La voie de réparation par excision de nucléotides (NER) répare les lésions qui distordent la double hélice d’ADN notamment ceux induits par l’irradiation UV. Le NER est subdivisé en deux sous-voies : GG-NER (Global Genome Repair) et TC-NER (Transcription-Coupled Repair). La sous-voie GG-NER enlève les dommages à l’ADN dans l’ensemble du génome. La sous-voie TC-NER répare les dommages sur le brin transcrit qui interfèrent avec la progression de l’ARN Pol II. Les défauts de la voie NER peuvent conduire à l’apparition de pathologies graves. Par exemple, des mutations dans le gène XPG, codant une 3’ endonucléase impliquée dans la voie NER, peuvent mener au xeroderma pigmentosum (XP) associé ou non au syndrome de Cockayne (CS).Récemment, le laboratoire a découvert un lien fonctionnel entre Rad2, homologue chez la levure Saccharomyces cerevisiae de la protéine XPG humaine, et le Médiateur (Eyboulet et al., 2013). Le Médiateur est un complexe multiprotéique nécessaire à la régulation de la transcription dépendante de l’ARN Pol II. Cette étude a suggéré que le Médiateur est impliqué dans la sous-voie TC-NER en facilitant le recrutement de Rad2 au niveau des régions transcrites.Mon projet de thèse visait à étudier les mécanismes moléculaires qui lient la transcription et la réparation de l’ADN. Plus précisément, d’investiguer le lien fonctionnel entre le Médiateur et la machinerie du NER chez S. cerevisiae.Lors du TC-NER, l’ARN Pol II est le premier facteur signalant le dommage à l’ADN. De plus, le Médiateur et Rad2 interagissent avec l’ARN Pol II. Pour déterminer le lien fonctionnel entre ces composants, nous avons utilisé des approches de génétique et génomique dans les mutants de TFIIH (kin28), de l’ARN Pol II (rpb9) and du Médiateur (med17). Nos résultats nous ont permis de proposer un modèle dans lequel Rad2 est recruté au niveau des régions régulatrices enrichies par le Médiateur, et Rad2 est ensuite transféré au niveau des régions transcrites de manière dépendante à l’ARN Pol II. De plus, ces résultats suggèrent que le rôle du Médiateur dans la transcription est fortement lié à son rôle dans la réparation de l’ADN.Ensuite, nous avons montré que le lien entre le Médiateur et la machinerie du NER peut être étendu à d’autres protéines du NER notamment en démontrant une interaction physique entre le Médiateur et Rad1/XPF, Rad10/ERCC1 ou Rad26/CSB, en l’absence des UV. Tout comme Rad2, nous avons démontré que Rad1 et Rad10 n’ont pas de rôle majeur dans la transcription. Pour approfondir le lien entre ces protéines du NER et le Médiateur, des expériences de ChIP-sequencing ont été réalisées. Nous avons observé que le Médiateur est présent au niveau de certaines régions qui sont aussi enrichies par ces protéines du NER. Après l’induction des dommages par UV, les interactions entre le Médiateur et la machinerie du NER reste inchangées par rapport aux conditions en l’absence des UV. De plus grâce à nos expériences de ChIP, nous avons observé un changement de la liaison à la chromatine des protéines du NER et du Médiateur après l’irradiation aux UV. Des expériences de ChIP-sequencing seront réalisées pour avoir une vue globale de ces changements.En conclusion, nous avons solidifié le lien fonctionnel entre Rad2, le Médiateur et l’ARN Pol II par rapport à la réparation couplée à la transcription. Nous avons aussi démontré que le Médiateur interagit avec d’autres protéines du NER (Rad1/XPF, Rad10/ERCC1 et Rad26/CSB) et colocalise avec eux sur certaines régions de la chromatine. En somme, notre projet place le Médiateur à l’interface de la transcription et de la réparation de l’ADN, deux processus essentiels dont les défauts peuvent mener à des pathologies graves. / Nucleotide excision repair (NER) is a well conserved pathway that removes helix-distorting DNA lesions such as those arising upon UV irradiation. Global genome repair subpathway (GG-NER) removes the DNA lesions in the genome overall, and transcription-coupled repair (TC-NER) removes the DNA lesions interfering with Pol II progression through actively-transcribed regions. Defects in the NER pathway may lead to severe human pathologies. For instance, mutations in human XPG gene, encoding a 3’ endonuclease essential for NER, give rise to xeroderma pigmentosum (XP) sometimes associated with Cockayne syndrome (CS). Recently, the laboratory discovered a functional link between Rad2/XPG and Mediator in Saccharomyces cerevisiae (Eyboulet et al., 2013). Mediator is a large multisubunit complex essential for transcription regulation. We suggest that Mediator is involved in TC-NER by facilitating Rad2 recruitment to transcribed genes.My PhD work aimed at addressing the molecular mechanisms of this link between transcription and DNA repair, especially by investigating the functional interplay between Mediator and the NER machinery in yeast Saccharomyces cerevisiae.RNA Pol II is the first complex of TC-NER that