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Identification et caractérisation d'une protéine comme inhibiteur général de la transcription réalisée par l’ARN Polymérase III humainePerreau-Morillon, Pauline 18 December 2009 (has links)
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Caractérisation de la régulation de la transcription par l'ARN polymérase III chez Saccharomyces cerevisiae / Characterization of RNA polymerase III transcription regulation in Saccharomyces cerevisiaeTavenet, Arounie 10 November 2011 (has links)
L’ARN polymérase III synthétise de nombreux petits ARN non traduits, dont les ARNt et l’ARNr 5S, essentiels à la croissance de toute cellule. Dans ce travail, nous nous sommes intéressés à la régulation de la transcription par l’ARN polymérase III chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Nous avons détecté Sub1 sur les gènes de classe III in vivo. Nous avons également observé que Sub1 est capable de stimuler la transcription par l’ARN III reconstituée in vitro avec les facteurs TFIIIB et TFIIIC recombinants et avec l’ARN Pol III purifiée. Sub1 stimule deux étapes de la transcription : l’initiation et la réinitiation facilitée. Des expériences supplémentaires nous montrent que la protéine interagit directement avec TFIIIB et TFIIIC. Enfin, nous avons pu constater que la délétion de Sub1 dans la levure conduit à une diminution de la transcription par l’ARN Pol III en phase exponentielle de croissance. Par la suite, nous avons cherché à déterminer quel lien pouvait exister entre l’activateur Sub1 et le répresseur Maf1 de la transcription par l’ARN Pol III. Enfin, nous avons également souhaité identifier d’autres éléments pouvant interagir avec la protéine Sub1 au cours de sa fonction de régulateur. / RNA polymerase III synthetizes many small untranslated RNA, including tRNA and 5S rRNA which are essential to cell growth. In this work, we took an interest in RNA polymerase III transcription regulation in the baker’s yeast, Saccharomyces cerevisiae. We have detected Sub1 on all class III genes in vivo. We also observed that Sub1 is able to stimulate RNA polymerase III transcription which has been reconstituted in vitro with TFIIIB et TFIIIC recombinants factors and purified RNA polymerase III. Sub1 stimulates two steps of RNA polymerase III transcription : initiation and facilitated reinitiation. Supplementary experiments established that Sub1 directly interacts with TFIIIB and TFIIIC transcription factors. Finally, we showed that Sub1 deletion in yeast leads to a decrease in RNA polymerase III transcription during exponential phase. Then, we tried to determine which link could exist between Sub1, the activator, and Maf1, the repressor of RNA polymerase III transcription. Furthermore, we attempted to identify other elements which could interact with Sub1 during transcription regulation.
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Etude structurale sur les sous-unités τ60/τ91 du facteur de transcription IIIC de la levure.Mylona, Anastasia 18 July 2005 (has links) (PDF)
TFIIIC est un facteur de transcription de classe III qui se lie spécifiquement et de façon stable sur les boîtes A et B des promoteurs des gènes de l'ARNt. TFIIIC est composé de 6 sous-unités: τ138, τ131, τ95, τ91, τ60 et τ55. Ce travail présente la structure du complexe entre τ60 et la partie C-terminale de τ91 (Δτ91) qui a été résolue à 3.2 Å. La structure comporte trois régions. a) Δτ91 qui est un β-propeller; b) une partie N-terminale de τ60 qui est aussi un β-propeller et qui se trouve entre Δτ91 et c) le domaine C-terminal de τ60, qui a un nouveau rempliement. L'interaction entre Δτ91 et τ60 est formée par les deux β-propellers et la partie C-terminale de τ60 est complètement indépendante. Cette nouvelle interaction β-propeller - β-propeller apparaît importante pour l'assemblage d'un complexe τB stable, capable de se fixer à l'ADN. Nos résultats donnent des informations sur le mécanisme d'assemblage du complexe τB et sa liaison à l'ADN.
