Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2004. / Bibliogr. Publié aussi en version électronique.

Le stress oxydatif peut provenir de sources exogènes comme les UVA ou de sources endogènes comme la chaîne respiratoire (OXPHOS). L'oxydation des composants cellulaires a été associée avec la dégénération, des phénotypes de vieillissement et des pertes de fonctionnalités des tissus. Les UVA sont les plus efficaces des rayons UV à induire de l’oxydation, tel que démontré par la formation de dommages oxydatifs à l'ADN et par l'apparition de délétions mitochondriales qui en résultent. La délétion mitochondriale de 4977 pb (ADNmtCD4977), la plus commune, et celle de 3895 pb (ADNmt3895) sont deux délétions reliées au photovieillissement cutané et à l'exposition au stress oxydant. Le phénomène de vieillissement dans la peau est bien documenté et se traduit par une dégradation de la matrice extracellulaire, une perte d'élasticité et la formation de rides. Toutefois, peu d'études portent sur la cornée humaine alors qu'elle est un tissu exposé directement aux rayonnements UV au même titre que la peau. Nous avons donc tenté mieux comprendre l'effet de l'oxydation exogène et endogène sur cette structure. L'analyse de la localisation des délétions ADNmtCD4977 et ADNmtCD4977 dans l'oeil humain a permis de révéler qu'elles se concentrent principalement dans le stroma cornéen et s'accumule avec l'âge. Le stroma cornéen est la couche cellulaire qui confère la transparence et la rigidité à la cornée humaine. Ces résultats nous ont suggéré une implication des UVA dans le photovieillissement de la cornée. Nous avons donc entrepris de vérifier les changements liés à l'exposition aux UVA dans le stroma cornéen puisque les UVA sont connus pour causer des altérations à la matrice extracellulaire (ECM) au niveau cutané. Nous avons donc créé un modèle de photovieillisement par une exposition chronique aux UVA sur des kératocytes avec lesquels nous avons fait sécréter une ECM. Nos résultats nous ont démontré qu'une exposition chronique aux UVA cause des altérations à l'ECM cornéen semblable à des phénotypes de photvieillissement. En effet, nous avons dénoté des changements transcriptomiques et protéomiques pour certains collagènes et protéoglycans. Une atteinte aux collagènes par le vieillissement cornéen se traduit entre autres par une rigidification, une opacification et un changement dans son pouvoir réfractif qui mène à une perte de la vision. Par ailleurs, notre avons également investigué l'implication du stress oxydatif dans la dystrophie cornéenne endothéliale de Fuchs (FECD), une maladie dégénérative de l'endothélium cornéen, qui mène à une perte de vision et est une cause principale de greffe cornéenne. L'étiologie de la maladie est encore inconnue, mais le stress oxydatif est soupçonné de jouer un rôle important dans la pathogenèse. Nos résultats ont amené de nouvelles évidences de l'implication de l'oxydation dans la maladie par l'augmentation de la quantité d'ADN mitochondrial et un raccourcissement des télomères dans des explants de cornées pathologiques. Nos résultats nous ont également démontré que la mise en culture de cellules FECD permettait la sélection de cellules fonctionnelles et comparables à des cellules saines en termes de quantité d'ADN mitochondrial et de son intégrité, de sensibilité à l'oxydation et de longueur télomérique. Les résultats obtenus soutiennent ainsi la possibilité d'employer les cellules FECD fonctionnelles sélectionnées pour utilisation en génie tissulaire afin de créer des cornées autologues pour pallier aux manques de greffes cornéennes. Enfin, nos résultats apportent de nouvelles évidences quant à l'implication du stress oxydatif dans le photovieillissement cornéen et dans l'étiologie de la FECD. / Oxidative stress can arise from exogenous sources like UVA or endogenous source like the respiratory chain (OXPHOS). Oxidation of cellular components is associated with degenerative disease, aging phenotypes and loss of tissue functions. UVA is the most efficient components of UV light to induce oxidation, like it have been shown by the formation of oxidative damage on DNA and the appearance of resulting mitochondrial deletions. The mitochondrial deletion of 4977 bp (mtDNACD4977), the most common, and the 3895 bp (mtDNA3895) are both connected to skin photoaging and exposition to oxidative stress. Skin photoaging is well documented and is portrayed by a degradation of the extracellular matrix, a loss of elasticity and formation of wrinkles. However, few studies have been done on the human cornea even if this structure is directly exposed to UV light like the skin. Thus, we have tried to understand the effect of exogenous and endogenous oxidative stress on this eye structure. Analysis of mtDNACD4977 and mtDNA3895 in the human eye has shown that these deletions are localized in the corneal stroma and accumulate with age. The corneal stroma is the cellular layer conferring transparency and rigidity to the human cornea. Our results have suggested that UVA is implicated in the photoaging of