Trypanosoma brucei est un parasite unicellulaire qui est transmis d’un hôte mammifère à l’autre par l’intermédiaire de la mouche Tsé-tsé. Au cours de son cycle de vie, il est donc confronté à des environnements extrêmement différents auxquels il s’adapte en modifiant, entre autres choses, ses antigènes de surface. Dans la mouche, l’antigène de surface exprimé est la PROCYCLINE alors que dans le sang des mammifères, l’antigène exprimé est le VSG. Ces protéines sont importantes pour l’adaptation du parasite à son environnement. L’objet de ce travail était de trouver des facteurs impliqués dans le contrôle de l’expression de ces antigènes de surface. <p>Nous nous sommes donc intéressés aux mécanismes de transcription, impliqués dans la régulation de l’expression des gènes. Chez les autres eucaryotes, les gènes codant pour des protéines sont toujours transcrits par une ARN polymérase de type II (Pol II). Les ARN codant pour des protéines subissent en effet une maturation particulière (épissage et polyadénylation) et la machinerie enzymatique nécessaire à cette maturation est spécifiquement recrutée par la Pol II. Une particularité étonnante des gènes de PROCYCLINE et de VSG est qu’ils sont transcrits par une ARN polymérase de type I (Pol I) mais les transcrits résultants sont maturés comme s’ils étaient transcrits par la Pol II. L’hypothèse à la base de ce travail est que la régulation de l’expression des gènes codant pour la PROCYCLINE et le VSG s’effectue via le recrutement, au niveau de la Pol I, d’un/de facteurs normalement associé(s) à la Pol II. Nous avons donc tenté de trouver un lien entre les machineries Pol I et Pol II du parasite. Pour ce faire, nous nous sommes intéressés d’une part au facteur de transcription TFIIH et d’autre part à la machinerie de transcription Pol II du trypanosome.<p>Le facteur TFIIH est un facteur de transcription qui interagit avec la Pol II mais aussi avec la Pol I chez d’autres eucaryotes. Il nous semblait donc être un bon facteur potentiel de lien entre les deux machineries de transcription. Nous avons dans un premier temps mis en évidence que six des dix sous-unités humaines de ce complexe ont des homologues chez le parasite et que au moins quatre d’entre elles forment un complexe. Nous avons ensuite montré que la présence de TFIIH est importante pour la transcription des gènes Pol II du parasite. Sa fonction dans la transcription des gènes Pol I devra être confirmée. <p>Par ailleurs, nous avons caractérisé la composition du complexe Pol II du parasite ce qui nous permet de conclure que la composition globale de la Pol II du parasite est conservée par rapport à celle de l’homme et de la levure. Nous avons aussi montré que la sous-unité RPB5 qui interagit avec le complexe Pol II n’est pas la même que celle qui interagit avec le complexe Pol I. Le trypanosome possède en effet deux gènes codant pour deux isoformes de RPB5 (RPB5 et RPB5z) alors que la majorité des eucaryotes ne possèdent qu’un seul variant de cette protéine. Nous avons mis en évidence au cours de ce travail que chaque isoforme était spécifique d’un complexe de polymérase particulier. L’isoforme associée à la Pol II et à la Pol III ressemble à la protéine homologue présente chez l’homme et la levure, tandis que l’isoforme associée à la Pol I diverge de cette isoforme canonique. Le même phénomène a été mis en évidence pour la sous-unité RPB6. La présence d’isoformes divergentes spécifiquement associées à la Pol I du parasite pourraient être liées aux capacités qu’à cette holoenzyme de transcrire des gènes codant pour des protéines. <p>Enfin, au cours de ce travail, nous avons montré que l’inhibition de la transcription Pol II perturbait l’expression spécifique de stade des gènes codant pour les antigènes de surface. Bien que le mécanisme sous-jacent reste inconnu, il est possible que l’inhibition de la transcription Pol II, créee artificiellement dans nos expériences, mime ce qui ce passe naturellement lorsque le parasite s’apprête à changer de stade.