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Etude fonctionnelle des sous-unités hRPC62 et hRPC39 de l’ARN Polymérase III humaine / Functional study of human RNA Polymerase III subunits hRPC62 and hRPC39El Ayoubi, Leyla 17 January 2014 (has links)
Dans les cellules eucaryotes, la transcription de l’ADN nucléaire est effectuée grâce à trois ARN Polymérases ADN dépendantes (Pol). La Pol I transcrit les ARN ribosomaux, la Pol II produit essentiellement des ARN messagers et des micro ARN alors que la Pol III transcrit des petits ARN non traduits impliqués dans une variété de processus cellulaires essentiels tels que la traduction, l’épissage ou la régulation de la transcription. L’ARN Polymérase III humaine est un complexe enzymatique constitué de 17 sous-unités dont la plupart sont apparentées à des sous-unités de la Pol I et/ou la Pol II. Une de ces sous-unités, hRPC32 est présente sous forme de deux paralogues α et β codés par deux gènes différents où hRPC32β est exprimée de façon ubiquitaire alors que hRPC32α est exprimée spécifiquement dans les cellules transformées ou non différenciées. Au sein de la Pol III, hRPC32α/β, hRPC62 et hRPC39 forment un sous-complexe ternaire stable dissociable de l’enzyme. Ces trois sous-unités sont spécifiques à la Pol III et sont impliquées dans l’étape d’initiation de la transcription. L’objectif de ce travail de thèse est d’éclaircir les mécanismes de fonctionnement du sous-complexe hRPC62-hRPC39-hRPC32α/β. Le travail réalisé a permis, dans un premier temps, de cartographier les domaines d’interaction entre la sous-unité hRPC62 et les deux paralogues α et β de la sous-unité hRPC32. Ensuite, nous avons mené une analyse biochimique des activités enzymatiques des protéines recombinantes de hRPC62 et hRPC39. Cette analyse a montré que hRPC62 possède des homologies fonctionnelles avec TFIIEα, un facteur de transcription de l’ARN Polymérase II récemment décrit comme étant un homologue structural de la sous-unité hRPC62. Ces données supportent le modèle suggérant que certaines sous-unités des ARN Polymérases peuvent être considérées comme des facteurs de transcription recrutés de façon permanente à l’enzyme. / In eukaryotes, nuclear transcription is carried out by DNA dependent RNA polymerases (Pol) I, II and III. Pol I transcribes ribosomal RNA’s, Pol II produces essentially messenger and micro RNA’s whereas Pol III transcribes small untranslated RNA’s involved in a variety of cellular processes such as translation, splicing or the regulation of transcription. Human Pol III is a multi-subunit enzyme composed of 17 subunits. The majority of these subunits are homologous or closely related to Pol II and/or Pol I subunits. However, five subunits are specific to Pol III with no counterparts in Pol I or Pol II. One of the Pol III specific subunits, hRPC32 has two paralogues, α and β, expressed from two different genes. hRPC32β is expressed ubiquitously while hRPC32α expression is specific to transformed or non-differentiated cells. Within the Pol III enzyme, hRPC32α or β associate with two other Pol III specific subunits, hRPC62 and hRPC39, to form stable ternary sub-complexes thought to be implicated in transcription initiation. The purpose of this work was to clarify the functional mechanism of hRPC32α/β-hRPC62-hRPC39 sub-complexes. In this study, we first mapped the protein-protein interaction of hRPC62 with hRPC32α and hRPC32β. Second, we performed a biochemical study of hRPC62 and hRPC39 enzymatic activities. This analysis showed that hRPC62 has functional homologies with TFIIEα, a Pol II transcription factor recently described as a structural homolog of hRPC62. These results support the model that certain RNA polymerase subunits can be considered as transcription factors that have been stably recruited to the enzyme.
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Le complexe TFIIH dans la transcription effectuée par l'ARN polymèrase II et l'ARN polymèrase IIIZadorin, Anton 28 September 2012 (has links) (PDF)
Deux phénomènes liés au TFIIH ont été étudiés : l'influence des mutations spécifiques dans la sous-unité XPD de TFIIH sur la réponse transcriptionnelle de certains gènes après l'irradiation UV, et l'interaction entre le TFIIH et la transcription des gènes de classe III. Une analyse détaillée de la dynamique du transcriptome a été effectuée pour la réponse des cellules humaines mutantes XP-D/CS à l'UV. Il a été démontré que la dysrégulation sélective observée de l'expression des gènes était liée à l'incapacité pour la ré-initiation transcriptionnelle et à l'hétérochromatinisation suivante, où l'histonedésacétylase SIRT1 a été identifiée comme le principal facteur. Son inhibition a permis de recouvrer l'expression normale d'un nombre substantiel des gènes affectés. Une étude de la participation pangénomique du coeur de TFIIH dans latranscription a découvert son association avec les gènes actifs de classe III. Cette association a été démontrée être indépendante de Pol II. Le coeur de TFIIH a été montré participer directement à la transcription effectuée in vitro par Pol III.
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Caractérisation des deux isoformes de l’ARN Polymérase III Humaine / Caracterisation of two Human RNA Polymerase III isoformsDa Silva, Daniel 15 December 2011 (has links)
Chez les cellules eucaryotes, la transcription est réalisée par les ARN polymérases I, II et III. L’ARN polymérase III (Pol III) transcrit des petits ARNs non codants tels que les ARNt, l’ARN U6, l’ARNr 5S et certains microARN. Il a été montré précédemment que l’augmentation de l’activité transcriptionnelle de la Pol III était associée à la transformation tumorale. Au sein du laboratoire, nous avons décrit une nouvelle sous–unité de la Pol III, RPC32α, qui met en évidence l’existence de deux isoformes de la Pol III humaine : la Pol IIIα et la Pol IIIβ. La sous-unité RPC32β, présente dans la Pol III, est exprimée de façon ubiquitaire et parait comme essentielle pour la croissance cellulaire. La sous-unité RPC32α n’est pas essentielle pour la survie cellulaire et son expression est limitée aux cellules souches non différenciées et aux cellules tumorales. De plus, l’expression ectopique de RPC32α induit la transformation tumorale des cellules fibroblastes IMR90 et change totalement l’expression de nombreux transcrits Pol III mais aussi d’autres ARNm impliqués dans la tumorogenèse (Haurie et al., 2010). Les travaux décrits dans ce manuscrit ont eu pour but de mieux caractériser et comprendre les deux isoformes de la Pol III humaine. Nous avons purifié les Pol IIIα et Pol IIIβ afin d’identifier tous les composants protéiques des deux isoformes du complexe. Au cours de cette étude nous avons observé que des modifications post-traductionnelles de RPC32α semblaient jouer un rôle déterminant dans la capacité oncogénique de la Pol IIIα. Pour comprendre par quel mécanisme moléculaire les Pol IIIα et Pol III pouvaient influencer l’expression de transcrits Pol II, notamment lors de la transformation cellulaire induite par l’expression de RPC32α, nous avons étudié cette régulation lors de la surexpression des deux sous unités paralogues. Ainsi, nous avons mené des analyses ciblées révélant la régulation de certains gènes impliqués dans le développement, la différenciation et la tumorogenèse. Nous avons également essayé de décrire les changements d'expression des gènes au niveau globale en utilisant la technologie des puces à ADN. Cette approche innovante et puissante nous a permis d’obtenir une vision d’ensemble des transcrits Pol II différentiellement régulés lors de la surexpression de RPC32α et RPC32β Nous avons pu apprécier l’impact de la Pol III pour le développement embryonnaire, la différenciation cellulaire, la survie de la cellule, la prolifération tumorale ou encore à la réponse immunitaire innée. Les résultats de cette étude qui demandent à être confirmés ouvrent des voies de recherches particulièrement intéressantes qui mériteront d’être approfondies dans le futur / Transcription in eukaryotic nuclei is carried out by DNA-dependent RNA polymerases I, II, and III. Human RNA polymerase III (Pol III) transcribes small untranslated RNAs that include tRNAs, 5S RNA, U6 RNA, and some microRNAs. Increased Pol III transcription has been reported to accompany or cause cell transformation. In the laboratory, we described a Pol III subunit (RPC32β) that led to the demonstration of two human Pol III isoforms (Pol IIIα and Pol IIIβ). RPC32β-containing Pol IIIβ is ubiquitously expressed and essential for growth of human cells. RPC32α-containing Pol IIIα is dispensable for cell survival, with expression being restricted to undifferentiated ES cells and to tumor cells. In this regard, and most importantly, ectopic expression of RPC32α in fibroblast IMR90 enhances cell transformation and dramatically changes the expression of several tumor-related mRNAs and that of a subset of Pol III RNAs. These results identify a human Pol III isoform and isoform-specific functions in the regulation of cell growth, the differentiation and transformation. (Haurie et al., 2010).The work described in this manuscript enables identification and understanding the function of the two human Pol III isoforms. Pol IIIα and Pol IIIβ are purified in order to describe all the protein components of the two Pol III complex. During this study, we observed that post-translated modifications of RPC32α seem to have a crucial function in oncogenic capacity of Pol IIIα. To understand how Pol IIIα and Pol IIIβ can affect Pol II RNA expression, in particular during cell transformation induced by RPC32α, we studied this regulation during the overexpression of the two paralogue subunits. We performed focused analysis, this study revealed the regulation of certain genes involved in the development, the differentiation and the tumorigenesis. We also tried to describe global gene expression modification using microarray technology. This new and powerful approach enables to obtain a global view on mRNA regulation by overexpression of RPC32α and RPC32β. We observed the effect of Pol III on embryo development, cell differentiation, cell survival, tumor proliferation and on innate immune response. The results of this study need further confirmation pave the way for interesting projects which are worth going into detail for the future.
