Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / ExoU, uma citotoxina produzida pelo patógeno oportunista Pseudomonas aeruginosa e translocada para o citosol de células hospedeiras via sistema de secreção do tipo III, é associada à gravidade de infecções agudas. No presente trabalho, o efeito de ExoU na ativação do estresse oxidativo e da resposta antioxidante foi avaliado em culturas de células epiteliais respiratórias humanas infectadas com a cepa PA103 de P. aeruginosa (produtora de ExoU), com a mutante deletada no gene exoU, PA103∆exoU, ou com a mutante complementada com exoU sem atividade tipo fosfolipase A2, PA103∆UT/S142A. Análises das dosagens de hidroperóxidos lipídicos e isoprostanos, considerados marcadores de estresse oxidativo, revelaram que ExoU promoveu um aumento em suas concentrações. Foi observado, também, que ExoU estimulou a produção de espécies reativas de oxigênio, óxido nítrico e peroxinitrito nas células infectadas, assim como a expressão de iNOS e eNOS, mas não de nNOS. Além disso, ExoU foi responsável pelo aumento da atividade de SOD1 e pela redução dos níveis de GSH, mas não afetou a atividade da catalase ou de NQO1. No modelo in vivo, a dosagem de malondialdeído, um subproduto da lipoperoxidação de membranas, evidenciou uma maior produção deste composto no pulmão de camundongos infectados pela cepa produtora de ExoU, em comparação ao pulmão de camundongos infectados pela cepa mutante. Em conjunto, estes resultados mostram que ExoU ativa a produção de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, levando à peroxidação lipídica e modulando o sistema de defesa antioxidante / ExoU, a cytotoxin produced by the opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa and translocated into the cytosol of host cells via a type III secretion system, is associated with severity of acute infections. In the present work, the effect of ExoU in the activation of oxidative stress and antioxidant response was evaluated in cultures of human respiratory epithelial cells infected with P. aeruginosa PA103 strain (producer of ExoU), or with its isogenic mutants, the ExoU-deficient PA103∆exoU or the exoU-depleted mutant complemented with an exoU gene with a site-specific mutation in the PLA2 catalytic site, PA103∆UT/S142A. Analysis of dosages of lipid hydroperoxides and isoprostanes, considered markers of oxidative stress, revealed that ExoU promoted an increase in their concentrations. It was also observed that ExoU stimulated the production of reactive oxygen species, nitric oxide and peroxynitrite in infected cells, as well as the expression of iNOS and eNOS, but not nNOS. Furthermore, ExoU was responsible for the increased activity of SOD1 and the reduced levels of GSH, but did not affect the activity of catalase or NQO1. In the in vivo model, the analysis of malondialdehyde, a byproduct of lipid peroxidation of membranes, showed increased production of this compound in the lungs of mice infected with the ExoU-producing strain compared to the lungs of mice infected with the mutant strain. Together, these results show that ExoU activates the production of reactive oxygen and nitrogen species, leading to lipid peroxidation and modulating the antioxidant defense system.

Objetivos: Avaliar o perfil de suscetibilidade, a prevalência da produção de AmpC, β-lactamase de espectro estendido (ESBL) e Metalo-β-lactamase (M-βla) em Pseudomonas aeruginosa obtidas de dois hospitais universitários distintos (ISCMPA e HCPA) em Porto Alegre. Em adição, tipagem molecular por PFGE foi realizada entre os isolados produtores de M-βla para avaliar a relação clonal. Métodos: Foi determinada a suscetibilidade de 238 isolados de P. aeruginosa para 8 agentes antimicrobianos, através do teste de disco-difusão, usando agar Müller-Hinton (MH) de acordo com “National Committee for Clinical Laboratory Standards” (NCCLS) . Todos isolados foram avaliados para produção de AmpC com o disco de imipenem (indutor) próximo ao disco de cefepima/ceftazdima (substrato). Um achatamento no halo de cefepime/ceftazidima pela indução da enzima pelo imipenem, indicava resultado positivo para AmpC. Todos isolados forma avaliados para a presença de ESBL através do teste de aproximação de disco com ceftazidima, cefepima, cefotaxima, ceftriaxona e ticarcilina-clavulanato como inibidor de β-lactamase. A produção de M-βla foi determinada através do teste de aproximação de discos de CAZ a discos impregnados com ácido2-mercatopropiônico (2-MPA). As taxas de resistência foram comparadas através do Teste Exato de Fisher. Valor de P<0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Análise de macrorestrição com a enzima speI foi realizada em isolados produtores de M-βla. Resultados: As taxas de resistência para todos os agentes foram superiores entre os isolados obtidos na ISCMPA em relação aos do HCPA. A ceftazidima mostrou ser o antibiótico mais efetivo contra os isolados de ambos Hospitais (ISCMPA e HCPA) com taxa de resistência de 25,7% (ISCMPA) e 6,1% (HCPA). A expressão de AmpC foi observada em 190 isolados (83,7% HCPA e 77,1% ISCMPA). Não foi possível detectar a presença de ESBL entre todos as P. aeruginosa avaliadas em ambos hospitais. Foi observada a presença de M-βla em 28 isolados (20,0%) da ISCMPA. Mas não foi detectada M-βla em nenhuma P. aeruginosa do HCPA. A análise de macrorestrição mostrou que 14 de 