the cornea. Thus, we checked for changes linked to UVA exposure in the corneal stroma since UVA are known to cause alteration to the extracellular matrix (ECM). Thereby, we created a photoaging model by exposing keratocytes to chronic UVA doses and then making them secrete an ECM. Our results have shown that chronic UVA exposure causes changes similar to photoaging phenotypes. We noted changes in the transcriptomic and proteomic expression of collagen and proteoglycans. Alteration to collagens composition by aging leads to corneal rigidity, cloudening and a loss of refractive power of the cornea, which can result in a loss of vision. On the other hand, we also investigated the implication of oxidative stress in the Fuch’s Endothelial Corneal Dystrophy, a degenerative disease of the corneal endothelium, which leads to a vision loss and is the leading cause of corneal transplantation. The etiology of the disease is not well known, but oxidative stress is suspected of playing an important role in the pathogenesis. Our results have shown new evidences of oxidative stress in the pathology by displaying an increase in mitochondrial DNA and a telomeric shortening in cells from corneal explants. Our results have also shown that using cell culture on FECD cells can allow the selection of functional cells that can compare to healthy cells terms of mitochondrial amount and integrity, sensitivity to oxidation and telomere length. Our results support the fact that functional FECD cells could be used to create autologous cornea by tissue engineering to solve the lack of corneal graft. Thus, our findings bring new evidences to the implication of oxidative stress in corneal photoaging and in the etiology of FECD.

En l'absence d'un traitement curatif, les personnes vivant avec le VIH (PVVIH) sous traitements antirétroviraux (TAR) demeurent exposées à une morbidité et une mortalité élevée comparativement aux personnes non infectées. Cela s'explique par l'activation immunitaire et l'inflammation chronique qui persistent des années après, et ce, malgré une charge virale indétectable sous TAR. Découvrir et valider de nouveaux biomarqueurs de l'état d'activation immunitaire et inflammatoire non invasifs et faciles à mesurer demeure d'actualité pour améliorer le suivi et la qualité de vie des PVVIH sous TAR. Des études précédentes ont mis en évidence le rôle des vésicules extracellulaires (VE) et des microARN dans les mécanismes physiopathologiques de l'infection par le VIH. D'autres ont montré que ces VE, se retrouvant dans les divers fluides biologiques, dont le plasma, servaient de biomarqueurs pour diverses pathologies. Dans l'optique de contribuer à l'amélioration de la prise en charge des PVVIH à travers la découverte de nouveaux biomarqueurs, nous avons émis l'hypothèse que les contenus en microARN et en ADN mitochondrial (ADNmt) d'une sous-population de VE plasmatiques pouvaient être des biomarqueurs, entre autres de l'activation immunitaire. Pour vérifier cette hypothèse, plusieurs objectifs ont été élaborés: (i) purifier et caractériser deux sous-populations de VE plasmatiques, (ii) caractériser le contenu en microARN et ADNmt des VE purifiées, (iii) déterminer l'impact du rythme circadien sur la production et le contenu en microARN des VE, (iv) évaluer les performances diagnostiques des microARN vésiculaires dans l'activation immunitaire et le risque de rebond viral, (v) évaluer l'effet du TAR et de la réplication virale sur le contenu en ADNmt des VE et (vi) valider les observations faites dans différentes cohortes et sous-populations de participants. Dans cette thèse, les données cliniques et démographiques correspondant aux échantillons sanguins de différentes cohortes de participants recrutés à Québec, à Montréal et dans les deux principales villes du Burkina Faso (Bobo-Dioulasso et Ouagadougou) ont été collectées. À partir du sang veineux de ces participants, deux sous-populations de VE plasmatiques ont été purifiées et quantifiées. De plus, les microARN matures miR-29a et b, miR-92, miR-146a, miR-155, miR-223 ainsi que de l'ADNmt contenus dans ces VE ont été quantifiés en nombre absolu de copies et en nombre de copies par VE. L'ensemble des mesures des VE ont ensuite été corrélées avec les données cliniques et démographiques. Les résultats ont montré que les VE petites étaient plus abondantes dans le plasma et que les microARN étudiés et l'ADNmt étaient différentiellement enrichis entre les deux sous-populations de VE. Par exemple, le miR-155 et l'ADNmt étaient enrichis dans les VE larges. Une variation circadienne de la quantité des microARN étudiés dans les VE de personnes non infectées par le VIH contrairement à celles des PVVIH sous TAR a été décrite pour la première fois. La quantité des microARN exprimée en nombre de copies par µg d'ARN ou en nombre de copies par VE, permettait de distinguer les PVVIH des personnes non infectées. La quantité de miR-155 dans les VE petites et larges permettait respectivement de discriminer significativement les patients avec une faible virémie (20-1000 copies/mL) et les