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Le complexe TFIIH dans la transcription effectuée par l'ARN polymèrase II et l'ARN polymèrase III / TFIIH complex in transcription mediated by RNA polymerase II and RNA polymerase IIIZadorin, Anton 28 September 2012 (has links)
Deux phénomènes liés au TFIIH ont été étudiés : l'influence des mutations spécifiques dans la sous-unité XPD de TFIIH sur la réponse transcriptionnelle de certains gènes après l'irradiation UV, et l'interaction entre le TFIIH et la transcription des gènes de classe III. Une analyse détaillée de la dynamique du transcriptome a été effectuée pour la réponse des cellules humaines mutantes XP-D/CS à l'UV. Il a été démontré que la dysrégulation sélective observée de l’expression des gènes était liée à l'incapacité pour la ré-initiation transcriptionnelle et à l'hétérochromatinisation suivante, où l'histonedésacétylase SIRT1 a été identifiée comme le principal facteur. Son inhibition a permis de recouvrer l'expression normale d'un nombre substantiel des gènes affectés. Une étude de la participation pangénomique du coeur de TFIIH dans latranscription a découvert son association avec les gènes actifs de classe III. Cette association a été démontrée être indépendante de Pol II. Le coeur de TFIIH a été montré participer directement à la transcription effectuée in vitro par Pol III. / In this work, two TFIIH-related phenomena were investigated : the influence of specific mutations in TFIIH XPD subunits on the transcriptional response of different genes on UV irradiation and the interaction between TFIIH and transcription of class III genes. For the first time the detailed investigation of transcriptome dynamics was carried out for the response of XP-D/CS mutant human cells to UV-irradiation. The transcription regulation nature of the observed selective gene expression dysregulation was clearly observed. Its relation to failure of transcription re-initiation and consequentheterochromatisation was demonstrated. SIRT1 histone deacetylase was identified as the main driver of the repressive chromatin establishment on the certain genes upon UV. Inhibition of SIRT1 was found to recover normal expression of substantial number of affected genes. SIRT1 mediated mechanism was shown to be XP-D/CS specific. A potential link between this longevity related protein and progeria features of XP-D/CS mutants was hypothesised. Genome-wide study of the involvement of the core TFIIH in transcription revealed its association with active class III genes, not described previously. This association was demonstrated to be Pol II-independent. The core TFIIH was shown to be directly involved in Pol III mediated transcription in vitro.
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Caracterisation de la regulation de la transcription par l'arn polymerase iii chez saccharomyces cerevisiaeTavenet, Arounie 10 November 2011 (has links) (PDF)
L'ARN polymérase III synthétise de nombreux petits ARN non traduits, dont les ARNt et l'ARNr 5S, essentiels à la croissance de toute cellule. Dans ce travail, nous nous sommes intéressés à la régulation de la transcription par l'ARN polymérase III chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Nous avons détecté Sub1 sur les gènes de classe III in vivo. Nous avons également observé que Sub1 est capable de stimuler la transcription par l'ARN III reconstituée in vitro avec les facteurs TFIIIB et TFIIIC recombinants et avec l'ARN Pol III purifiée. Sub1 stimule deux étapes de la transcription : l'initiation et la réinitiation facilitée. Des expériences supplémentaires nous montrent que la protéine interagit directement avec TFIIIB et TFIIIC. Enfin, nous avons pu constater que la délétion de Sub1 dans la levure conduit à une diminution de la transcription par l'ARN Pol III en phase exponentielle de croissance. Par la suite, nous avons cherché à déterminer quel lien pouvait exister entre l'activateur Sub1 et le répresseur Maf1 de la transcription par l'ARN Pol III. Enfin, nous avons également souhaité identifier d'autres éléments pouvant interagir avec la protéine Sub1 au cours de sa fonction de régulateur.
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