encounters the DNA damage. Moreover, both Mediator and Rad2/XPG interact with Pol II. However, a functional interplay between all these components related to TC-NER remained to be determined. Using genetic and genomic approaches, in particular ChIP-sequencing in TFIIH (kin28), RNA Pol II (rpb9) and Mediator (med17) mutants, our work led us to propose a model where Rad2 shuttles between Mediator on upstream activating sequence (UAS) and RNA Pol II on transcribed regions (Georges, Gopaul et al., under review). Our results also suggest that Mediator functions in transcription and DNA repair are closely related.Moreover, we showed that Mediator’s link to NER can be extended to other NER proteins. Indeed, we identified a physical interaction between Mediator and other NER proteins, including Rad1/XPF, Rad10/ERCC1 and Rad26/CSB in the absence of UV irradiation. Similarly to Rad2, we demonstrated that Rad1 and Rad10 do not have a major role in yeast transcription. To further study the functional link between Mediator and the NER machinery, we obtained the genomic distribution of different NER proteins by ChIP-sequencing. We found that some promoter regions are co-occupied by Mediator and these NER proteins, and that relationships between Mediator and these NER proteins are more complex than between Mediator and Rad2. We also investigated if physical interactions between Mediator and NER proteins are modified after UV, we did not observe any significant change. Furthermore, we observed that the chromatin binding profiles of NER proteins and Mediator are modified after UV-irradiation. ChIP-sequencing will be carried out to get a genome-wide view of their chromatin binding profiles.In conclusion, we have strengthened the link between Rad2/XPG, Mediator and RNA Pol II, providing mechanistic insights into functional interplay between these components related to transcription-coupled repair, and showed that the link between Mediator and the NER machinery can be extended to other proteins. Taken together, our results suggest a close relation between Mediator functions in transcription and in NER, two fundamental processes dysfunction of which leads to human diseases.

La transcription, la maturation d’ARN, et le remodelage de la chromatine sont tous des processus centraux dans l'interprétation de l'information contenue dans l’ADN. Bien que beaucoup de complexes de protéines formant la machinerie cellulaire de transcription aient été étudiés, plusieurs restent encore à identifier et caractériser. En utilisant une approche protéomique, notre laboratoire a purifié plusieurs composantes de la machinerie de transcription de l’ARNPII humaine par double chromatographie d’affinité "TAP". Cette procédure permet l'isolement de complexes protéiques comme ils existent vraisemblablement in vivo dans les cellules mammifères, et l'identification de partenaires d'interactions par spectrométrie de masse. Les interactions protéiques qui sont validées bioinformatiquement, sont choisies et utilisées pour cartographier un réseau connectant plusieurs composantes de la machinerie transcriptionnelle. En appliquant cette procédure, notre laboratoire a identifié, pour la première fois, un groupe de protéines, qui interagit physiquement et fonctionnellement avec l’ARNPII humaine. Les propriétés de ces protéines suggèrent un rôle dans l'assemblage de complexes à plusieurs sous-unités, comme les protéines d'échafaudage et chaperonnes. L'objectif de mon projet était de continuer la caractérisation du réseau de complexes protéiques impliquant les facteurs de transcription. Huit nouveaux partenaires de l’ARNPII (PIH1D1, GPN3, WDR92, PFDN2, KIAA0406, PDRG1, CCT4 et CCT5) ont été purifiés par la méthode TAP, et la spectrométrie de masse a permis d’identifier de nouvelles interactions. Au cours des années, l’analyse par notre laboratoire des mécanismes de la transcription a contribué à apporter de nouvelles connaissances et à mieux comprendre son fonctionnement. Cette connaissance est essentielle au développement de médicaments qui cibleront les mécanismes de la transcription. / Genomes encode most of the functions necessary for cell growth and differentiation. Gene transcription, RNA processing, and chromatin remodeling are central processes in the interpretation of the information contained in genomic DNA. Although many protein complexes forming the cellular machinery that interprets mammalian genomes have been studied, a number of additional complexes remain to be identified and characterized. Using proteomic approaches, Dr. Benoit Coulombe’s laboratory purified many components of the RNAPII transcription machinery using tandem affinity purification (TAP), a procedure that allows the isolation of protein complexes as they likely exist in live mammalian cells, and the identification of interaction partners using mass spectrometry. High confidence interactions were selected computationally and used to draw the map of a network connecting many components of the mRNA transcriptional machinery. By applying this procedure, our lab has identified, for the first time, a group of proteins, that interacts both physically and functionally with human RNAPII, and whose properties suggest a role in the assembly of multi-subunit complexes, acting as RNAPII-specific scaffolding proteins and chaperones. The aim of my project was to continue the characterization of the network of protein complexes involving transcription factors, and thus, further pursuing our survey of protein complexes in whole cell extracts. Eight novel RNAPII interaction partners (PIH1D1, GPN3, WDR92, PFDN2, KIAA0406, PDRG1, CCT4 and CCT5) were purified using the tandem affinity purification (TAP) method, and their interaction partners were identified by mass spectrometry. Over the years, our lab’s analysis of transcriptional regulation and mechanisms has contributed novel and important knowledge that provided better understanding of mRNA synthesis. This knowledge is paramount to the development of therapeutics that will target transcriptional mechanisms.

La régulation de la transcription est un processus complexe qui a évolué pendant des millions d’années permettant ainsi aux cellules de s’adapter aux changements environnementaux. Notre laboratoire étudie le rôle de la rapamycine, un agent immunosuppresseur et anticancéreux, qui mime la carence nutritionelle. Afin de comprendre les mécanismes impliqués dans la réponse a la rapamycine, nous recherchons des mutants de la levure Saccaromyces cerevisiae qui ont un phenotype altérée envers cette drogue. Nous avons identifié le gène RRD1, qui encode une peptidyl prolyl isomérase et dont la mutation rend les levures très résistantes à la rapamycine et il semble que se soit associé à une réponse transcriptionelle alterée. Mon projet de recherche de doctorat est d’identifier le rôle de Rrd1 dans la réponse à la rapamycine. Tout d’abord nous avons trouvé que Rrd1 interagit avec l’ARN polymérase II (RNAPII), plus spécifiquement avec son domaine C-terminal. En réponse à la rapamycine, Rrd1 induit un changement dans la conformation du domaine C-terminal in vivo permettant la régulation de l’association de RNAPII avec certains gènes. Des analyses in vitro ont également montré que cette action est directe et probablement liée à l’activité isomérase de Rrd1 suggérant un rôle pour Rrd1 dans la régulation de la transcription. Nous avons utilisé la technologie de ChIP sur micropuce pour localiser Rrd1 sur la majorité des gènes transcrits par RNAPII et montre que Rrd1 agit en tant que facteur d’élongation de RNAPII. Pour finir, des résultats suggèrent que Rrd1 n’est pas seulement impliqué dans la réponse à la rapamycine mais aussi à differents stress environnementaux, nous permettant ainsi d’établir que Rrd1 est un facteur d’élongation de la transcription requis pour la régulation de la transcription via RNAPII en réponse au stress. / Transcriptional regulation is a complex process that has evolved over millions of years of evolution. Cells have to sense environmental conditions and adapt to them by altering their transcription. Herein, we study the role of rapamycin, an immunosuppressant and anticancer molecule that mimics cellular starvation. To understand how the action of rapamycin is mediated, we analyzed gene deletion mutants in the yeast Saccharomyces cerevisiae that have an altered response to this drug. Deletion of RRD1, a gene encoding a peptidyl prolyl isomerase, causes strong resistance to rapamycin and this was associated with a role of Rrd1 in the transcriptional response towards rapamycin. The main focus of my PhD was therefore to unravel the role of Rrd1 in response to rapamycin. First, we discovered that Rrd1 interacts with RNA polymerase II (RNAPII), more specifically with its C-terminal domain and we showed that in response to rapamycin, Rrd1 alters the structure of this C-terminal domain. This phenomenon was confirmed to be directly mediated by Rrd1 in vitro, presumably through its peptidyl prolyl isomerase activity. Further, we demonstrated that Rrd1 is capable of altering the occupancy of RNAPII on genes in vivo and in vitro. With the use of ChIP on chip technology, we show that Rrd1 is actually a transcription elongation factor that is associated with RNAPII on actively transcribed genes. In addition, we demonstrate that Rrd1 is indeed required to regulate the expression of a large subset of genes in response to rapamycin. This data let us propose a novel mechanism by which Rrd1 regulates RNAPII during transcription elongation. Finally, we provide evidence that Rrd1 is not only required for an efficient response towards rapamycin but to a larger variety of environmental stress conditions, thus establishing Rrd1 as a transcriptional elongation factor required to fine tune the transcriptional stress response of RNAPII.