16 P. aeruginosa Mβla positivas pertenciam a um clone (denominado clone A), e seus subclones. Apenas dois outros clones (B e C) foram identificados em um isolado cada. / Objectives: To evaluate susceptibility profile, the prevalence of extendedspectrum β-lactamases (ESBL) production, AmpC and Metallo-β-lactamases (M-βla) in Pseudomonas aeruginosa obtained from two distinct hospitals (ISCMPA and HCPA) in Porto Alegre, Brazil. In addiction, molecular typing by PFGE was perfomed among isolates producing M-βla in order to evaluate probably clonal relatedness. Methods: The susceptibility of 238 P. aeruginosa to 8 antimicrobial agents was determined by the disk diffusion method, using Müller-Hinton agar (MH) in accordance with “National Committee for Clinical Laboratory Standards” guidelines. All isolates were evaluated for AmpC production with the imipenem disk (strong inducer) near of the cefepime/ceftazidime disk (substrate). A blunting of the cefepime/ceftazidime zone by imipenem-induced enzyme, indicated positive result for AmpC. All isolates were evaluated for ESBL production by disk approximation test with ceftazdime, cefepime, cefotaxime, ceftriaxone plus ticarcillin-clavulanate as inhibitor. M-βla production was determined by disk approximation test with disks containing CAZ and 2-mercatopropionic acid (2-MPA). The results were compared by the Fisher’s Exact Test. Macrorestriction analysis by SpeI, followed by PFGE, was perfomed in isolates M-βla positive. The resistance rates were compared by The Fisher’s Exact Test. P values < 0.05 were considered to be statistically significant. Results: The resistance rates to all antimicrobial agents were higher among isolates obtained from ISCMPA than those obtained from HCPA. The ceftazidime was the more active antibiotic against the isolates in both hospitals with resistance rates of 25,7% (ISCMPA) and 6,1% (HCPA). The derepression of AmpC was observed in 190 isolates (83,7% HCPA and 77,1% ISCMPA). It was not possible to detect the presence of ESBL among all P. aeruginosa evaluated in both hospitals. Positive results for M-βla production were observed in 28 isolates (20,0%) from ISCMPA. But none M-βla production was identified in P. aeruginosa from HCPA. The macrorestriction analysis by PFGE, showed that 14 of 16 M-βla positive P. aeruginosa beloneed to one clone (named clone A) and its subclones.Only two others clones (B and C) were identified in one isolate each.

Os surfactantes são poderosos agentes anfipáticos com aplicação nas indústrias petrolífera, alimentícia e farmacêutica, entre outras. Vários surfactantes quimicamente sintetizados são hoje utilizados, embora o desenvolvimento de produtos biodegradáveis e menos tóxicos, os chamados biossurfactantes, agentes obtidos por via microbiológica, torna-se uma estratégia importante na obtenção de componentes compatíveis com o meio ambiente. Muitos biossurfactantes têm sido produzidos, embora poucos sejam comercializados em virtude do alto custo de produção envolvido na obtenção desses compostos, principalmente no que se refere à utilização de substratos caros a e aos processos de purificação. Neste sentido, a utilização de glicerol, substrato gerado em grandes quantidades a custos cada vez mais reduzidos em função da crescente demanda mundial de biodiesel, aliada a habilidade da bactéria Pseudomonas aeruginosa UCP0992 em produzir biossurfactantes, foi avaliada para a produção de um biossurfactante com vistas à aplicação na área ambiental. Inicialmente, a influência da concentração do glicerol (2-7%), do tipo (NaNO3, NH4NO3, uréia, (NH4)2SO4, peptona, extrato de levedura e milhocina) e da concentração (0,05-0,6%) da fonte de nitrogênio e das condições de cultivo (temperatura 28 e 37C, aeração 60, 80 e 90% e agitação 150 e 200 rpm) foram avaliadas na produção do biossurfactante por Pseudomonas aeruginosa UCP0992. A cinética de crescimento do microrganismo e de produção do biossurfactante foi descrita para o meio mineral suplementado com 3% de glicerol e 0,6% de NaNO3, a 28 C durante 120 horas sob agitação de 200 rpm. Uma relação paralela entre o crescimento do microrganismo, o consumo de glicerol, a obtenção do biossurfactante e a emulsificação do hexadecano foi observada, indicando uma produção associada ao crescimento. O rendimento em biossurfactante isolado após 96 horas foi de 8,0 g/L, para uma biomassa de 4,0 g/L. A tensão tensão superficial do meio foi reduzida de 56 mN/m para 27,4 mN/ e a emulsificação do hexadecando permaneceu inalterada a partir das 72 horas, com percentual de 75%. O biossurfactante apresentou CMC de 700 mg/L, tensão interfacial contra o hexadecano de 2 mN/m, estabilidade térmica (4-120C) e estabilidade a diferentes pH (4-12) relacionadas à capacidade de redução da tensão superficial e à atividade de emulsificação de óleos vegetais e diesel, além de tolerância a concentrações salinas (2-10%). O biossurfactante demonstrou pequenas variações na tensão superficial e na capacidade de emulsificação quando submetido a 90C por durante dias horas. O biossurfactante foi caracterizado como um grupo de raminolipídeos de natureza aniônica. O biossurfactante bruto não apresentou toxicidade frente ao microcrustáceo Artemia salina e ao repolho (Brassica oleracea) nas condições testadas, enquanto que o biossurfactante isolado apresentou toxicidade frente ao microcrustáceo em função