Le mélanome est un cancer qui représente la grande majorité de la morbidité et de la mortalité causées par tout cancer de la peau en raison de son implication dans les métastases. Parmi plusieurs biomarqueurs rapportés, les récepteurs du domaine de la discoïdine (DDR) et la métalloprotéinase Matrix (MMP) sont également considérés comme des acteurs potentiels du mélanome. Des études récentes démontrent que les DDR et les MMP sont surexprimés dans les mélanomes de mauvais pronostic, ce qui nécessite le recours à des sondes théranostiques à biomarqueurs spécifiques. De nombreux progrès ont été réalisés pour réduire le risque associé au mélanome métastatique à l'aide d'anticorps monoclonaux traditionnels, mais les inconvénients tels que la complexité de la production, la variabilité d'un lot à l'autre, la courte durée de conservation, l'immunogénicité, la réactivité croisée et le coût élevé ne peuvent être négligés. Par conséquent, au cours des dernières années, les aptamères ont acquis un grand intérêt comme substitut d’anticorps pouvant être synthétisés chimiquement avec un faible coût de production et dépassant les limitations associées aux anticorps. Les aptamères sont de courts oligonucléotides à haute affinité et spécificité vis-à-vis de la molécule cible, développés par une méthode combinatoire appelée SELEX (Evolution systématique de ligands par enrichissement exponentiel). Au cours de ma thèse, nous avons réalisé une étude SELEX contre les biomarqueurs DDR1, DDR2 et HMMP14 sur la base de supports alternatifs pour le tri des candidats et le séquençage à haut débit. Un groupe d'aptamères a été sélectionné contre DDR1 et le meilleur candidat a ensuite été dopé pour effectuer davantage de tours de sélection contre DDR1. Finalement, un aptamère contre DDR1 a été sélectionné avec un Kd dans la gamme nanomolaire basse. Cet aptamère peut être utilisé comme outil théranostique dans les études sur le mélanome associé à DDR1. Comme les aptamères présentent un avantage en termes de conjugaison et de modifications aux positions désirées, nous visons en outre à conjuguer cet aptamère avec des nanoparticules pour des études in vivo. / Melanoma is a cancer that accounts for the vast majority of morbidity and mortality caused by any skin cancer due to its involvement in metastasis. Among several reported biomarkers, Discoidin Domain Receptors (DDRs) and Matrix metalloproteinase (MMPs) are also considered as potential actors in melanoma. Recent studies demonstrate that DDRs and MMPs are overexpressed in melanoma with poor prognosis which demands the need of biomarkers specific theranostics probes. Though many advances has been made in order to reduce the risk associated with metastatic melanoma with the help of traditional monoclonal antibodies, but the drawbacks like production complexity, batch to batch variability, short shelf life, immunogenicity, cross reactivity and high cost cannot be neglected. Therefore in recent years, aptamers have gained high interests as a substitute of antibodies that can be synthesized chemically with low production cost and overcomes the limitations associated to antibodies. Aptamers are short oligonucleotides with high affinity and specificity against its target molecule, raised by a combinatorial method known as SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment). During my thesis, we performed a SELEX against DDR1, DDR2 and HMMP14 biomarkers based on alternative supports for candidates sorting and high throughput sequencing. A group of aptamers were selected against DDR1 and the best candidate was further doped to perform more rounds of selection against DDR1. Finally an aptamer against DDR1 was selected with a Kd in low nano-molar range. This aptamer can be used as a theranostics tool in DDR1 associated melanoma studies. As aptamers have an advantage of conjugation and modifications at desired positions so we further aim to conjugate this aptamer with nanoparticles for In-vivo studies.

La recherche d'occurrences de gènes d'ARN dans les séquences<br /> génomiques est un problème dont l'importance est renouvelée par la<br /> découverte récente de très nombreux ARN fonctionnels, opérant<br /> souvent en interaction avec d'autres molécules.<br /><br />Le formalisme des réseaux de contraintes est approprié à cette problématique aussi bien sur le plan de la modélisation que sur les développements algorithmiques qu'il permet de proposer. <br /><br /> Après une analyse et une comparaison des outils existants plongés dans le cadre des réseaux de contraintes, nous<br /> montrons comment l'utilisation conjointe des réseaux de contraintes,<br /> des techniques de résolution associées et des algorithmes et<br /> structures de données du "pattern matching" permet de modéliser et de<br /> rechercher efficacement des motifs structurés en interaction (faisant<br /> intervenir plusieurs textes génomiques simultanément).

Chez les rétrovirus, la production des protéines virales dépend de l'expression d'un transcrit sens pleine longueur, initié dans le LTR5' et épissé de façon alternative. Des études ont récemment mis en évidence l'existence d'un nouveau type de transcrit antisens, initié dans le LTR3' de certains rétrovirus humains (VIH-1 et HTLV-1). Chez le virus HTLV-1, plusieurs études ont permis l'identification de deux formes d'épissage du transcrit antisens ainsi que la caractérisation d'une nouvelle protéine virale, nommée HBZ (HTLV-1 bZIP factor). Cette protéine se localise au noyau et régule négativement la transcription virale en interagissant avec des facteurs de transcription contenant un motif leucine zipper. Cette étude a pour objectif de caractériser la transcription antisens des rétrovirus humains HTLV-2, HTLV-3 et HTLV-4. Des études de RT-PCR ont permis de détecter un transcrit antisens chez des cellules 293T transfectées par l'ADN proviral des rétrovirus HTLV-2, -3 et -4. Le séquençage des signaux obtenus a confirmé la présence d'épissage dans chacun des transcrits étudiés. Des sites d'initiation de la transcription ont pu être identifiés par des analyses de 5' RACE sur un clone du virus HTLV-2. Un site fonctionnel de polyadénylation a été identifié chez un clone de ces trois rétrovirus. La comparaison des séquences de la protéine HBZ et des ORF antisens des rétrovirus HTLV-2, -3 et -4 démontre que le motif leucine zipper ne semble pas présent chez ces derniers. Dans le but de permettre l'expression et la détection des protéines antisens, les parties codantes des transcrits antisens des rétrovirus HTLV-2, -3 et -4 ont été clonées dans un vecteur d'expression contenant une étiquette Myc. L'analyse des cellules transfectées par microscopie confocale a permis de détecter la protéine antisens de HTLV-3 (APH-3) à la fois dans le noyau et dans le cytoplasme ainsi que les protéines antisens de HTLV-2 et -4 (APH-2 et APH-4) majoritairement dans le noyau. La co-transfection des vecteurs d'expressions de APH-2, APH-3 et APH-4 en présence des vecteurs exprimant les protéines virales Tax1, Tax2 ou Tax3 en plus du vecteur contenant le LTR de HTLV-1 ou de HTLV-2 en amont du gène de la luciférase dans des cellules 293T, a permis de mettre en évidence une inhibition de l'activation de la transcription virale dépendante de Tax par ces nouvelles protéines antisens. Finalement, afin de caractériser l'activité promotrice antisens de ces rétrovirus, le gène rapporteur de la luciférase a été inséré dans les deuxièmes exons de APH-3 et APH-4, compris dans les vecteurs contenant la portion 3' des génomes proviraux de HTLV-3 et -4. La transfection de ces constructions dans des cellules lymphocytaires humaines (Jurkat E6.1), suivie d'une stimulation par une série d'agents activateurs de ces dernières, a permis d'observer une modulation de la transcription antisens. Ces recherches portant sur la transcription antisens des rétrovirus humains ont permis de mettre en évidence que les transcrits antisens des rétrovirus HTLV-2, -3 et -4 ont la capacité de coder pour des nouvelles protéines virales. Les analyses de séquences effectuées ainsi que les observations en microscopie confocale laissent croire que ces protéines pourraient jouer des rôles différents de ceux précédemment attribués à la protéine HBZ. De plus amples études seront nécessaires afin d'identifier les rôles de ces protéines nouvellement découvertes dans le cycle de réplication viral. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : APH, Rétrovirus, HTLV, Transcription antisens, HBZ.

La protéine nucléolaire Dbp4 est impliquée dans la biogenèse de l'ARN ribosomique (ARNr) 18S chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Elle présente une interaction génétique avec le petit ARN nucléolaire (snoRNA) U14. Dbp4 est une RNA hélicase de la famille «DEAD-box» et elle est hautement conservée dans l'évolution. Son homologue chez l'humain (DDX10) serait impliqué dans certains types de cancers. La plupart des «DEAD-box » RNA hélicases sont essentielles à la croissance de la levure indiquant ainsi une absence de redondance de leurs fonctions sur leurs substrats spécifiques. De façon plus intéressante, il a été démontré que plusieurs hélicases seraient aussi impliqués dans la biogenèse des ribosomes. Les protéines «DEAD-box» sont caractérisées par la présence de neuf motifs conservés formant la région centrale catalytique de l'enzyme. Cette dernière est flanquée par deux extensions de composition variable aux extrémités N- et C-terminales. Ces extensions joueraient un rôle déterminant dans la reconnaissance du substrat et/ou la liaison de cofacteurs. Nos analyses bioinformatiques prédisent la présence d'un domaine d'interaction protéine-protéine appelé domaine «coiled-coil» (CC) à chacune des extrémités N-et C-terminale. Notre hypothèse est que Dbp4 serait associé à des protéines par l'intermédiaire de ces domaines CC. Afin d'identifier les partenaires protéiques potentiels de Dbp4, nous avons utilisé le système double hybride chez la levure en criblant une banque génomique de Saccharomyces cerevisiae. Parmi les clones positifs, nous avons identifié la présence des protéines Ifh1, Rrn5, Rps20, Rps2 et Msb2. Curieusement à l'exception de Msb2, toutes ces protéines sont impliquées dans la biogenèse des ribosomes et renferment des domaines CC comme Dbp4. Cela suggère que ces protéines sont des partenaires potentiels de Dbp4 pour la biogenèse des ribosomes. Pour confirmer ces résultats de double hybride, nous avons réalisé des tests in vivo par co-immunoprécipitation dont les résultats préliminaires n'ont pas été concluants. Des études complémentaires seront nécessaires afin d'éclaircir ces résultats. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Saccharomyces cerevisiae, Nucléole, Ribosomes, RNA hélicases, Dbp4.