L’ARN polymérase II (ARNPII), l’enzyme responsable de la transcription des ARN messagers, procède au décodage du génome des organismes vivants. Cette fonction requiert l’action concertée de plusieurs protéines, les facteurs généraux de la transcription, par exemple, formant un réseau d’interactions protéine-protéine, plusieurs étant impliquées dans la régulation de l’ARNPII à différents niveaux. La régulation de la transcription a été largement étudiée durant les quatre dernières décennies. Néanmoins, nous en connaissons peu sur les mécanismes qui régulent l’ARNPII avant ou après la transcription. Dans la première partie de cette thèse, nous poursuivons la caractérisation du réseau d’interactions de l’ARNPII dans la fraction soluble de la cellule humaine, travail qui a débuté précédemment dans notre laboratoire. Ce réseau, développé à partir de la méthode de la purification d’affinité en tandem couplée à la spectrométrie de masse (AP-MS) et à des méthodes d’analyses bioinformatiques, nous amène une foule d’informations concernant la régulation de l’ARNPII avant et après son interaction avec la chromatine. Nous y identifions des protéines qui pourraient participer à l’assemblage de l’ARNPII telles des chaperonnes et les protéines du complexe R2TP/prefoldin-like ainsi que des protéines impliquées dans le transport nucléocytoplasmique. Au centre de ce réseau se trouvent RPAP4, une GTPase qui semble se positionner à l’interface entre ces protéines régulatrices et l’ARNPII. Nous avons donc entamé l’étude la fonction de RPAP4, ce qui nous a menés à la conclusion que RPAP4 est essentielle à l’import nucléaire de l’ARNPII au noyau, où elle exerce sa fonction. Nous avons également montré que les motifs G et GPN sont essentiels à la fonction de RPAP4. Le traitement des cellules avec le bénomyl nous montre aussi que la fonction de RPAP4 et l’import nucléaire de l’ARNPII requièrent l’action des microtubules. La deuxième partie de la thèse s’intéresse à une autre protéine positionnée au centre du réseau, RPAP2. Cette dernière partage plusieurs interactions avec RPAP4. Elle est aussi essentielle à la localisation nucléaire de l’ARNPII et interagit directement avec celle-ci. RPAP4 et RPAP2 étant toutes deux des protéines cytoplasmiques qui font la navette entre le noyau et le cytoplasme, nous présentons des évidences que RPAP4 est impliquée dans l’export nucléaire de RPAP2 pour permettre à celle-ci d’être disponible dans le cytoplasme pour l’import de l’ARNPII dans le noyau. Dans la troisième partie de la thèse, nous étudions plus en profondeur les modifications post-traductionnelles de RPAP4, ce qui nous aide à mieux comprendre sa propre régulation et sa fonction auprès de l’ARNPII. RPAP4 est phosphorylée en mitose par la MAP kinase ERK5. Cette phosphorylation favorise l’interaction entre RPAP4 et RPAP2, ce qui empêche RPAP2 d’interagir avec l’ARNPII pendant la mitose, prévenant du même coup, son interaction avec la chromatine pendant cette phase du cycle cellulaire où la transcription est presque inexistante. / RNA polymerase II, the enzyme responsible for transcription of messenger RNA, decodes the genome of living organisms. This function requires the concerted action of several proteins, including transcription factors, which form a protein-protein interaction network. Many of them are implicated in the regulation of RNAPII transcription. Although regulation of transcription has been largely studied during the last four decades, little is known about mechanisms that regulate RNAPII prior and after the transcription reaction. In the first part of this thesis, we continue the characterization of the RNAPII interaction network of RNAPII in the soluble fraction of the human cell. This network, developed using tandem affinity purification method coupled with mass spectrometry (AP-MS) and bioinformatic analysis, provides a wealth of information about RNAPII regulation prior and after its interaction with chromatin for