da concentração testada. O potencial de aplicação do biossurfactante na remoção de diesel foi demonstrado pelos elevados percentuais de remoção (85%). Os resultados promissores obtidos nesse trabalho indicam a viabilidade de produção de biossurfactantes potentes a partir de glicerol como fonte de carbono / Surfactants are amphipathic agents with application in different industries, such as the petroleum, food and pharmaceutical. Many kinds of chemical surfactants are being used nowadays, although the development of alternative products, with biodegradable nature and lower toxicity, as the so called biosurfactants, metabolites from microorganisms, is a sound strategy for the development of compounds with ecological acceptability and for the knowledge of specific properties and application of these compounds. Different biosurfactants have been produced, but few are being commercialised due the high production costs regarded the utilisation of substrates and purification techniques. Thus, the purpose of this work is to combine the glycerol generated from biodiesel at low cost with the ability of the bacterium Pseudomonas aeruginosa UCP0992 to produce a biosurfactant with ability to remove a hydrophobic pollutant from the petroleum industry. First, the influence of glycerol concentration (2-7%), of type (NaNO3, NH4NO3, urea, (NH4)2SO4, peptone, yeast extract and corn steep liquor), and concentration (0,05-0,6%) of the nitrogen source and of the cultivation conditions (temperature 28 and 37C, aeration 60, 80 and 90% and agitation 150 and 200 rpm) was studied for biosurfactant production by Pseudomonas aeruginosa UCP0992. The kinetic of growth and production of the biosurfactant has been described for the medium supplemented with 3% glycerol and 0.6% NaNO3, at 28 C during 120 hours under 200 rpm. A parallel relation between biomass, consume of glycerol, biosurfactant production, surface tension reduction and hexadecane emulsification showed a growth-associated production. The isolated biosurfactant corresponded to a yield of 8.0 g/L after 96 hours with a biomass of 4.0 g/L. The medium surface tension was reduced from 56 mN/m for 27,4 mN/ and the hexadecane emulsification remained unchanged after 72 hours, with values around 75%. The biosurfactant showed a CMC of 700 mg/L an interfacial tension against hexadecane of 2 mN/m, thermal (4-120C) and pH (4-12) stability regarding the surface tension reduction and the emulsification capacity of vegetable oils and diesel, and tolerance under salt concentrations (2-10%). Little changes in the surface tension and in the emulsification activity were observed when the cell-free broth containing the biosurfactant was submitted under 90C during two hours. The biosurfactant has been characterized as a group of rhamnolipids with anionic nature. The crude biosurfactant did not show toxicity against the micro crustacean Artemia salina and the cabbage (Brassica oleracea) in the conditions tested, while the isolated biosurfactant showed toxicity against the micro crustacean depending on the concentration used. The potential application of the biosurfactant in petroleum and diesel recovery from sand was demonstrated by the percentiles of oils removal (85%). The promising results obtained in this work are noteworthy for possible biosurfactant production from glycerol

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A Pseudomonas aeruginosa é um microorganismo patógeno oportunista, sendo considerado um dos mais importantes agentes de infecções hospitalares, devido a sua múltipla resistência aos diversos antibióticos existentes. É encontrada no solo, água, vegetais, animais, alimentos e em diversos ambientes hospitalares, devido ao seu elevado potencial de resistência pode realizar processos de biorremediação. Um dos maiores problemas ambientais gerados nas atividades de uma indústria têxtil é a grande quantidade de efluentes altamente poluidores gerados, dentre os poluentes destacase o corante preto de remazol, que tem causado sérios problemas ambientais, como afetar a transparência e estética dos corpos aquáticos, impedindo assim a penetração da luz solar, e por conseguinte a atividade fotossintética. Neste sentido, foram realizados estudos iniciais com a P. aeruginosa (UCP1567) isolada de ambiente hospitalar, através da eliminação de plasmídeos relacionados à resistência aos antibióticos, utilizando o cádmio. A amostra foi aclimatada duas vezes em meio Luria Bertani contendo glicose, através da Concentração Mínima Inibitória determinada para o cádmio (32g/mL e 52 g/mL, respectivamente) utilizando o método de diluição. Os resultados obtidos sugeriram que o metal pesado foi eficiente na eliminação dos plasmídeos de resistência, correspondendo a 84,61% para a aclimatação com cádmio a 32g/mL, e 92,30% para 52 g/mL. Em seguida, a cultura após eliminação da resistência pelo cádmio, foi submetida ao processo de descoloração do preto de remazol através de um planejamento fatorial 23, tendo como variáveis independentes a agitação, a concentração do corante e o tamanho do inóculo, e como variável resposta, a descoloração do corante. Os resultados obtidos demonstraram que o potencial de biorremediação da P. aeruginosa não foi afetado, e que a cultura microbiana após eliminação de resistência, promoveu uma descoloração de 85-94,4% do corante, sob condições de repouso, e