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Antecedentes: El virus Encefalomiocarditis (V-EMC) pertenece al género Cardiovirus; familia Picornaviridae. El virus EMC infecta muchas especies de animales incluyendo cerdos, roedores, ganado vacuno, elefantes, mapaches, marsupiales y primates como monos, chimpancés y humanos. Ratas y ratones son hospederos naturales del virus y pasa a otras especies por transmisión fecal-oral. En roedores, V-EMC causa lesiones en el corazón, páncreas, sistema nervioso central. Objetivos: En el presente trabajo se presento el rol potencial que juegan lo roedores como reservorios en la transmisión del virus EMC en el Perú. Materiales y Métodos: Muestras sanguíneas de 497 roedores pertenecientes a 23 especies (298 Murinae y 199 Sigmodontinae) capturados en 10 diferentes departamentos del Perú. Cada muestra sanguínea fue procesada para buscar anticuerpos de tipo IgG contra V-EMC mediante el Ensayo Inmuno Enzimático (EIA) usando antígenos preparados del virus recuperado de uno de los casos humanos en el Perú (IQD 7626). Los positivos fueron evaluados por la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Resultados: de los 497 roedores, un total de 30 muestras de 5 especies fueron positivas: 4 (29%) de 14 Rattus norvegicus, seguido por 19 (13%) de 151 R. rattus, 5(4%) de 133 Mus musculus, 1 (3.8%) de 26 Phyllotis limatus y 1 (4%) de 25 Akodon molli. Los roedores positivos hallados fueron en los departamentos: Cajamarca, Lambayeque, Madre de Dios, Moquegua, Tacna, Tumbes y Piura. Solo 2 de 199 roedores del Nuevo mundo evaluados mostraron evidencia de infección con V-EMC. / Antecedents: Encephalomyocarditis virus (EMCV) belongs to the genus Cardiovirus; family Picornaviridae. The EMC virus infects many animal species including pigs, rodents, cattle, elephants, raccoons, marsupials, and primates such as baboons, monkeys, chimpanzees and humans. Rats and mice are the natural hosts of the virus, passing the virus to other species through fecal-oral transmission. In rodents, EMCV causes lesions in the heart, pancreas and central nervous system. Objectives: Herein is presented findings from our investigation of the potential role played by rodents as a reservoir for the transmission of the EMC virus in Peru. Materials and methods: We tested serum from 497 rodents representing 23 species (298 Murinae and 199 Sigmodontinae) captured from 10 different departments of Peru. Each serum specimen was tested for IgG class antibodies to ECMV by enzyme immunoassay (EIA) using antigen prepared from virus recovered from a human case (IQD 6726). All positives were evaluated by PCR test. Results: From 497 rodents a total of 30 sera from 5 species were positive: 4 (29%) of 14 Rattus norvegicus, followed by 19 (13%) of 151 R. rattus, 5(4%) of 133 Mus musculus, 1 (3.8%) of 26 Phyllotis limatus and 1 (4%) of 25 Akodon molli. Positive rodents were collected from 7 departments: Cajamarca, Lambayeque, Madre de Dios, Moquegua, Tacna, Tumbes and Piura. Only 2 of the 199 New-world rodents tested showed evidence of EMCV infection.

Thèse de doctorat : Sciences de la vie : Lyon, École normale supérieure (sciences) : 2006. / Bibliogr. p. 159-179.

Thèse de doctorat : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie : Strasbourg 1 : 2007. Thèse de doctorat : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie : Université M. V. Lomonossov, Moscou : 2007. / Thèse soutenue en co-tutelle. Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. p. 58-69.

Thèse doctorat : Sciences de la Vie et de la Terre : Strasbourg 1 : 2006. / Thèse soutenue sur un ensemble de travaux. Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. 7 p.

Thèse doctorat : Aspects Moléculaires et Cellulaires de la Biologie : Strasbourg 1 : 2006. Thèse doctorat : Aspects Moléculaires et Cellulaires de la Biologie : M. Lomonossov - Moscou - Russie : 2006. / Thèse soutenue sur un ensemble de travaux. Thèse soutenue en co-tutelle. Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. 9 p.