transcription. We identified proteins that can be involved in RNAPII assembly, including chaperones and the cochaperone complex R2TP prefoldin-like, and proteins involved in nucleocytoplasmic shuttling. RPAP4 is a GTPase that occupies a central position in this network being at the interface between these regulatory proteins and RNAPII. We therefore started to study the function of RPAP4, which lead us to conclude that RPAP4 is essential for RNAPII nuclear import. We also report that G domains and the GPN motif are essential for RPAP4 function. Treatment of the cells with benomyl suggests that microtubules are required for RPAP4 function and RNAPII nuclear import. The second part concerns another protein found in the network that is also centrally positioned in the network, called RPAP2. RPAP2 shares many interactions with RPAP4. This protein is also essential for the nuclear import of RNAPII as it interacts directly with it. RPAP4 and RPAP2 being cytoplasmic proteins that shuttle between the cytoplasm and the nucleus, we show evidences that RPAP4 is implicated in RPAP2 nuclear export to make it available for RNAPII nuclear import. In the third part, we study RPAP4 post-translational modifications, which help us to understand its own regulation and its function with RNAPII. RPAP4 is phosphorylated in mitosis by the MAP kinase ERK5. This phosphorylation promotes the interaction between RPAP4 and RPAP2. It prevents RPAP2 and RNAPII interaction and RNAPII chromatin localization in mitosis where transcription is mostly nonexistent.

Deux phénomènes liés au TFIIH ont été étudiés : l'influence des mutations spécifiques dans la sous-unité XPD de TFIIH sur la réponse transcriptionnelle de certains gènes après l'irradiation UV, et l'interaction entre le TFIIH et la transcription des gènes de classe III. Une analyse détaillée de la dynamique du transcriptome a été effectuée pour la réponse des cellules humaines mutantes XP-D/CS à l'UV. Il a été démontré que la dysrégulation sélective observée de l’expression des gènes était liée à l'incapacité pour la ré-initiation transcriptionnelle et à l'hétérochromatinisation suivante, où l'histonedésacétylase SIRT1 a été identifiée comme le principal facteur. Son inhibition a permis de recouvrer l'expression normale d'un nombre substantiel des gènes affectés. Une étude de la participation pangénomique du coeur de TFIIH dans latranscription a découvert son association avec les gènes actifs de classe III. Cette association a été démontrée être indépendante de Pol II. Le coeur de TFIIH a été montré participer directement à la transcription effectuée in vitro par Pol III. / In this work, two TFIIH-related phenomena were investigated : the influence of specific mutations in TFIIH XPD subunits on the transcriptional response of different genes on UV irradiation and the interaction between TFIIH and transcription of class III genes. For the first time the detailed investigation of transcriptome dynamics was carried out for the response of XP-D/CS mutant human cells to UV-irradiation. The transcription regulation nature of the observed selective gene expression dysregulation was clearly observed. Its relation to failure of transcription re-initiation and consequentheterochromatisation was demonstrated. SIRT1 histone deacetylase was identified as the main driver of the repressive chromatin establishment on the certain genes upon UV. Inhibition of SIRT1 was found to recover normal expression of substantial number of affected genes. SIRT1 mediated mechanism was shown to be XP-D/CS specific. A potential link between this longevity related protein and progeria features of XP-D/CS mutants was hypothesised. Genome-wide study of the involvement of the core TFIIH in transcription revealed its association with active class III genes, not described previously. This association was demonstrated to be Pol II-independent. The core TFIIH was shown to be directly involved in Pol III mediated transcription in vitro.

