retention observed in the skin epidermis derives<p>solely from relative quiescence of skin SCs 1.<p>We investigated the in vivo response of multipotent adult HF bulge SCs to DNA damage<p>induced by IR. We showed that bulge SCs are profoundly resistant to DNA damage-induced<p>cell death compared to their more mature counterparts. Interestingly, we demonstrated that<p>resistance of bulge SCs to IR-induced apoptosis does not rely on their relative quiescence.<p>Moreover, we showed that DDR in SCs does not lead to premature senescence. We found that<p>two intrinsic cellular mechanisms participate in the resistance of bulge SCs to DNA damageinduced<p>cell death. Bulge SCs express higher level of the anti-apoptotic Bcl-2 and present<p>more transient activation of p53 due to a faster DNA repair activity mediated by a nonhomologous<p>end joining (NHEJ) mechanism. Since NHEJ is not error free, this property<p>might be a double-edged sword, supporting short-term survival of bulge SCs but impairing<p>long-term genomic integrity 2.<p>While we unveiled the relevance of DSBs repair by NHEJ in the skin epidermis, little is<p>known about the role of homologous recombination (HR) during the morphogenesis of the<p>skin epidermis. Brca1 is an essential protein for HR. Conditional deletion of Brca1 in the<p>developing epidermis leads to congenital alopecia accompanied by a decreased density of hair<p>placodes. The remaining HFs never produce mature hair and progressively degenerate due to<p>high levels of apoptosis. Multipotent adult HF bulge SCs cannot be detected in adult HF in<p>the Brca1 cKO epidermis. Brca1 deletion in the epidermis triggers p53 activation throughout<p>the epidermis, which activates apoptosis. Interestingly, IFE and the isthmus region of the HF<p>do not present any pathological phenotype by constitutive deletion of Brca1. Our results<p>demonstrated the critical role of Brca1 during HF morphogenesis. Future studies will be<p>required to understand the molecular mechanisms controlling this phenotype / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L’H2O2, produit en grande quantité dans la thyroïde, est depuis longtemps suspecté de jouer un rôle dans la pathogenèse des nodules et des cancers thyroïdiens. En effet, dans une situation pathologique où la production d'H2O2 serait excessive ou lors d’un défaut de protection par les enzymes de détoxification, l’H2O2 pourrait devenir toxique. In vitro, des quantités modérées d’H2O2 sont capables de provoquer des dégâts à l'ADN similaires à ceux induits par une irradiation de 1 Gy et peuvent même provoquer des réarrangements RET/PTC trouvés dans la plupart des carcinomes papillaires de la thyroïde. <p>La première partie de ce travail visait à mieux comprendre les mécanismes de protections qui pourraient être impliqués dans la défense contre les effets néfastes de l’H2O2 ainsi que le rôle de l’H2O2 dans la cancérogenèse thyroïdienne. Nous avons utilisé des cultures primaires de thyrocytes humains et nous les avons comparées à des lignées cellulaires de diverses origines ainsi qu’à des cultures primaires de lymphocytes T. Les résultats obtenus après traitement à l’H2O2 ont été comparés à ceux obtenus après irradiation, agent carcinogène connu. <p>Nous avons montré, grâce à une méthode fluorimétrique, que le thyrocyte était capable de dégrader de façon très efficace l’H2O2.<p>L’utilisation de L-buthionine-sulfoximine (BSO), un agent qui déplète la cellule en glutathion, a conduit à un abaissement du seuil d’observation des cassures de l’ADN (test des comètes) induites par l’H2O2 dans le thyrocyte ;ce qui suggère que la glutathion peroxydase (GPx) est impliquée dans la protection des thyrocytes en réponse à une agression par l’H2O2. Ceci a été confirmé par une augmentation de l'activité enzymatique de la GPx dans le thyrocyte une heure après une exposition à de l’H2O2 et pas après irradiation. <p>Une augmentation de l’expression de l’Hème oxygénase 1 (HMOX1) a été confirmée par RT-qPCR dans le thyrocyte après un traitement à l’H2O2. Ces résultats concordaient avec les résultats précédemment obtenus par microarray. <p>Les cinétiques de réparation de l'ADN ont montré que les dégâts à l'ADN étaient réparés plus lentement quand ils étaient provoqués par l’H2O2 que par l’irradiation. Les lymphocytes T sont incapables de réparer les dommages causés à l'ADN par l’H2O2. <p>Un pré-traitement des thyrocytes avec de l’H2O2 ralentit la réparation des dégâts à l’ADN induits par l’irradiation ce qui suggère une inhibition des enzymes de réparation en cas de stress oxydant. <p>La deuxième partie du travail a consisté à étudier la réaction de Fenton dans la thyroïde. En effet, un excès de fer libre a été suspecté d’être un facteur favorisant dans la génération de divers cancers dont le cancer thyroïdien. En présence d’H2O2, un excès de fer libre entraine la génération de radicaux hydroxyl, hautement réactifs (réaction de Fenton). <p>Nous avons mesuré les dégâts à l’ADN des thyrocytes pré-incubés avec des concentrations de FeSO4 compatibles avec la survie et traités avec l’H2O2. Une augmentation des dégâts à l’ADN et un ralentissement de leur réparation ont été observés dans les cellules. Les dégâts induits par l’irradiation n’étaient pas influencés par la présence de FeSO4. <p>Enfin, la troisième et dernière partie du travail a consisté à étudier les effets d’une irradiation causée par l’iode131 (I131) et de les comparer à ceux produits par une irradiation γ sur des thyrocytes humains en culture primaire ainsi que sur des lignées thyroïdiennes de rats (FRTL5 et PCCl3). L’irradiation par l’I131 produit moins de dégâts à l’ADN sur le thyrocyte, par le test des comètes, qu’une irradiation γ (Cs137) à doses irradiantes absorbées équivalentes. Un effet dose-réponse de l’irradiation par I’131 sur les lignées cellulaires (FRTL5 et PCCl3) est observé avec des activités radioactives faibles et des temps d’incubation courts.<p>En conclusion, le thyrocyte a développé plusieurs mécanismes de protection efficaces contre le stress oxydant, en particulier contre l’H2O2. Une augmentation du stress oxydant suite à un excès d’H2O2, de fer libre ou d’un défaut d’un des mécanismes de protection pourrait favoriser l'apparition de cancers sporadiques de la thyroïde.<p><p><p> / Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished