Le gène metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1, ou MALAT1 code pour un long ARN non codant (lncRNA) dont la maturation aboutit à la formation de Malat1 nucléaire et d'un petit ARN non codant cytoplasmique, le MASCRNA. Même si les fonctions physiologiques de Malat1 et du MASCRNA restent largement inconnues, les niveaux de Malat1 sont, depuis sa découverte, associés aux processus tumoraux. En effet, il a été rapporté par de nombreuses études que les niveaux des transcrits de MALAT1 étaient augmentés dans tous les types de cancers et associés à un mauvais pronostic pour les patients. Or, la prolifération tumorale et la dissémination des métastases surviennent dans un milieu notamment hypoxique. Dans ce contexte, l'hypothèse générale de la présente thèse était que l'expression de Malat1 est modulée par l'hypoxie, et que la réponse tissulaire à l'hypoxie est altérée lorsque cette modulation est bloquée ou absente. En premier lieu, la voie de signalisation régissant l'expression de MALAT1 pendant l'hypoxie a été caractérisée par la technique de gène rapporteur. Dans des essais cellulaires, la modulation de la transcription de MALAT1 a été augmentée par l'hypoxie, et contrôlée par le facteur induit par l'hypoxie HIF-1α, lui-même activé par une cascade signalétique impliquant l'AMPK. Nous avons ensuite évalué l'importance de Malat1 dans la réponse à l'hypoxie, avec un focus particulier sur deux tissus dont les fonctions sont très sensibles à l'oxygène, soit le poumon, où Malat1 est fortement exprimé de façon constitutive, et le tissu adipeux brun, dont l'activité thermogénique dépend de l'oxygénation. Dans ces deux tissus, l'exposition de souris à l'hypoxie (10% O₂) a aussi augmenté les niveaux de Malat1. L'absence de Malat1 par invalidation génétique a protégé les poumons de l'hyperréactivité induite par l'hypoxie en augmentant le volume alvéolaire et l'extraction de l'oxygène. De plus, une corrélation négative entre les niveaux d'expression du MASCRNA et le déclin des fonctions respiratoires de patients atteints de maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC) a été observée, suggérant que la transcription accrue de MALAT1 est délétère pour la physiologie pulmonaire. Dans le tissu adipeux brun, autant l'hypoxie que l'absence de Malat1 ont favorisé le ralentissement de l'activité de la chaine respiratoire mitochondriale, suggérant que Malat1 stimule la thermogenèse. Par essais de gène rapporteur, nous avons démontré que Malat1 inhibe la dégradation de la région 3'UTR de Prdm16, un coactivateur transcriptionel essentiel à la réponse thermogénique du tissu adipeux brun. Ce mécanisme de stabilisation a augmenté les niveaux protéiques de Prdm16, et pourrait ainsi contribuer aux effets positifs de Malat1 sur le tissu adipeux brun. En conclusion, en s'appuyant sur les mécanismes déjà décrits dans la littérature, cette thèse démontre que l'hypoxie augmente les niveaux de Malat1, et établit des liens de causalités entre les phénotypes observés en absence de Malat1 et les fonctions potentielles de ce lncRNA dans la réponse tissulaire aux niveaux d'oxygène de l'organisme, notamment sur la physiologie pulmonaire ainsi que le métabolisme du tissu adipeux brun. Ce travail ouvre la voie à de nombreux travaux qui permettront d'affiner nos observations, mais également de mettre en lumière de nouvelles cibles thérapeutiques dans le contexte de la MPOC. / Metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1, MALAT1, is a conserved, long non-coding RNA (lncRNA) whose processing results in the formation of mature nuclear MALAT1 and small cytoplasmic MASCRNA. Although the physiological functions of MALAT1 and MASCRNA are unknown, MALAT1 has been associated with tumor development. Indeed, numerous studies reported that the levels of MALAT1 are increased in all types of cancers and associated with poor prognosis. Both tumor proliferation and metastasis involve hypoxic milieu and signaling. In this context, the main hypothesis of the present thesis was that hypoxia increases MALAT1 transcription, and that cellular and tissular responses to hypoxia are altered in the absence of Malat1. Using a gene reporter technique, we first found that MALAT1 expression was increased by hypoxia through the activation of the transcription factor hypoxia-inducible factor HIF-1α by AMPK signaling. We next evaluated in mice the contribution of Malat1 in the response to hypoxia, with special attention to two tissues notable sensibility to oxygen status, namely the lung, which constitutively expresses high levels of Malat1, and brown adipose tissue, a thermogenic organ driven by uncoupled respiration. In mice exposed to hypoxia (10% O₂), Malat1 expression was increased in both tissues. Genetic ablation of Malat1 protected mice against hypoxia-induced lung hyperresponsiveness through increased alveolar volume and enhanced oxygen extraction. In addition, a robust correlation between MASCRNA levels and the decline of lung function in patients with chronic obstructive pulmonary disease (COPD) was observed, suggesting that increased MALAT1 transcription is deleterious to lung physiology. In brown adipose tissue, Malat1 deficiency by itself resulted in hypometabolism, an effect similarly observed after exposure to hypoxia, suggesting a central role for Malat1 in mitochondrial activity. Using a gene reporter assay, we further found that Malat1 inhibited the degradation of the 3'UTR region of Prdm16, a transcriptional coactivator essential to the thermogenic program of brown adipose tissue. This stabilizing mechanism stimulated Prdm16 protein levels, which could have contributed to positive effects of Malat1 on this tissue in mice. In conclusion, hypoxia increased Malat1 expression and its absence in two tissues altered their adaptive responses to low oxygen levels. Thus, the work presented in this thesis highlighted causal links between the phenotypes observed in the absence of Malat1 and the potential functions of this lncRNA in tissue responses to hypoxia, notably on lung physiology and brown adipose tissue metabolism. Finally, although more mechanistic and translational studies are required to build upon our observations, our findings suggest new potential therapeutic targets against CODP.

L'interférence à l'ARN est un phénomène impliqué dans plusieurs processus biologiques, notamment dans l'intégrité génomique et le développement, qui est conservé dans l'évolution. Ce phénomène est induit par la présence d'un long ARNdb qui mène à la production de siARN (short-interfering ARN) d'environ 22 nucléotides de long qui sont parfaitement complémentaires à un ARNm cible. Ces siARN servent de guide aux protéines Argonautes qui utilisent leur activité catalytique pour cliver l'ARNm et ainsi diminuer son expression. Chez plusieurs organismes, notamment Caenorhabditis elegans, l'exposition à de l'ARN double-brin exogène permet la production de siARN. Par la suite, le signal de dégradation de l'ARNm ciblé se transmet de générations en générations sans que ces dernières n'aient été exposées à la molécule initiatrice par un mécanisme peu compris. Différentes études antérieures ont tenté de déterminer quels sont les facteurs physiques qui sont transmis aux générations subséquentes, mais ces études utilisent des transgènes comme cibles, ces derniers ayant été démontrés comme étant réprimés par des mécanismes indépendants de l'interférence à l'ARN induit par de l'ARN double-brin exogène. Le but du projet est donc de développer une méthode qui permet d'étudier ce phénomène dans un contexte endogène et de l'utiliser afin de déterminer quels facteurs moléculaires peuvent être transmis à la descendance selon le type de gamète (mâle ou femelle) et le type de tissu (somatique ou germinal) touché. En utilisant la méthode développée qui utilise comme cible un ARNm endogène qui possède une délétion silencieuse, l'étude a permis de déterminer que l'ARNm cible a besoin d'être présent chez le géniteur pour induire le processus de transmission de l'interférence à l'ARN à la descendance. De plus, l'étude a permis de déterminer qu'une accumulation de siARN double-brin chez le parent peut mener à une transmission à la descendance du signal de dégradation de l'ARNm et que cette transmission ne peut s'effectuer que si le parent hermaphrodite est exposé à la molécule d'ARN double-brin. En bref, cette étude a permis d'améliorer la compréhension de ce mécanisme épigénétique qu'est la transmission entre générations de l'interférence à l'ARN. / RNA interference is a phenomenon implicated in many biological processes, including genomic integrity and development, and it is conserved in evolution. This phenomenon is induced by the presence of double stranded RNA leading to the production of siRNAs (short-interfering RNAs) of about 22 nucleotides long that are perfectly complementary to a target mRNA. Those siRNAs guide Argonaute proteins to the target mRNA and use their catalytic activity to cleave the target and decrease its expression. In many organisms, including Caenorhabditis elegans, production of siRNAs by exposing cells to exogenous dsRNA induce a transmission of RNAi signal between generation without exposing progeny to initiator molecules by a poorly understood mechanism. Different studies have already tried to determine which physical factors can be transmitted to the next generation, but these studies have used transgenes as a mRNA target, who have been shown to be also repressed by a mechanism independent of RNA interference induced by a double-stranded RNA. Therefore the main purpose of the project is to develop a method who can be used to study this phenomenon in an endogenous context and to determine which molecular factors can be transmitted between generations depending on the gamete type (male or female) and the tissue type (somatic or germline tissue) targeted. Using the developed method which uses a mRNA that carries a silenced deletion mutation, the study has determined that the target mRNA must be present in the parent to induce transmission of RNA interference through generations. Also, the data has shown that a double-stranded RNA accumulation can lead to a transmission to the progeny of the mRNA degradation signal, but this transmission can only occur if the hermaphrodite parent is exposed to the double-stranded RNA. In short, this study helped to increase the understanding of this epigenetic mechanism that is the transmission between generations of RNA interference.

De récentes données suggèrent un rôle clé des longs ARNs non codants (lncRNAs) dans le développement et l’apparition de certaines maladies. Les lncRNAs se sont avérés difficiles à étudier en raison de leur faible niveau d’expression souvent tissu-spécifique, du manque de conservation de leur séquence, et du manque d’outils d’analyse spécifiques. Nous avons émis l’hypothèse que les méthodes d’étude des ARNs messagers peuvent être adaptées aux lncRNAs. Pour valider cette hypothèse, nos objectifs sont : 1-l’utilisation des nouvelles approches dérivées du système CRISPR/Cas9 pour activer et inhiber l’expression génique et 2-l’utilisation des méthodes conventionnelles de surexpression pour étudier les lncRNAs. Dans le cadre de cette étude, nous nous sommes concentrés sur un nouveau lncRNA, appelé Tuna (Tcl1 Upstream Neuron-Associated lncRNA). Ce lncRNA est nécessaire au maintien des cellules souches embryonnaires, mais aussi à leur différenciation vers le lignage neural. Résultats : la nouvelle approche CRISPR-a/i permet d’activer/inhiber le promoteur de Tuna et de réguler l’expression endogène de celui-ci. Ce système s’étant révélé efficace pour Tuna, cela suggère qu’il peut être appliqué à l’étude d’autres lncRNAs. D’autre part, la particularité de cet ARN est qu’il contient une région conservée entre les espèces d’environ 200 nucléotides, correspondant à un ORF pour un peptide de 48 acides aminés. En utilisant des méthodes conventionnelles de marquage par FLAG, on démontre que Tuna code pour ce peptide. Par ailleurs, en supprimant un site de liaison à la protéine HUR dans la région 3’UTR, on altère l’expression du peptide. Cela suggère que ce site est important pour la régulation de la traduction du peptide encodé par Tuna. En conclusion, nos résultats montrent que certaines méthodes d’étude des ARNs messagers sont transposables aux lncRNAs. Cependant, du fait des caractéristiques propres à ces derniers, d’autres approches sont à envisager pour mieux saisir leurs mécanismes. En perspective, ces méthodes vont permettre de mieux comprendre la fonction de Tuna dans les différents états cellulaires où il est exprimé.

La régulation de l’expression génétique est essentielle afin qu’un organisme puisse s’adapter aux changements environnementaux. Chez les bactéries, la régulation peut s’effectuer à plusieurs étapes de l’expression des gènes (transcription, stabilité de l’ARN, traduction, maturation et dégradation des protéines) et par des mécanismes impliquant différents types de molécules (ADN, ARN, protéines, métabolites ou ions inorganiques). Traditionnellement, les protéines se situaient au centre de ces mécanismes de régulation. On sait maintenant que certains ARN, dont les riborégulateurs, ont également un grand rôle à jouer dans ce processus. Un riborégulateur est un élément génétique retrouvé dans une région non-codante de certains ARN messagers (ARNm), qui peut lier directement un ligand spécifique afin de réguler l’expression de son transcrit. Chez Escherichia coli (E. coli), trois riborégulateurs lient la thiamine pyrophosphate (TPP). Un d’entre eux, le riborégulateur thiB, n’a toujours pas été étudié. On croit qu’il contrôlerait, au niveau de l’initiation de la traduction, l’expression de l’opéron thiBPQ encodant un transporteur ABC de la thiamine. De plus, un petit ARN nommé SroA a précédemment été identifié grâce à des techniques de séquençage d’ARN. SroA correspond à l’aptamère du riborégulateur thiB, mais aucun rôle ne lui a été attribué à ce jour. Le présent mémoire porte sur la caractérisation du riborégulateur thiB d’E. coli. Dans un premier temps, nous avons démontré que le riborégulateur est fonctionnel. Le mécanisme permettant la régulation génétique en cis est cependant plus complexe que seulement la régulation prédite au niveau traductionnel. Dans un second temps, nous avons utilisé deux approches différentes à l’échelle transcriptomique afin de vérifier si SroA régule l’expression de certains ARNm en trans. Plusieurs cibles potentielles découlent de cette étude. Une caractérisation préliminaire de certaines d’entre elles est présentée ici et devra être poursuivie par des travaux subséquents. Les résultats présentés ici suggèrent que le riborégulateur thiB régulerait l’expression de l’opéron thiBPQ (en cis) et d’autres gènes en trans.

Les viroïdes sont les pathogènes les plus simples connus à ce jour. Ils possèdent un génome d'ARN simple brin, circulaire, qui n'encode aucune protéine et qui n'est pas encapsidé. Malgré tout, ils sont capables d'infecter des plantes supérieures et de causer des symptômes suffisamment sévères pour amener d'importantes pertes économiques dans les domaines agro-alimentaire et horticole. Depuis quelques années, plusieurs études ont été réalisées pour mieux comprendre ces pathogènes obligatoires mais, jusqu'à maintenant, peu de données sont disponibles sur les petits ARN interférents (siARN) produits par les plantes à la suite d'une infection par un viroïde. Le but de ce travail est de recueillir le plus d'informations possible sur les siARN produits par le pêcher à la suite d'une infection par le viroïde de la mosaïque latente du pêcher (PLMVd). Les petits ARN non-codants de 18 à 26 nucléotides de plants de pêcher sains et infectés par PLMVd ont été clonés et séquencés.Les observations faites à partir de ces séquences montrent que seul le plant infecté produit des petits ARN homologues à PLMVd. Aussi, certaines régions du génome du viroïde semblent être plus enclines à produire des siARN. De plus, les deux polarités du génome de PLMVd semblent être susceptibles à l'interférence à l'ARN. Ensuite, certaines observations montrent que les molécules circulaires de PLMVd ainsi qu'un duplex d'ARN formé des deux polarités du génome de PLMVd sont des cibles potentielles de l'interférence à l'ARN. Enfin, à la suite de l'analyse des résultats, on peut supposer que les siARN homologues à PLMVd peuvent modifier l'expression de certains gènes végétaux. À la suite de ces observations et aux questions qu'elles ont soulevées, nous avons préparé une expérience de séquençage à haut débit des petits ARN d'un plant de pêcher sain et d'un plant infecté par PLMVd.Les résultats préliminaires montrent que le niveau d'expression de PLMVd et des petits ARN homologues à PLMVd varient selon les plants étudiés et selon le mois dans lequel les feuilles de pêcher ont été cueillies. L'ARN extrait des feuilles qui semblaient contenir la plus forte concentration de siARN a été utilisé pour les expériences suivantes.Les premiers tests pour la préparation des petits ARN pour le séquençage par la technologie Solexa d'Illumina montrent que le kit de préparation des petits ARN est efficace. En conclusion, ces résultats ouvrent la voie à un séquençage à haut débit des siARN de pécher, plus particulièrement ceux qui sont associés à l'infection par PLMVd. Ils permettent aussi d'énoncer certaines hypothèses qu'il sera intéressant de vérifier dans le futur.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2005. / Titre de l'écran-titre (visionné le 23 février 2006). Bibliogr.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2005. / Titre de l'écran-titre (visionné le 28 mars 2007). Bibliogr.

Les « terminal balls » qui constituent des complexes de maturation sont détectées à l’extrémité 5’-terminale des transcrits ribosomiques naissants dans tous les organismes eucaryotes inspectés à ce jour ; générant les images de référence en « arbres de Noël ». La compaction séquentielle des « terminal balls », à présent également dénommées « SSU-processome », reflète les étapes d’assemblage co-transcriptionnel des ribosomes. Au cours de ma thèse, j’ai développé une stratégie expérimentale basée sur l’immunoprécipitation de chromatine (ChIP) qui m’a permis de valider, et ce pour la première fois, in vivo la structure des branches des arbres de Noël (en particulier un rapprochement du « SSU-processome » à l’extrémité 5’- du gène encodant l’ARNr 25S). Notre stratégie nous permet également d’aborder la composition moléculaire des « arbres de Noël ». La biogenèse du ribosome est un processus complexe et dynamique dont la finalité est la synthèse et l’assemblage de 4 molécules d’ARN et de ~80 protéines ribosomiques dans un processus qui requiert l’intervention transitoire et concertée de non moins de 400 facteurs de maturation. D’une telle complexité a récemment émergé le concept de l’existence de modules pré-assemblés autonomes de facteurs de maturation. Dans le cas du « SSU-processome », les trois sous-complexes UTP-A, UTP-B, UTP-C ont d’ores et déjà été décrits. L’existence de tels sous-complexes renforce la notion d’un mécanisme d’assemblage hautement hiérarchisé. En effet, il s’est avéré que l’extrémité 5’- du transcrit naissant est initialement liée par le sous-complexe UTP-A dans une étape qui est un pré-requis indispensable au recrutement et à l’assemblage des autres composants du « SSU-processome ». Avec autant d’étapes distinctes dans le processus d’assemblage, la possibilité d’erreur est conséquente, d’où l’importance de l’existence de mécanismes de contrôles de qualité. Toutes les protéines constituant le « SSU-processome » sont requises au clivage des précurseurs d’ARN ribosomique. Préalablement à mon travail, les 7 sous-unités protéiques du complexe UTP-A avaient, en outre, spécifiquement été impliquées dans la synthèse de l’ARN, c’est-à-dire dans la fonction de l’ARN polymérase I. Ceci leur a conféré leur seconde appellation de tUTP, pour transcription UTP, et offert les prémices de l’existence d’une interface physique et fonctionnelle entre les machineries de synthèse et de maturation des ARNr. Au cours de ma thèse, j’ai démontré qu’il n’en est rien. Une inspection minutieuse m’a en effet révélé que les tUTP/UTP-A ne sont nullement requises à la synthèse des ARN ribosomiques mais bien à leur stabilité. Cette observation m’a mené à proposer que la cellule a développé au cours de l’évolution un mécanisme de contrôle de qualité par lequel elle s’assure de l’intégrité des étapes initiales d’assemblage (liaison du complexe UTP-A ). Mon postulat est qu’en l’absence de la liaison de ces facteurs de maturation précoces, les ARN sont rapidement dégradés par un mécanisme que nous avons dénommé « Death by Default (DBD) » par l’activité de surveillance nucléolaire exercée par le complexe de polyadényaltion TRAMP et d’exoribonucléases 3’-5’ l’ Exosome.

Thèse de doctorat : Sciences du vivant : Strasbourg 1 : 2007. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. p. 225-249.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2008. / Bibliogr. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.