patients présentant une activation immunitaire caractérisée par un compte de lymphocytes T CD8 ≥ 500 cellules/mL et un ratio CD4/CD8 ≤ 1 dans les sous-groupes de participants. Enfin, les résultats ont montré que la quantité d'ADNmt était plus abondante dans les VE larges en fonction de la virémie et de la prise de ténofovir. Collectivement, les résultats suggèrent la nécessité de prendre en compte les sous-populations de VE et le moment du prélèvement dans l'étude des VE chez les PVVIH. De plus, les résultats mettent en exergue le rôle prépondérant de biomarqueur plasmatique que pourrait jouer le miR-155 vésiculaire dans la prédiction du rebond viral et le suivi de l'activation immunitaire. Étant donné que le miR-155 vésiculaire fournit une empreinte digitale de l'activation cellulaire, il serait pertinent de poursuivre les investigations afin de déterminer le rôle fonctionnel des VE portant le miR-155, ainsi que d'évaluer l'effet des traitements comme le ténofovir sur la production de VE portant de l'ADNmt. Toutes ces nouvelles pistes de recherche contribueraient à améliorer la prise en charge des PVVIH et à bonifier les thérapies visant à diminuer l'activation immunitaire et l'inflammation. / Without curative treatment, people living with HIV (PLWH) on antiretroviral therapy (ART) remain at significant risk of morbidity and mortality relative to those uninfected. This is due to immune activation and chronic inflammation that persists for years, despite an undetectable viral load on ART. Discovering and validating new biomarkers of immune activation and inflammatory status that are non-invasive and easy to measure remains a fundamental issue in improving the monitoring and life quality of ART-treated PLWH. Previous studies have highlighted the role of extracellular vesicles (EVs) and microRNAs in the pathophysiological mechanisms of HIV infection. Others have shown that these EVs, found in various biological fluids including plasma, serve as biomarkers for various pathologies. To improve the management of PLWH through the discovery of new biomarkers, we hypothesized that the microRNA and mitochondrial DNA (mtDNA) content of plasma EV subpopulation could be biomarkers of among other things, immune activation. To test this hypothesis, several objectives were developed: (i) to purify and characterize two plasma EV subpopulations, (ii) to characterize the microRNA and mtDNA content of the purified EVs, (iii) to determine the impact of the circadian rhythm on the production and microRNA content of EVs, (iv) to evaluate the diagnostic performance of vesicular microRNAs in immune activation and risk of a viral rebound, (v) to evaluate the effect of ART and viral replication on EV mtDNA content, and (vi) to validate the observations made in different cohorts and subpopulations of participants. In this thesis, clinical and demographic data corresponding to blood samples from different cohorts of participants recruited in Quebec City, Montreal, and the two main cities of Burkina Faso (Bobo Dioulasso and Ouagadougou) were collected. From the venous blood of these participants, we purified and quantified two subpopulations of plasma EVs. Moreover, the EVs content in mature microRNAs miR-29a and b, miR-92, miR-146a, miR-155, miR-223, and mtDNA were quantified and expressed in absolute copy and copy per EV. All EV measurements were then correlated with clinical and demographic data. Our results showed that small EVs were more abundant in plasma and that the studied microRNAs and mtDNA were differentially enriched between the two EV subpopulations. For example, miR-155 and mtDNA were enriched in large EVs. We observed for the first time a circadian variation of the quantity of EVs microRNA content from HIV-uninfected participants, in contrast to those of ART-treated PLWH. The amount of microRNAs expressed as copy number per μg of RNA or copy per EV, allowed to distinguish PLWH from uninfected individuals. The quantity of miR-155 in small and large EVs significantly discriminated respectively patients with low viremia (20-1000 copies/mL) and patients with immune activation characterized by a CD8 T-cell count ≥ 500 cells/mL and a CD4/CD8 ratio < 1 in the participant subgroups. Finally, the results showed that the amount of mtDNA was richer in large EVs and its expression increased with viremia and tenofovir intake. Collectively, the results suggest the need to consider EV subpopulations and the timing of collection when studying EVs in PLWH. Furthermore, the results highlight the prominent role as a plasma biomarker that vesicular miR-155 could play in viral rebound prediction and immune activation monitoring. Since vesicular miR-155 provides a fingerprint of cellular activation, further investigations to determine the functional role of miR-155-bearing EV and to assess the effect of treatments such as tenofovir on the production of mtDNA-bearing EVs would be relevant. All of these new avenues of research would contribute to improving the management of PLWH and improving therapies to reduce immune activation and inflammation.

L'ADN mitochondrial (ADNmt) des animaux est généralement constitué de molécules circulaires monomériques de ~16 kb. Cependant, parmi les rares exceptions qui ont été décrites, deux espèces d'Oniscidea Armadillidium vulgare et Porcellionides pruinosus (Crustacés Isopodes terrestres) présentent un ADNmt atypique composé de molécules monomériques linéaires de ~14 kb associées à des dimères circulaires et palindromiques de ~28 kb. Afin de connaître plus en détail sa structure, l'ADNmt atypique d'A. vulgare a été séquencé. Il contient bien les 13 gènes codants pour des protéines et les deux sous unités ribosomales généralement présents dans l'ADNmt des Métazoaires, mais en revanche il ne présente pas l'ensemble des 22 ARN de transferts (ARNt) attendus. De plus, une étonnante hétéroplasmie générant un ARNt alloaccepteur pour les acides aminés Alanine et Valine (ARNtAla/Val) a été découverte. Cette hétéroplasmie est un exemple unique chez les Eucaryotes par la présence de deux gènes différents sur le même locus mitochondrial. De façon surprenante, cette hétéroplasmie a également été observée chez de nombreuses autres espèces d'Oniscidea qui possèdent aussi un génome mitochondrial atypique. Il semble donc que l'apparition de cet ADNmt atypique chez les Isopodes ait permis l'apparition de l'ARNtAla/Val, et que les forces évolutives permettant le maintien de ces deux gènes essentiels à la traduction mitochondriale soient impliquées dans la conservation de cette structure atypique.

"Mémoire présenté à la faculté des études supérieures en vue de l'obtention du grade de maîtrise en droit (LL.M.) option droit, biotechnologies et société" / Le transfert d'ooplasme est une nouvelle technique de reproduction (NTR) qUI bouscule les fondements utilisés pour encadrer les modifications génétiques chez l'humain. Par l'intervention dans le matériel génétique contenu dans les mitochondries des cellules, ce nouveau procédé implique la création d'enfant issus du matériel génétique de trois parents. L'exemple est intéressant en ce qu'il permet à la fois d'analyser une situation spécifique aux enjeux éthiques et sociaux considérables, mais également de poser une réflexion plus générale sur les modes d'encadrement des NTR et leur impact sur la liberté de la recherche scientifique. Les théories sociologiques issues de l'analyse de la technoscience permettent de démontrer d'une part un enthousiasme pour la recherche et d'autre part les craintes de sa dérive. L'hypothèse du pluralisme normatif, issue de ces craintes et de l'incapacité du droit à parvenir à les calmer, permet de mettre en lumière la multiplication des normes destinées à encadrer la recherche scientifique. Cette pléthore de normes est responsable d'une confusion dans l'interprétation des différents principes qui les justifient (dignité humaine, innocuité, bienfait thérapeutique), d'autant plus qu'elles doivent être conciliées entre les niveaux international, régional et national. Cette réflexion éthique sur la limitation de la liberté de la recherche par l'encadrement des NTR permet la démonstration des véritables enjeux qu'impliquent la génétique de la reproduction et propose un regard neuf sur la façon de l'envisager. / Ooplasm transfer is a new reproductive technique that jostles the basis of human gene modification. This new fertility treatment involved the transplantation of genetic material included in mitochondrion, and results in new-born with DNA from three different persons. This technique brings important sociological and ethical dilemmas. It also raises a critical discussion on how new reproductive techniques are regulated and how that regulation limits the freedom of research. Sociological theories about technosciences have shown that there is a great enthusiasm for research in society, but also great concerns on its excess. Those concerns have generated a multiplication of norms in order to control possible abuses of researchers. The multiplication of norms limits not only the freedom of research, but is also responsible for the confusion in interpreting the principles that justify them (human dignity, innocuity, health benefits), especial1y when these principles have to be reconciled at the national, regional and international level. This study is an ethical reflection on limits imposed on the freedom of research in the new reproductive genetics area. By using ooplasmic transfer as an example, this work addresses main issues of reproductive genetic and proposes a new way of understanding and considering genetics in the socio-economical context of technoscientific societies.