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Chez Saccharomyces cerevisiae, les souches mutantes pour Rrd1, une protéine qui possède une activité de peptidyl prolyl cis/trans isomérase, montrent une résistance marquée à la rapamycine et sont sensibles au 4-nitroquinoline 1-oxide, un agent causant des dommages à l’ADN. PTPA, l’homologue de Rrd1 chez les mammifères, est reconnu en tant qu’activateur de protéine phosphatase 2A. Notre laboratoire a précédemment démontré que la surexpression de PTPA mène à l’apoptose de façon indépendante des protéines phosphatase 2A. La fonction moléculaire de Rrd1/PTPA était encore largement inconnue au départ de mon projet de doctorat. Mes recherches ont d’abord montré que Rrd1 est associé à la chromatine ainsi qu’à l’ARN polymérase II. L’analyse in vitro et in vivo par dichroïsme circulaire a révélé que Rrd1 est responsable de changements au niveau de la structure du domaine C-terminal de la grande sous-unité de l’ARN polymérase II, Rpb1, en réponse à la rapamycine et au 4-nitroquinoline 1-oxide. Nous avons également démontré que Rrd1 est requis pour modifier l’occupation de l’ARN polymérase II sur des gènes répondant à un traitement à la rapamycine. Finalement, nous avons montré que suite à un traitement avec la rapamycine, Rrd1 médie la dégradation de l’ARN polymérase II et que ce mécanisme est indépendant de l’ubiquitine. La dernière partie de mon projet était d’acquérir une meilleure connaissance de la fonction de PTPA, l’homologue de Rrd1 chez les mammifères. Nos résultats montrent que le «knockdown» de PTPA n’affecte pas la sensibilité des cellules à différentes drogues telles que la rapamycine, le 4-nitroquinoline 1-oxide ou le peroxyde d’hydrogène (H2O2). Nous avons également tenté d’identifier des partenaires protéiques pour PTPA grâce à la méthode TAP, mais nous ne sommes pas parvenus à identifier de partenaires stables. Nous avons démontré que la surexpression de la protéine PTPA catalytiquement inactive n’induisait pas l’apoptose indiquant que l’activité de PTPA est requise pour produire cet effet. Finalement, nous avons tenté d’étudier PTPA dans un modèle de souris. Dans un premier lieu, nous avons déterminé que PTPA était exprimé surtout au niveau des tissus suivants : la moelle osseuse, le thymus et le cerveau. Nous avons également généré avec succès plusieurs souris chimères dans le but de créer une souris «knockout» pour PTPA, mais l’allèle mutante ne s’est pas transférée au niveau des cellules germinales. Mes résultats ainsi que ceux obtenus par mon laboratoire sur la levure suggèrent un rôle général pour Rrd1 au niveau de la régulation des gènes. La question demeure toujours toutefois à savoir si PTPA peut effectuer un rôle similaire chez les mammifères et une vision différente pour déterminer la fonction de cette protéine sera requise pour adresser adéquatement cette question dans le futur. / In Saccharomyces cerevisiae, mutants devoid of Rrd1, a protein possessing in vitro peptidyl prolyl cis/trans isomerase activity, display striking resistance to rapamycin and show sensitivity to the DNA damaging agent 4-nitroquinoline 1-oxide. PTPA, the mammalian homolog of Rrd1, has been shown to activate protein phosphatase 2A. Our laboratory previously found that overexpression of PTPA leads to apoptosis independently of PP2A. At the outset of my thesis work, the molecular function of Rrd1/PTPA was largely unknown. My work has shown that Rrd1 is associated with the chromatin and interacts with RNA polymerase II. In vitro and in vivo analysis with circular dichroism revealed that Rrd1 mediates structural changes of the C-terminal domain of the large subunit of RNA pol II, Rpb1, in response to rapamycin and 4-nitroquinoline 1-oxide. Consistent with this, we demonstrated that Rrd1 is required to alter RNA pol II occupancy on rapamycin responsive genes. We also showed that upon rapamycin exposure Rrd1 mediates the degradation of RNA polymerase II and that this mechanism is ubiquitin-independent. Another part of my work was to gain insight into the function of PTPA, the mammalian counterpart of Rrd1. PTPA knockdown did not affect sensitivity to rapamycin, 4-nitroquinoline 1-oxide or H2O2. We also attempted to find protein interaction partners for PTPA using tandem affinity purification, but no stable partners for PTPA were found. We also demonstrated that overexpression of a catalytically inactive PTPA mutant did not induce apoptosis, indicating that PTPA activity is required to produce this effect. Finally, we attempted to study PTPA in a mouse model. We first determined that PTPA was expressed in a tissue-specific manner and was most abundant in bone marrow, thymus and brain. We pursued creation of a knockout mouse and successfully generated chimeras, but the mutated allele was not transmitted to the germline. My data and other data from our laboratory regarding the yeast work suggest a general role for Rrd1 in regulation of gene transcription. Whether PTPA has a similar function in mammalian cells remains unknown, and a different vision of what the protein does in mammalian cells will be required to adequately address this question in the future.

