Thèse de doctorat : Sciences du vivant. Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie : Strasbourg 1 : 2008. Thèse de doctorat : Sciences du vivant. Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie : Université d'Abomey-calavi : 2008. / Thèse soutenue en co-tutelle. Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. p. 227-252.

Thèse de doctorat : Sciences du Vivant. Biologie cellulaire et moléculaire des Plantes : Strasbourg 1 : 2007. / Thèse soutenue sur un ensemble de travaux. Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. 17 p.

La chimiokine monocyte-chemoattractant protein-1 (MCP-1 ou CCL2) est un neuromodulateur de l'influx nociceptif au sein du système nerveux. Son activité biologique est attribuée à l'activation du récepteur couplé aux protéines G, CCR2. Le couple CCL2/CCR2 joue un rôle important dans la genèse et le maintien de la transmission nociceptive en contidition de douleur chronique. L'ARN interférent est un outil de recherche grandement utilisé dans la découverte de nouvelle cible thérapeutique touchant les désordres du système nerveux. Son potentiel thérapeutique a aussi été investigué dans diverses études cliniques et demeure controversé. Les Dicer-substrate siRNA (DsiRNA) sont des molécules synthétiques d'ARNi qui ont été développées afin d'améliorer les paramètres pharmacologiques des siRNA. Ils ont une meilleure efficacité in vitro et in vivo à faible dose ce qui limite les effets indésirables. Ces performances s'expliquent par la longueur des DsiRNA; un duplex linéaire asymétrique de 27 nucléotides de long plutôt que de 21 mers pour les siRNA classiques. Ce mémoire présente les résultats de recherche du développement des DsiRNA sélectifs pour la cible de l'ARN messager du récepteur rCCR2 et de leur application dans la prévention de la douleur aiguë. Pour cette étude, dix DsiRNA ayant des séquences différentes ont été synthétisées puis validées in vitro. Basés sur leur performance à taire l'expression du récepteur CCR2, deux duplex ont été retenus (933 & 1049). Leur propriété a été optimisée par l'ajout de deux motifs de méthylation (2'OMe) distincts nommés M7 et Evader le long de leur séquence. Les DsiRNA anti-CCR2 ont ensuite été testés in vivo dans un modèle de douleur aiguë induit par l'injection spinale de CCL2 exogène (1µg). Pour cette étude, deux injections de DsiRNA (5µg, i.t.) couplé à l'agent de transfection peptidique Transductin ont été administrées à 24h d'intervalle à des rats sains. Au troisième jour, le modèle allodynique aiguë a été induit. Les résultats du von fry dynamique ont montré que les DsiRNA anti-CCR2 testés ont prévenu 100 % de l'allodynie mécanique induit par le modèle. Aussi, les résultats de qPCR ont montré que 72 h suivant la première administration des DsiRNA, l'effet d'interférence de l'ARNm était toujours observable dans les structures des ganglions de la racine dorsale. Les niveaux d'expression de rCCR2 étaient 50 % plus bas chez les animaux traités au DsiRNA (933 et 1049) que chez les animaux en douleur aigu non traités. Les niveaux de CCL2 étaient également abaissés, suggérant ainsi que l'effet anti-allodynique des DsiRNA passe par le blocage de la boucle d'autorégulation du couple CCL2/CCR2 en condition douloureuse.