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Ces dernières années, de nombreux travaux ont démontré la présence de mutations mitochondriales en relation avec l'âge dans divers types tissulaires. Le sujet de notre travail consiste à démontrer de manière fiable et spécifique la détection de telles mutations, d'établir leurs relations avec l'âge, et de déterminer si elles peuvent présenter un intérêt en Médecine Légale ou en Anthropologie afin d'augmenter les indices de détermination de l'âge. Dans un premier temps, sur le tissu musculaire et les cellules buccales, nous avons mis au point une technique combinant la technologie PNA (Peptid Nucleic Acid) et la PCR en Temps Réel (qPCR), démontrant une détection sensible et une quantification des taux de mutation de l'hétéroplasmie A189G, et la relation avec l'âge dans le tissu musculaire. Ces résultats ont démontré la meilleure sensibilité de la technique PNA/qPCR par rapport à la technique de séquençage automatique pour la détection d'hétéroplasmie et ont pu être confirmés par la technique de Southern blot. Dans un deuxième temps, nous avons travaillé à partir de tissu osseux provenant d'une part d'individus d'âge connu dans le cadre d'identification en Médecine Légale et d'autre part de squelettes de Sibérie Orientale identifiés par l'analyse de marqueurs ostéologiques du vieillissement. Nous avons démontré l'accumulation de l'hétéroplasmie A189G dans les individus âgés de plus de 70 ans pour ceux dont l'âge est connu, et dans les individus âgés identifiés comme tel par les indicateurs ostéologiques. Le séquençage automatique nous a permis d'identifier deux autres hétéroplasmies (T72C et A73G) présentes dans des individus âgés de plus de 50 ans dans le tissu musculaire et osseux, hétéroplasmies déjà décrites dans la littérature. L'ensemble de ces résultats peut présenter un intérêt dans la détection et l'interprétation de l'hétéroplasmie de l'ADN mitochondrial dans les études médico-légale et anthropologique.

Au Portugal où il a été récemment introduit accidentellement, le nématode phytopathogène invasif Bursaphelenhus xylophilus est véhiculé et transmis par son vecteur indigène Monochamus galloprovincialis aux arbres hôtes (Pinus pinaster). Pour estimer les risques d'invasion et de propagation en France et au reste de l'Europe, une étude approfondie de la biologie et de l'écologie du vecteur M. galloprovincialis,, a été menée dans ce pays, en parallèle avec une étude de la variabilité génétique et morphologique de ses populations et de celles de son espèce sœur M. sutor. Il a été montré que M. galloprovincialis, présent dans toutes les forêts françaises, possède quatre stades larvaires qui ont été décrits. La fécondité, la durée des stades larvaires et la longévité ont été mesurées. L'existence d'une diapause au quatrième stade larvaire a été observée, dont l'effet est une synchronisation des émergences d'adultes ; une diapause prolongée semble exister chez une faible fraction de la population. Le développement larvaire peut être affecté par divers facteurs, dont les dimensions du rondin d'élevage. M. galloprovincialis a montré une préférence pour Pinus sylvestris, mais il peut aussi bien se développer sur d'autres espèces de Pinus notamment P. pinaster, essence majoritairement attaquée dans les régions du Sud Ouest. Il s'est avéré que ce sont surtout les conditions climatiques et non l'essence hôte, qui jouent un rôle important dans la distribution de cet insecte, ce qui a été confirmé par l'étude moléculaire. La proximité génétique et morphologique des espèces M. galloprovincialis et M. sutor a été mise en évidence par douze sites polymorphes du gène de la cytochrome oxydase I et quatre caractères morphologiques dont trois correspondant à des caractères de génitalias mâles. L'ensemble des résultats a permis de conclure qu'un grand nombre de facteurs favorables à la propagation du nématode sont réunis en France.

Le genre Stomoxys comprend 18 espèces reconnues (Zumpt, 1973), dont seule Stomoxys calcitrans est devenue cosmopolite. L'analyse phylogénétique montre la paraphylie du genre Stomoxys, due à l'inclusion de Prostomoxys saegerae dans le groupe. Les constructions phylogénétiques présentent trois clades distincts, qui correspondent bien à la biogéographie. L'émergence basale de S. indicus suggère une origine orientale du genre Stomoxys vers la fin de l'Oligocène. La divergence moléculaire, estimée à 16.3 millions d'années, entre S. niger niger et S. niger bilineatus propose l'élévation de ces deux sous-espèces au rang d'espèces. L'étude phylogéographique de S. calcitrans montre la présence d'une lignée orientale bien différenciée du reste. Les indices de diversité présument l'existence de deux zones de refuge. La première zone serait orientale, dont la recolonisation est limitée. La deuxième zone est probablement africaine, et a permis la recolonisation des autres régions. Le temps d'expansion de S. calcitrans est vraisemblablement lié au processus de domestication et/ou à la dernière période de glaciation.