Dans les cellules des eucaryotes, la transcription des gènes est contrôlée par une pléthore de complexes protéiniques. Cependant, la plupart de nos connaissances fondamentales sur la régulation de la transcription viennent des expériences biochimiques ou des expériences d’immunofluorescences utilisant des cellules fixées. Par conséquent, beaucoup d’efforts ont été consacré récemment pour obtenir des informations sur les mouvements dynamiques ou sur l’assemblage des facteurs de transcription directement dans des cellules vivantes. Nous avons développé une stratégie de marquage, appelé « versatile antibody-based imaging approach » (VANIMA), dans laquelle des anticorps marqués avec un fluorochrome sont introduit dans des cellules vivantes pour visualiser spécifiquement des protéines endogènes ou des modifications post-traductionnelle. Nous avons pu montrer que VANIMA peut être utilisé pour étudier des processus dynamique des mécanismes fondamental de la biologie y compris les facteurs de la machinerie de transcription ainsi que les modifications des histones dans des cellules vivantes de cancer humaine en utilisant la microscopie conventionnelle ou à super-résolution. Dans l’avenir VANIMA va servir comme un outil valable pour révéler les dynamiques des processus endogènes en biologie y compris la transcription directement dans des cellules vivantes individuelles. / In eukaryotic cells, gene transcription is controlled by a plethora of protein complexes. However, most of our basic knowledge about transcription regulation originate from biochemical experiments or immunofluorescence experiments using fixed cells. Consequently, many efforts have been devoted recently to obtain information about the dynamic movements or assembly of transcription factors directly from living cells. Therefore, we developed a labeling strategy, named versatile antibody-based imaging approach (VANIMA), in which fluorescently labeled antibodies are introduced into living cells to image specific endogenous proteins or posttranslational modifications. We were able to show that VANIMA can be used to study dynamical processes of fundamental biological mechanisms including factors of the transcription machinery as well as histone modifications in living human cancer cells using conventional or super-resolution microscopy. Hence, in the future VANIMA will serve as a valuable tool to uncover the dynamics of endogenous biological processes including transcription directly in single living cells.

La régulation de la transcription est un processus complexe qui a évolué pendant des millions d’années permettant ainsi aux cellules de s’adapter aux changements environnementaux. Notre laboratoire étudie le rôle de la rapamycine, un agent immunosuppresseur et anticancéreux, qui mime la carence nutritionelle. Afin de comprendre les mécanismes impliqués dans la réponse a la rapamycine, nous recherchons des mutants de la levure Saccaromyces cerevisiae qui ont un phenotype altérée envers cette drogue. Nous avons identifié le gène RRD1, qui encode une peptidyl prolyl isomérase et dont la mutation rend les levures très résistantes à la rapamycine et il semble que se soit associé à une réponse transcriptionelle alterée. Mon projet de recherche de doctorat est d’identifier le rôle de Rrd1 dans la réponse à la rapamycine. Tout d’abord nous avons trouvé que Rrd1 interagit avec l’ARN polymérase II (RNAPII), plus spécifiquement avec son domaine C-terminal. En réponse à la rapamycine, Rrd1 induit un changement dans la conformation du domaine C-terminal in vivo permettant la régulation de l’association de RNAPII avec certains gènes. Des analyses in vitro ont également montré que cette action est directe et probablement liée à l’activité isomérase de Rrd1 suggérant un rôle pour Rrd1 dans la régulation de la transcription. Nous avons utilisé la technologie de ChIP sur micropuce pour localiser Rrd1 sur la majorité des gènes transcrits par RNAPII et montre que Rrd1 agit en tant que facteur d’élongation de RNAPII. Pour finir, des résultats suggèrent que Rrd1 n’est pas seulement impliqué dans la réponse à la rapamycine mais aussi à differents stress environnementaux, nous permettant ainsi d’établir que Rrd1 est un facteur d’élongation de la transcription requis pour la régulation de la transcription via RNAPII en réponse au stress. / Transcriptional regulation is a complex process that has evolved over millions of years of evolution. Cells have to sense environmental conditions and adapt to them by altering their transcription. Herein, we study the role of rapamycin, an immunosuppressant and anticancer molecule that mimics cellular starvation. To understand how the action of rapamycin is mediated, we analyzed gene deletion mutants in the yeast Saccharomyces cerevisiae that have an altered response to this drug. Deletion of RRD1, a gene encoding a peptidyl prolyl isomerase, causes strong resistance to rapamycin and this was associated with a role of Rrd1 in the transcriptional response towards rapamycin. The main focus of my PhD was therefore to unravel the role of Rrd1 in response to rapamycin. First, we discovered that Rrd1 interacts with RNA polymerase II (RNAPII), more specifically with its C-terminal domain and we showed that in response to rapamycin, Rrd1 alters the structure of this C-terminal domain. This phenomenon was confirmed to be directly mediated by Rrd1 in vitro, presumably through its peptidyl prolyl isomerase activity. Further, we demonstrated that Rrd1 is capable of altering the occupancy of RNAPII on genes in vivo and in vitro. With the use of ChIP on chip technology, we show that Rrd1 is actually a transcription elongation factor that is associated with RNAPII on actively transcribed genes. In addition, we demonstrate that Rrd1 is indeed required to regulate the expression of a large subset of genes in response to rapamycin. This data let us propose a novel mechanism by which Rrd1 regulates RNAPII during transcription elongation. Finally, we provide evidence that Rrd1 is not only required for an efficient response towards rapamycin but to a larger variety of environmental stress conditions, thus establishing Rrd1 as a transcriptional elongation factor required to fine tune the transcriptional stress response of RNAPII.