Les microARNs (miARNs) participent à la régulation du destin et de la différenciation cellulaire. La littérature fait état d'une variété de miARNs exprimés dans le placenta dont plusieurs sont exprimés uniquement dans les trophoblastes. Par contre, peu de chercheurs ont exploré les fonctions des miARNs dans les cellules placentaires. Dans cette étude, nous avons mis au point une approche fonctionnelle reposant sur l'inhibition d'une enzyme impliquée dans la maturation des miARNs afin d'évaluer l'implication de ceux-ci dans la régulation de la différenciation des trophoblastes in vitro. Ainsi, grâce à la technologie de I'ARNi, l'expression protéique de l'enzyme Drosha a été inhibée jusqu'à 80% dans les choriocarcinomes de la lignée BeWo. Suite à l'inhibition de Drosha, une augmentation significative du taux de fusion cellulaire a été mesurée, mais celle-ci n'a pas été accompagnée d'une augmentation de la sécrétion d'hCG par les cellules BeWo. L'activité globale des miARNs favorise donc le maintien des CT dans un état prolifératif. Des analyses de qRT-PCR subséquentes ont révélé que l'augmentation de la fusion cellulaire mesurée était accompagnée d'un accroissement de l'expression du transcrit de Syncytine-2, une protéine fusiogène connue. Des analyses in silico réalisées à l'aide des logiciels libres MiRanda et TargetScan ont dévoilé que le transcrit de Syncytine-2 serait la cible d'une vingtaine de miARNs dont plusieurs sont membres des familles miR-17, miR-515 et miR-15. En conclusion, cette étude a permis de confirmer que les miARNs ont un rôle essentiel dans la régulation de la différenciation morphologique des cellules BeWo in vitro. Il reste cependant à élucider les mécanismes moléculaires exacts par lesquels les miARNs participent à la différenciation des cellules placentaires. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : placenta, trophoblaste, différenciation, microARNs, fusion, Syncytine-2.

Thèses (Ph.D.)--Université de Sherbrooke (Canada), 1999. / Titre de l'écran-titre (visionné le 20 juin 2006). Publié aussi en version papier.

Thèse (M.Sc.) -- Université Laval, 1997. / Bibliogr.: f. 76-85. Publ. aussi en version électronique.

Thèse (M.Sc.) -- Université Laval, 1997. / Bibliogr.: f. 75-91. Publié aussi en version électronique.

Antecedentes: El virus Encefalomiocarditis (V-EMC) pertenece al género Cardiovirus; familia Picornaviridae. El virus EMC infecta muchas especies de animales incluyendo cerdos, roedores, ganado vacuno, elefantes, mapaches, marsupiales y primates como monos, chimpancés y humanos. Ratas y ratones son hospederos naturales del virus y pasa a otras especies por transmisión fecal-oral. En roedores, V-EMC causa lesiones en el corazón, páncreas, sistema nervioso central. Objetivos: En el presente trabajo se presento el rol potencial que juegan lo roedores como reservorios en la transmisión del virus EMC en el Perú. Materiales y Métodos: Muestras sanguíneas de 497 roedores pertenecientes a 23 especies (298 Murinae y 199 Sigmodontinae) capturados en 10 diferentes departamentos del Perú. Cada muestra sanguínea fue procesada para buscar anticuerpos de tipo IgG contra V-EMC mediante el Ensayo Inmuno Enzimático (EIA) usando antígenos preparados del virus recuperado de uno de los casos humanos en el Perú (IQD 7626). Los positivos fueron evaluados por la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Resultados: de los 497 roedores, un total de 30 muestras de 5 especies fueron positivas: 4 (29%) de 14 Rattus norvegicus, seguido por 19 (13%) de 151 R. rattus, 5(4%) de 133 Mus musculus, 1 (3.8%) de 26 Phyllotis limatus y 1 (4%) de 25 Akodon molli. Los roedores positivos hallados fueron en los departamentos: Cajamarca, Lambayeque, Madre de Dios, Moquegua, Tacna, Tumbes y Piura. Solo 2 de 199 roedores del Nuevo mundo evaluados mostraron evidencia de infección con V-EMC. / Antecedents: Encephalomyocarditis virus (EMCV) belongs to the genus Cardiovirus; family Picornaviridae. The EMC virus infects many animal species including pigs, rodents, cattle, elephants, raccoons, marsupials, and primates such as baboons, monkeys, chimpanzees and humans. Rats and mice are the natural hosts of the virus, passing the virus to other species through fecal-oral transmission. In rodents, EMCV causes lesions in the heart, pancreas and central nervous system. Objectives: Herein is presented findings from our investigation of the potential role played by rodents as a reservoir for the transmission of the EMC virus in Peru. Materials and methods: We tested serum from 497 rodents representing 23 species (298 Murinae and 199 Sigmodontinae) captured from 10 different departments of Peru. Each serum specimen was tested for IgG class antibodies to ECMV by enzyme immunoassay (EIA) using antigen prepared from virus recovered from a human case (IQD 6726). All positives were evaluated by PCR test. Results: From 497 rodents a total of 30 sera from 5 species were positive: 4 (29%) of 14 Rattus norvegicus, followed by 19 (13%) of 151 R. rattus, 5(4%) of 133 Mus musculus, 1 (3.8%) of 26 Phyllotis limatus and 1 (4%) of 25 Akodon molli. Positive rodents were collected from 7 departments: Cajamarca, Lambayeque, Madre de Dios, Moquegua, Tacna, Tumbes and Piura. Only 2 of the 199 New-world rodents tested showed evidence of EMCV infection. / Tesis

Existen genes que, según las variantes que se presentan en la naturaleza,pueden ser permisivos o protectores frente al alcoholismo. El gen ALDH2 eshabitualmente permisivo (alelo ALDH2*1) porque codifica la enzimadeshidrogenasa aldehídica mitocondrial la cual cataliza la oxidación delacetaldehído a acetato en la vía degradativa del etanol. Este gen tiene unsegundo alelo protector, ALDH2*2, que da origen a una enzima inactiva,impidiendo la oxidación del acetaldehído y desencadenando en los individuosportadores un aumento en los niveles plasmáticos de acetaldehído de hasta 20veces sobre lo normal. Estos individuos sienten malestares físicos comomareos, taquicardia y náuseas al consumir alcohol lo que les provoca unaaversión frente al consumo. Siendo el alelo ALDH2*2 un gen protector frente al alcoholismo, producir una disminución de la actividad enzimática es una buena estrategia terapéutica frente a la enfermedad. Un tratamiento farmacológico habitual para el alcoholismo es generar una aversión al consumo de alcohol con disulfiram. Este fármaco inactiva eficazmente la deshidrogenasa aldehídica mitocondrial (ALDH2), pero es muy tóxico. Una alternativa terapéutica es imitar el efecto del disulfiram silenciando el mRNA de la ALDH2 con ribozimas, RNAs catalíticos pequeños capaces de disminuir la síntesis proteica por ocupación y/o degradación del mRNA. Se ensayaron ribozimas de horquilla y martillo dirigidas hacia un mismo blanco del mRNA de la ALDH2 en células de hepatoma de rata en cultivo, dado que el hígado es el órgano más importante en la degradación del etanol. Se lipofectaron células H4-II-E-C3 con plasmidios portadores de genes de ribozimas y se midió la actividad de la ALDH2 espectrofotométricamente en extractos celulares. Se usaron ribozimas control para determinar posibles efectos de antisentido. La ribozima de horquilla (RzCG20), clonada en el vector pAC-CMV y codificada en un gen que posee el promotor del citomegalovirus y la señal de poliadenilación del virus SV40, disminuyó en 42 % (p<0,005) la actividad de la ALDH2 en las células H4-II-E-C3, siendo el 44 % del efecto adjudicable a bloqueo del mRNA. En cambio, la ribozima de horquilla clonada en el vector pAAV-CMV y codificada en un gen cuya señal de poliadenilación es la de la hormona del crecimiento humana, disminuyó en 36 % (p<0,005) la actividad de la ALDH2 en las células en cultivo, siendo el 64 % del efecto adjudicable a bloqueo del mRNA. La ribozima de martillo redujo sólo en 20% la actividad de la ALDH2, efecto dado exclusivamente por bloqueo del mRNA. Efectuando correcciones con el tiempo de vida media de la enzima se estima que el porcentaje de disminución del 42 % de la actividad de la ALDH2 es de al menos 56% al usar el gen de una ribozima de horquilla anti ALDH2. No se corrigió por el porcentaje de células H4-II-E-C3 transfectadas debido a la imposibilidad de obtener una estimación razonable usando el gen de la eGFP como reportero. Sin embargo, el porcentaje mínimo (56 %) concuerda con que en células 293 derivadas de riñón de embrión humano, cuyo porcentaje de transfección es cercano al 70 %, la ribozima disminuyó en 68 % (p<0,005) la actividad de la ALDH2 únicamente por acción antisentido. Buscando alcanzar un 100 % de transfección se lipofectaron células H4-II-E-C3 con plasmidios derivados del pCEP4 codificantes de las ribozimas de horquilla y su control. Este vector, que otorga permanencia y segregación divisional, mostró efectos tóxicos sobre las células de manera que no se pudo evaluar el efecto de la ribozima de horquilla en un cultivo celular homogéneo. Los resultados de este trabajo de tesis muestran que la ribozima de horquilla RzCG20, dirigida a los nucleótidos 1553 a 1569 del mRNA de la ALDH2 de rata, es un buen candidato para experimentos in vivo enfocados hacia el desarrollo de un fármaco génico para el alcoholismo.