de 52% sob agitação de 100 rpm e 45% sob agitação de 200 rpm. / Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic pathogen microorganism was considered one of the most important agents of nosocomial infections due to its multiple resistance to many existing antibiotics. It is found in soil, water, plants, animals, food and various hospital settings, due to its high potential for resistance can perform processes of bioremediation. One of the biggest environmental problems generated in the activities of a textile industry is the large number of highly polluting effluents generated among the pollutants out to the black dye Remazol, which has caused serious environmental problems such as transparency and affect the aesthetics of water bodies thus preventing the penetration of sunlight, and thus the photosynthetic activity. In this regard, initial studies were performed with P. aeruginosa (UCP1567) isolated from hospital environment through the elimination of plasmids related to antibiotic resistance, using cadmium. The sample was acclimatized twice in Luria Bertani medium containing glucose, through the Minimum Inhibitory Concentration determined for cadmium (32&#956;g/mL and 52 mg / mL, respectively) using the dilution method. The results suggest that heavy metal was effective in eliminating the resistance plasmids, corresponding to 84.61% for acclimation to cadmium 32&#956;g/mL, and 92.30% for 52 mg / mL. Then, after eliminating the culture of resistance by cadmium, was submitted to the decolorization of Remazol black through a 23 factorial design, with independent variables agitation, the dye concentration and inoculum size, and as the response variable discoloration of the dye. The results showed that the potential for bioremediation of P. aeruginosa was not affected, and that culture after removal of microbial resistance, caused a discoloration of 85 to 94.4% of the dye, under conditions of rest, and 52% and agitation of 100 rpm and 45% under agitation at 200 rpm.

Foram avaliados 528 isolados clínicos de Pseudomonas aeruginosa de 131 pacientes fibrocísticos atendidos em um centro de referência em fibrose cística (FC) durante o período de 2005 a 2008. 135 isolados clínicos (25,6%) apresentaram subpopulação hipermutante (isolados com altas taxas de mutações) utilizando teste modificado de suscetibilidade aos antimicrobianos. Destes, 9 isolados (6,7%) de 7 pacientes foram classificados como hipermutantes (HPM) segundo estimativa da freqüência de mutação. Após seqüenciamento do gene mutS e análise de mutações relacionadas à inativação do sistema de reparo de erros no pareamento do DNA (Mismatch Repair System - MRS), foi possível observar este tipo de mutação em 5 isolados HPM de 4 pacientes. Avaliamos a formação de biofilme em 45 isolados NHPM, 9 HPM e suas respectivas subpopulações por duas metodologias. Segundo o primeiro método, 24 (53,3%) e 3 (21,4%) isolados NHPM e HPM, respectivamente, foram classificados como não-formadores de biofilme. Pelo segundo método, apenas 4 (8,9%) isolados NHPM e nenhum isolado HPM foram classificados nessa categoria. Os percentuais de resistência aos antibióticos ceftazidima, ciprofloxacino e tobramicina em condições de biofilme foram mais elevados que aqueles obtidos em crescimento plantônico e, em ambas as condições, foi possível evidenciar forte associação entre hipermutabilidade e aumento de resistência antibiótica. A associação dos macrolídeos azitromicina e claritromicina, em concentrações sub-inibidoras, com os antibióticos anti-pseudomonas, demonstrou ação inibitória sobre isolados clínicos de P. aeruginosa em condições de biofilme, o que sugere sua indicação no tratamento de infecções por P. aeruginosa pela sua ação anti-biofilme. / We evaluated 528 clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in 131 CF patients attended at a referral center for cystic fibrosis (CF) during the period of 2005 to 2008. 135 clinical isolates (25.6%) presented hypermutable subpopulation (isolates with high mutation rates) using a modified antimicrobial susceptibility method. Of these, 9 isolates (6.7%) of 7 patients were classified as hypermutable (HPM) according to the estimate of mutation frequency. After gene sequencing and analysis of mutS mutations related to inactivation of the repair system errors in DNA pairing (Mismatch Repair System - MRS), we observed this type of mutation in 5 HPM isolates of 4 patients. We evaluated the biofilm formation in 45 isolates NHPM, 9 HPM and their subpopulations by two methods. According the first method, 24 (53.3%) and 3 (21.4%) isolates NHPM and HPM, respectively, were classified as non-biofilm formers. According the second method, only 4 (8.9%) isolates NHPM and none HPM were classified in this category. The percentages of resistance to antibiotics ceftazidime, ciprofloxacin and tobramycin in conditions of biofilm were higher than those obtained in planktonic growth, and in both conditions, it was observed a strong association between hypermutability and increased antibiotic resistance. The association of macrolides azithromycin and clarithromycin, in sub-inhibitory concentrations, with anti-pseudomonas antibiotics, has shown inhibitory activity on clinical isolates of P. aeruginosa in biofilm conditions, which should be recommended for treatment of CF P. aeruginosa infections due to its anti-biofilm action.

Pseudomonas aeruginosa est responsable d'infections persistantes chez les patients atteints de mucoviscidose, suggérant une capacité à mettre en échec les défenses immunitaires innées. Par ailleurs, nous savons que les cellules de l'hôte produisent de la kynurénine, exerçant un contrôle sur l'homéostasie du système immunitaire. Or, la bactérie elle-même produit de la kynurénine. Des résultats préliminaires de notre équipe ont montré que lors d'une infection pulmonaire aiguë chez la souris par une souche de P. aeruginosa ne produisant pas de kynurénine, il y a une perte de virulence (diminution de la mortalité des souris et de la charge bactérienne pulmonaire). Le but de notre travail est donc d'examiner le rôle du métabolisme de la kynurénine durant l'interaction entre P. aeruginosa et les cellules de système immunitaire, en particulier les neutrophiles et les macrophages. Nous avons montré que la plupart des souches de P. aeruginosa isolées de patients atteints de mucoviscidose produisent un niveau élevé de kynurénine. De plus, une forte activation transcriptionnelle de kynA (le premier gène de la voie des kynurénines de P. aeruginosa) a été observée lors du contact avec les cellules de l'immunité, en particulier les neutrophiles et les macrophages. Durant la coculture des neutrophiles humains avec différentes souches mutantes de P. aeruginosa, produisant des niveaux variables de kynurénine, nous avons démontré que la kynurénine favorise la survie des bactéries. De plus la production de formes réactives de l'oxygène (FRO) par la NADPH oxydase des neutrophiles activés (évaluée par chimiluminescence en présence de luminol ou d'isoluminol ou par test de réduction du cytochrome c sensible à la superoxyde dismutase) est inhibée par des doses croissantes de kynurénine synthétique. Cette inhibition n'est due ni à un défaut de phagocytose ni à une inhibition directe de la NADPH oxydase. En utilisant des systèmes de production in vitro de FRO, nous avons montré que la kynurénine est un « scavenger » du peroxyde d'hydrogène et, dans une moindre mesure, des anions superoxydes. Ce « scavenging » a lieu principalement en intracellulaire lors de la stimulation par les bactéries, probablement dans le phagosome. Nous avons également confirmé que les neutrophiles n'expriment pas le récepteur de la kynurénine, le récepteur d'aryl-hydrocarbone (AhR). A l'inverse, les macrophages expriment ce récepteur et son expression est induite par la kynurénine 48h après activation par P. aeruginosa ou par du LPS (lipopolysaccharide). La kynurénine a également un impact sur la polarisation des macrophages, étudiée par cytométrie en flux, en stabilisant le phénotype immunosuppresseur M2c. Enfin, la première enzyme de la voie des kynurénines de P. aeruginosa a été produite, purifiée et caractérisée. Nous avons démontré que KynA est une enzyme allostérique, avec un K' pour le L-tryptophane de 10,8 mM, une Vm de 2862 nM/min, et un Kcat de 4,09 M de N-formylkynurénine/min/M d'enzyme, indiquant une possible régulation au niveau enzymatique de la voie des kynurénines. Par ailleurs, l'analogue du substrat (le L-1-methyl-tryptophane) inhibe légèrement l'enzyme pure, mais n'a pas d'effet sur une culture bactérienne. Pour conclure, nous avons montré au cours de ce projet que la voie des kynurénines de P. aeruginosa est un des mécanismes qui permet à cette bactérie d'échapper au système immunitaire inné. La voie des kynurénines de P. aeruginosa pourrait donc être une nouvelle cible thérapeutique. L'enzyme recombinante KynA purifiée est un nouvel outil qui pourrait permettre de cribler des inhibiteurs spécifiques. / Pseudomonas aeruginosa is responsible for persistent infections in cystic fibrosis patients, suggesting an ability to circumvent innate immune defenses. Many host cells produce kynurenine, which is known to control immune system homeostasis. Interestingly this bacterium uses the kynurenine pathway to catabolize tryptophan. In addition, preliminary results of our laboratory showed that during acute pulmonary infection in mice with a strain of P. aeruginosa which does not produce kynurenine, there is a loss of virulence (reduction of mice mortality and pulmonary bacterial burden). The aim of this study is to investigate the role of kynurenine metabolism in the interaction between P. aeruginosa and immune system cells, in particular neutrophils and macrophages. We showed that most strains of P. aeruginosa isolated from cystic fibrosis patients produce a high level of kynurenine. Moreover, a strong transcriptional activation of kynA (the first gene involved in the kynurenine pathway in P. aeruginosa) was observed upon contact with immune cells and particularly with neutrophils and macrophages. In addition, using coculture of human neutrophils with various mutant strains of P. aeruginosa producing variable levels of kynurenine, we demonstrated that kynurenine promotes bacterial survival. Increasing amounts of synthetic kynurenine inhibits reactive oxygen species (ROS) production by the NADPH oxidase of activated neutrophils, as evaluated by chemiluminescence