La transcription, la maturation d’ARN, et le remodelage de la chromatine sont tous des processus centraux dans l'interprétation de l'information contenue dans l’ADN. Bien que beaucoup de complexes de protéines formant la machinerie cellulaire de transcription aient été étudiés, plusieurs restent encore à identifier et caractériser. En utilisant une approche protéomique, notre laboratoire a purifié plusieurs composantes de la machinerie de transcription de l’ARNPII humaine par double chromatographie d’affinité "TAP". Cette procédure permet l'isolement de complexes protéiques comme ils existent vraisemblablement in vivo dans les cellules mammifères, et l'identification de partenaires d'interactions par spectrométrie de masse. Les interactions protéiques qui sont validées bioinformatiquement, sont choisies et utilisées pour cartographier un réseau connectant plusieurs composantes de la machinerie transcriptionnelle. En appliquant cette procédure, notre laboratoire a identifié, pour la première fois, un groupe de protéines, qui interagit physiquement et fonctionnellement avec l’ARNPII humaine. Les propriétés de ces protéines suggèrent un rôle dans l'assemblage de complexes à plusieurs sous-unités, comme les protéines d'échafaudage et chaperonnes. L'objectif de mon projet était de continuer la caractérisation du réseau de complexes protéiques impliquant les facteurs de transcription. Huit nouveaux partenaires de l’ARNPII (PIH1D1, GPN3, WDR92, PFDN2, KIAA0406, PDRG1, CCT4 et CCT5) ont été purifiés par la méthode TAP, et la spectrométrie de masse a permis d’identifier de nouvelles interactions. Au cours des années, l’analyse par notre laboratoire des mécanismes de la transcription a contribué à apporter de nouvelles connaissances et à mieux comprendre son fonctionnement. Cette connaissance est essentielle au développement de médicaments qui cibleront les mécanismes de la transcription. / Genomes encode most of the functions necessary for cell growth and differentiation. Gene transcription, RNA processing, and chromatin remodeling are central processes in the interpretation of the information contained in genomic DNA. Although many protein complexes forming the cellular machinery that interprets mammalian genomes have been studied, a number of additional complexes remain to be identified and characterized. Using proteomic approaches, Dr. Benoit Coulombe’s laboratory purified many components of the RNAPII transcription machinery using tandem affinity purification (TAP), a procedure that allows the isolation of protein complexes as they likely exist in live mammalian cells, and the identification of interaction partners using mass spectrometry. High confidence interactions were selected computationally and used to draw the map of a network connecting many components of the mRNA transcriptional machinery. By applying this procedure, our lab has identified, for the first time, a group of proteins, that interacts both physically and functionally with human RNAPII, and whose properties suggest a role in the assembly of multi-subunit complexes, acting as RNAPII-specific scaffolding proteins and chaperones. The aim of my project was to continue the characterization of the network of protein complexes involving transcription factors, and thus, further pursuing our survey of protein complexes in whole cell extracts. Eight novel RNAPII interaction partners (PIH1D1, GPN3, WDR92, PFDN2, KIAA0406, PDRG1, CCT4 and CCT5) were purified using the tandem affinity purification (TAP) method, and their interaction partners were identified by mass spectrometry. Over the years, our lab’s analysis of transcriptional regulation and mechanisms has contributed novel and important knowledge that provided better understanding of mRNA synthesis. This knowledge is paramount to the development of therapeutics that will target transcriptional mechanisms.