En organismos eucariontes, el inicio de la síntesis de proteínas comienza con el reclutamiento de la subunidad 40S del ribosoma al mRNA. Sin embargo, dependiendo de cómo se efectúe este reclutamiento, el inicio de la traducción puede ser dependiente o independiente de la estructura 5’cap. El mecanismo cap-dependiente se basa en el reconocimiento de la estructura cap (7mGpppN), presente en el extremo 5’ de todos los mRNA, por el complejo de iniciación eIF4F. El complejo eIF4F está constituido por tres proteínas: eIF4E, la proteína de unión al cap; eIF4A, una RNA helicasa ATP dependiente y la proteína de andamiaje, eIF4G. La subunidad 40S ribosomal es reclutada al mRNA como parte de un complejo formado por eIF2-GTP/Met-tRNAi, eIF1A y eIF3. El factor de iniciación eIF4G cumple la función de proteína puente entre la subunidad 40S del ribosoma (vía eIF3) y el mRNA (vía eIF4E). Luego del reclutamiento de la subunidad 40S ribosomal en la vecindad de la estructura cap, el complejo de iniciación migra en dirección 5’ a 3’ hasta encontrar un codón de inicio de la síntesis de proteína, AUG, en un contexto óptimo. El estudio del mecanismo de traducción de los mRNA de la familia Picornaviridae, los cuales carecen de estructura 5’cap, permitió la caracterización de un mecanismo alternativo de iniciación de la síntesis de proteína. El mecanismo de inicio de la traducción en los mRNA de Picornavirus está mediado por regiones de RNA altamente estructuradas que son capaces de reclutar la subunidad 40S ribosomal de manera independiente a los extremos del mRNA. Estas estructuras de RNA se denominaron sitios internos de entrada de ribosomas, IRES (por sus siglas en inglés). Desde su caracterización inicial en los mRNA de la familia Picornaviridae, la existencia de IRES se ha extendido a otras familias virales incluyendo a la familia Retroviridae. El virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH-1) pertenece al género Lentivirus de la familia Retroviridae. El genoma de VIH-1 está constituido por dos hebras idénticas de un RNA de cadena simple de polaridad positiva, unidas entre si por enlaces no covalentes. El mRNA de VIH-1 posee cap, 3’poli(A) y dos elementos IRES, el primero, IRES-1, en su región 5’ no traducida (5’UTR) y el segundo en su región codificante para la proteína viral Gag (IRES-40K). Este trabajo se focalizó en el estudio de la función del IRES-1 de VIH-1 partiendo del postulado que a diferencia de otros mRNAs virales que poseen un elemento IRES, y sólo pueden iniciar la traducción de manera IRES dependiente, el mRNA de VIH-1 posee la capacidad de iniciar la síntesis de proteína de manera dual, es decir, de manera dependiente y/o independiente de la estructura cap. Este trabajo establece que el mRNA completo de VIH-1 puede iniciar su traducción utilizando un mecanismo tanto dependiente como independiente de su estructura 5’cap. En este contexto se establece que el mRNA de VIH-1 comparte características funcionales descritas sólo para mRNA celulares, diferenciándose de manera importante de los otros mRNA virales que poseen un elemento IRES que inician su traducción exclusivamente de manera dependiente de IRES.