with luminol or isoluminol or superoxide dismutase-sensitive cytochrome c reduction assay. This inhibition is due neither to a phagocytosis defect nor to direct NADPH oxidase inhibition. Using in vitro ROS-producing systems, we showed that kynurenine scavenges hydrogen peroxide and, to a lesser extent, superoxide anions. Kynurenine's scavenging effect occurs mainly intracellularly after bacterial stimulation, probably in the phagosome. We also confirmed that neutrophils do not express the kynurenine receptor, the arylhydrocarbon receptor (AhR). Conversely, macrophages express this receptor and the kynurenine induces its expression after 48h of activation by P. aeruginosa or LPS (lipopolysaccharide). After activation, kynurenine impacts also macrophage polarization, analysed by flow cytomerty, by stabilizing immunosuppressive phenotype M2c. Finally, the first enzyme of the kynurenine pathway of P. aeruginosa was produced, purified and characterized. We demonstrated that KynA is an allosteric enzyme, with a K' of 10,8 mM of L-tryptophan, a Vm of 2862 nM/min and a Kcat of de 4,09 M of N-formylkynurenine/min/M of enzyme, indicating a possible regulation at the enzymatic level of the kynurenine pathway. Furthermore, the substrate analogue (L-1-methyl-tryptophan) inhibits slightly the pure enzyme, but has no effect on bacterial culture. In conclusion, the kynurenine pathway allows P. aeruginosa to circumvent the innate immune response. The kynurenine pathway of P. aeruginosa could be a new therapeutic target. Purified recombinant enzyme KynA is a new tool that could help to screen specific inhibitors.

P. aeruginosa est une bactérie pathogène de l'homme, responsable d'infections nosocomiales chez les patients immunodéprimés. Bien que son évolution au sein d'un patient soit bien décrite, son évolution génomique globale au cours de sa propagation dans un hôpital est très mal connue. Le clone à haut-risque ST395 multirésistant aux antibiotiques a diffusé dans le Centre Hospitalier Regional Universitaire de Besançon entre 1997 et 2008 en infectant ou colonisant plus de 300 patients. Une approche WGS a été utilisée afin d'identifier l'origine de l'épidémie, les caractéristiques ayant aidé à son installation à l'hôpital ainsi que celles à l'origine de sa disparition. Les génomes de 54 isolats représentatifs de l'épidémie ont été séquencés. L’arbre phylogénétique a mis en évidence deux clusters distincts indiquant la présence de deux épidémies parallèles. La datation d'un ancêtre commun en 1979, date de début de la construction de l'hôpital, indiquerait une contamination précoce du réseau d'eau de l'hôpital. Cette hypothèse est soutenue par la présence d'un îlot génomique spécifique de ST395 portant les gènes codant 6 transporteurs du cuivre et associée à une résistance phénotypique à ce métal constituant les tuyaux du réseaux de distribution d'eau potable. Les isolats tardifs présentaient des signatures génomiques d'adaptation à l’infection chronique (altération du lipopolysaccharide et de la porine OprD – objectivées phénotypiquement, et extinction de la surproduction de la pompe d’efflux MexAB-OprM – contrôlée par RT-qPCR) suite à des mutations indépendantes. Certaines de ces mutations ont été associées à une perte de fitness bactérien. Nous émettons l’hypothèse que l’émergence indépendante d’isolats adaptés à l’infection chronique, et ainsi l’accumulation de culs-de-sac épidémiologiques, a participé à l’épuisement de l’épidémie hospitalière de P. aeruginosa ST395. / P. aeruginosa is an opportunistic pathogen responsible of hospital-acquired infections in immunocompromised patients. Although in-host evolution of P. aeruginosa is well documented, little is known about this pathogen evolution during its spread on a hospital scale. The high-risk multidrug resistant clone ST395 spread among more than 300 patients in the University Hospital of Besançon between 1997 and 2008. We used a WGS approach to identify the origin of the outbreak, the features that could have helped its implantation in our hospital and those associated with the end of the epidemics. The genomes of 54 representative isolates were fully sequenced. The phylogenetic tree indicated two distinct clusters corresponding to two parallel outbreaks. The ancestor of the ST395 clone possibly contaminated our hospital water network during its construction in 1979. This hypothesis is supported by the fact that the ST395 strain had a specific genomic island carrying 6 copper transporter genes implicated in copper resistance, correlated with the resistance to this metal which water supply network is made of. The late isolates displayed independent genomic signatures of chronic adaptation in patients (altered LPS and porin OprD, and extinction of MexAB-oprM efflux pump overproduction). Some of these mutations were associated with a decreased in vitro fitness. We hypothesize that the independent emergence of isolates adapted to chronic infection, and thus the accumulation of epidemiological dead-ends, participated to the end of the hospital outbreak of P. aeruginosa ST395.

Pseudomonas aeruginosa (PA) est une bactérie présentant des résistances aux antibiotiques toute particulière. Elle est aujourd’hui largement impliquée dans de nombreuses maladies nosocomiales et dans l’infection de patients immunodéprimés. Les lectines sont des glycoprotéines formant des interactions faibles et réversibles avec les saccharides, et elles sont impliquées dans les mécanismes de protection et de virulence de la bactérie. Afin d’augmenter l’affinité des sucres pour celle-ci nous utilisons la multivalence conduisant à des leurres moléculaires ciblant les lectines I et II de PA. Notre stratégie consiste à synthétiser des glycoclusters conjugués à une étiquette ADN permettant leur criblage par des puces à ADN. Nous décrivons le design, la synthèse et l’assemblage des différents blocs de construction composant les glyco-oligonucléotides en s’appuyant sur la chimie "Click" (CuAAc) et la chimie oligonucléotidique. Le criblage des glyco-oligonucléotides est complété par des études de modélisation moléculaire et par RMN STD. Les meilleurs composés issus du criblage sont synthétisés sans leur étiquette ADN afin d’évaluer leur capacité inhibitrice de la formation du biofilm par PA. / Pseudomonas aeruginosa (PA) is a bacteria with a strong resistance to antibiotics.It’s an opportunistic germ involved in nosocomial infections and the infection of immunocompromised patients. Lectins are glycoproteins that bind saccharides reversibly with a low affinity. They are involved in bacteria protection mechanisms and virulence. In order to increase the affinity of saccharides to PA lectins I and II, we used multivalence and synthesized molecular decoys. Our strategy involves the synthesis of glycoclusters conjugated with a DNA tag in order to easily screen them on DNA arrays. We described here the design, the synthesis and the assembly of different building blocks allowing the synthesis of glyco-oligonucleotides,based on "Click" chemistry (CuAAc) and oligonucleotide chemistry. The screening of theglyco-oligonucleotides was completed by studies of molecular modelisation and by STD NMR.The best compounds from the screening were synthesized without the DNA tag in order to evaluate their abilities of inhibiting the biofilm formation of PA.

Neste trabalho foram preparados materiais híbridos do tipo silicatos organicamente modificados (Ormosils) contendo fosfotungstato, [PW12O40]-3 e dopados com nanopartículas sintetizadas core@shell SiO2@TiO2. Os objetivos a serem atingidos com estes materiais são obter filmes com alta sensibilidade à radiação UV e capazes de fotossintetizar nanopartículas de Ag no seu interior e superfície visando revestimentos antibacterianos. O pigmento fotocrômico nos filmes é o fosfotungstato e o core@shell irá atuar como agente potencializador da resposta fotocrômica dele. Dessa maneira variou-se a quantidade de volume da suspensão das partículas core@shell tentando maximizar a resposta fotocrômica com a menor quantidade possível de partículas adicionadas. Observa-se uma resposta não linear da sensibilidade ao UV observada pelo aumento no fotocromismo com a quantidade de suspensão de partículas adicionada. Ormosils com nanopartículas de Ag fotossintetizadas foram preparados com intuito de verificar a inibição desses na formação de biofilmes de bactérias patogênicas, ou seja, Staphylococcus aureus e Pseudomona aeruginosa. Os materiais foram caracterizados por espectroscopias vibracionais, espectroscopia de fotoelétrons de raios X (XPS), Difração de Raios X (DRX), Fluorescência de Raios X, Microscopia de Força Atômica(AFM) e Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). Nos testes de inibição da formação de biofilme notou-se uma maior inibição frente às bactérias S. aureus usando filmes de ormosils core@shell. Entretanto, para a inibição de P. aeruginosa a presença de core@shell não de maneira significativa. Na presença de NP de Ag ambas as bactérias foram inibidas totalmente. Os testes microbiológicos foram caracterizados através de contagem de placa, microscopia de Epifluorescencia, teste de reaproveitamento, teste do halo de crescimento, Microscopia Eletrônica de Varredura e espectroscopia de fotoelétrons de raios X (XPS). / In this project, hybrid materials based on organo modiefied silicates (Ormosils) containing phosphotunsgtic acid (HPW) and doped with SiO2@TiO2 core@shell nanoparticles were prepared. The objectives of the project was to obtain films of these hybrid ormosil-HPW-SiO2@TiO2 materials with high sensitivity to UV radiation and, which after coating with silver nanoparticles, could be used for antibacterial applications. The HPW in these films serves as the photochromic component while the role of SiO2@TiO2 particles was to enhance the innate phototromic reponse of the HPW. The prepared hybrid materials and hybrid films were characterized by vibrational spectroscopy, X-ray photoelectron spectroscopy, X-ray diffraction analysis, X-ray fluoresence, atomic force microscopy and scanning electron microscopy. The effect of addition of SiO2@TiO2 particles on the photochromic reponse was systematically studied in order to obtain films with maximum photochromic response. The UV sensitity or the photochromic response showed a non-linear increase as function of the amount of SiO2@TiO2 particles added. The hybrid ormosil-HPW-SiO2@TiO2 films modified with silver nanoparticles were studied for their antibacterial activity against Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa as model bacteria. The ormosil-HPW-SiO2@TiO2 films showed a good degree of inhibition against S. aureus, while the presence of SiO2@TiO2 in the ormosil-HPW films had no significant effect on the inhibition ability of the hybrid films against P. aeruginosa. The ormosil-HPW-SiO2@TiO2 films modified with Ag totally inhibited the growth of both the model bacteria studied. These photochromic and antibacterial hybrid films can find useful applications in UV-sensing devices and antibacterial coatings.

Uma característica associada à capacidade de Pseudomonas aeruginosa sobreviver e disseminar-se frente a situações adversas encontradas no ambiente e no organismo de hospedeiros é a regulação de genes de resposta a condições de estresse celular, que incluem o evento de choque térmico. A exposição do microrganismo a um ambiente de alta temperatura resulta na indução da síntese de proteínas específicas, representadas por chaperonas e proteases, que conferem um aumento da viabilidade celular microbiana em condições consideradas letais. Presume- se que o gene PA 0657 de P. aeruginosa O1 possa estar associado à indução ou supressão do processo transcricional de genes envolvidos na resposta ao choque térmico. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi caracterizar a função do gene PA0657 de P. aeruginosa O1. Para isso, análises bioinformáticas foram realizadas e o gene foi clonado e expresso em sistema bacteriano, produzindo uma proteína recombinante que foi purificada e caracterizada enzimaticamente. Além disso, uma linhagem de P. aeruginosa O1 com o gene PA0657 rompido por recombinação homóloga foi construída, sendo submetida, juntamente com a linhagem selvagem, a uma condição de estresse térmico, permitindo que a expressão de diversos genes associados ao evento de choque térmico pudessem ser avaliadas por qRT-PCR. Os resultados mostraram que a proteína recombinante PA0657 foi capaz de degradar adenosina trifosfato (ATP), dependente do íon Zn2+. Foi possível verificar também que a linhagem rompida perdeu a capacidade de produzir o pigmento piocianina quando crescida em meio cetrimida e não apresentou seu fenótipo mucóide. Em análise in silico observou-se que a região promotora do gene PA0657 é dependente de σ32 e a análise de expressão gênica evidenciou uma diminuição de expressão do gene rpoH na linhagem selvagem de PAO1 após choque térmico, sendo este gene significativamente expresso na linhagem rompida. Observou-se também um acentuado aumento na expressão do gene algU, nestas mesmas condições, na linhagem selvagem PAO1, com ausência de expressão na linhagem rompida. É possível concluir, dessa forma, que o gene PA0657 exerce participação importante no processo de regulação de resposta ao choque térmico e está relacionado com a conversão do fenótipo mucóide. / Submitted by Ana Guimarães Pereira (agpereir@ucs.br) on 2015-02-12T16:39:42Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Franciele Maria Zanol.pdf: 2049257 bytes, checksum: 659cf19a6ee79184c9f91b239ba09a19 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-02-12T16:39:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Franciele Maria Zanol.pdf: 2049257 bytes, checksum: 659cf19a6ee79184c9f91b239ba09a19 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, CAPES / A feature associated with the ability of Pseudomonas aeruginosa survive and dissemination in adverse conditions found in the environment and in hosts‘ organisms is a specific genes regulation of stress response, including heat shock event. The exposure of microorganisms to a high temperature environment results in the induction of synthesis os specific proteins, represent by chaperones and proteases, conferring an increase og the microbial cell viability under conditions considered lethal. . It is presumed that the PA0657 gene of P. aeruginosa O1 can be related to the induction or suppression of transcriptional process of genes that are involved in a response to heat shock. In this context, the aim of this work was to characterize the function of the PA0657 gene of P. aeruginosa O1. In this way, bioinformatic analyzes were performed and the gene was cloned and expressed in bacterial system, producing recombinant protein which was purified and enzymatically characterized. Moreover, the PA0657 gene of P. aeruginosa O1 strain was disrupted by homologous recombination. The wild type strain and the disrupted strain were submitted to a thermal stress and the expression of various genes associated with heat shock event could be evaluated by qRT -PCR. The results showed that the PA0657 recombinant protein was capable of degrading adenosine triphosphate (ATP) of Zn2+ dependent manner. It was also verified that the ruptured strain lost its ability to produce pyocyanin pigment when grown on cetrimide means and its mucoid phenotype. It was possible to find in computational analysis that the promoter region of the PA0657 gene is dependent on σ32. The gene expression analysis showed a decrease in expression of the rpoH gene in the wild type strain after heat shock, this gene is significantly expressed in the disrupted strain. A significant increase in expression of the algU gene was observed, on the wild type strain with absence of expression in the disrupted strain. Therefore, it was possible to conclude that the PA0657 gene cts in the regulatory process of thermal shock response and is related to the conversion of the mucoid phenotype.