L'ARN polymérase III synthétise de nombreux petits ARN non traduits, dont les ARNt et l'ARNr 5S, essentiels à la croissance de toute cellule. Dans ce travail, nous nous sommes intéressés à la régulation de la transcription par l'ARN polymérase III chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Nous avons détecté Sub1 sur les gènes de classe III in vivo. Nous avons également observé que Sub1 est capable de stimuler la transcription par l'ARN III reconstituée in vitro avec les facteurs TFIIIB et TFIIIC recombinants et avec l'ARN Pol III purifiée. Sub1 stimule deux étapes de la transcription : l'initiation et la réinitiation facilitée. Des expériences supplémentaires nous montrent que la protéine interagit directement avec TFIIIB et TFIIIC. Enfin, nous avons pu constater que la délétion de Sub1 dans la levure conduit à une diminution de la transcription par l'ARN Pol III en phase exponentielle de croissance. Par la suite, nous avons cherché à déterminer quel lien pouvait exister entre l'activateur Sub1 et le répresseur Maf1 de la transcription par l'ARN Pol III. Enfin, nous avons également souhaité identifier d'autres éléments pouvant interagir avec la protéine Sub1 au cours de sa fonction de régulateur.

Le Virus Respiratoire Syncytial (VRS) est le principal agent responsable d’infections respiratoires sévères chez les nourrissons et les veaux. Le génome du VRS est constitué d’un ARN simple brin de polarité négative qui est répliqué et transcrit par le complexe ARN-polymérase viral (RdRp). Ce complexe est composé de la nucléoprotéine N, de la polymérase L, de la phosphoprotéine P et du facteur anti-terminateur de transcription M2-1. Le but de ce travail était de mieux caractériser la structure et le fonctionnement de deux protéines du complexe RdRp: P et M2-1.M2-1 est un tétramère constitué de 4 domaines : un « doigt de zinc », un domaine d’oligomérisation hélicoïdal, une région flexible, un domaine globulaire interagissant avec l'ARN et P, et une région C-terminale désordonnée. À partir de la structure cristalline de M2-1 pleine longueur, j'ai identifié des résidus critiques sur le doigt de zinc et la région flexible pour l'activité d'anti-terminaison de transcription de M2-1.Par la suite j'ai identifié une région de P critique pour l’interaction P - M2-1 et montre qu’elle est nécessaire au recrutement de M2-1 dans des corps d’inclusion cytoplasmiques. Je montre également que la déphosphorylation de M2-1, nécessaire à la transcription virale, est modulée par un complexe formé entre P et la phosphatase cellulaire PP1.Enfin, la cyclopamine, composé chimique naturel, inhibe la réplication du VRS. Je démontre qu'une seule mutation R151K sur M2-1 est suffisante pour conférer une résistance virale à la cyclopamine. Ces données ouvrent de nouvelles perspectives pour le développement de futures thérapies contre le VRS. / Respiratory syncytial virus (RSV) is the leading cause of lower respiratory tract illness in infants and calves. The RSV genome consists of a single strand, negative-sense RNA, which is replicated and transcribed by the viral RNA-dependent RNA polymerase complex (RdRp). This complex is composed of the nucleoprotein N, the large protein L, the phosphoprotein P and the transcription anti-terminator M2-1. The aim of this work was to better characterize the structure and function of P and M2-1.M2-1 is a tetramer with 4 domains: a zinc-finger, a helical oligomerization domain, a flexible region, a RNA and P binding core domain and a C-terminal disordered region. Based on the crystal structure of the full-length M2-1 protein, I identified residues in the zinc-finger and the flexible loop critical for M2-1 antitermination activity.Then I identified a region of P critical for P – M2-1 interaction and show that it is required for the recruitment of M2-1 to cytoplasmic inclusion bodies. I also show that M2-1 dephosphorylation, which is critical for viral transcription, is modulated by a complex formed by P and the cellular phosphatase protein-1 (PP1).Finally cyclopamine, a natural chemical compound, inhibits the RSV replication. I show that a single R151K mutation in M2-1 is sufficient to confer virus resistance to cyclopamine. These data open a new avenue for the development of future therapies against RSV infection.