Le virus T lymphotropique humain HTLV-1 est l’agent étiologique de la leucémie-lymphome T de l’adulte (ATLL) et de nombreuses maladies inflammatoires. HTLV-1 est associée à de nombreuses modifications quantitatives de l’expression des gènes cellulaires. À ce jour, ces modifications ont été décrites essentiellement à l’échelle transcriptionnelle à travers notamment les effets de l’oncoprotéine virale Tax, et plus récemment HBZ. Outre leurs impacts sur les niveaux d’activité des promoteurs, certains facteurs apparaissent jouer également un rôle dans la régulation de l’épissage alternatif. Ce mécanisme essentiel à la diversité du transcriptome et du protéome cellulaire, apparait étroitement couplé à la transcription et ses dérégulations sont de plus en plus décrites dans les phénomènes cytotoxiques et pathogènes tels que les infections et les cancers. Dans ce contexte, mon travail s’est intéressé à caractériser les profils d’expression des exons des cellules T CD4+ infectées ou non, et transformée ou non par HTLV-1 in vivo. Dans une seconde étude, j’ai abordé les aspects mécanistiques des modifications d’épissage alternatif par HTLV-1. Mes données montrent que, outre ses effets sur la régulation quantitative de l’expression des gènes cellulaires, l’activation de la voie NF-kB par l’oncogène Tax est impliquée dans la reprogrammation de l’épissage alternatif de nombreux gènes. Ces données révèlent un nouveau degré de complexité dans les mécanismes de dérégulation de l’expression des gènes cellulaires par HTLV-1 et ouvre de nouvelles perspectives d’investigations dans la compréhension des processus leucémogènes associés à l’infection par le virus HTLV-1 / Reprogramming cellular gene transcription sustains HTLV-1 viral persistence that ultimately leads to the development of adult T-cell leukemia/lymphoma (ATLL). We hypothesized that besides these quantitative transcriptional effects. HTLV-1 quantitatively modifies the pattern of cellular gene expression. Exon expression analysis shows that patients’ untransformed and malignant HTLV-1+ CD4+ T-cells exhibit multiple alternate exon usage (AEU) events. These affect either transcriptionally modified or unmodified genes, culminate in ATLL, and unveil new functional pathways involved in cancer and cell cycle. A total of 486 exon modifications occurred in untransformed infected CD4+ cells were detected in ATLL arguing for a role of AEUs in HTLV-1 leukemogenesis. Unsupervised hierarchical clustering of array data permitted to isolate exon expression patters of 3977 exons that discriminate uninfected, infected, and transformed CD4+ T-cells. Exposing cells to splicing inhibitors revealed that Sudemycin E reduces cell viability of HTLV-1 transformed cells without affecting primary control CD4+ cells and HTLV-1 negative cell lines, suggesting that the huge excess of AEU might provides news targets for treating ATLL. Taken together, these data reveal that HTLV-1 significantly modifies the structure of cellular transcripts and unmask new putative leukemogenic pathways and possible therapeutic targets

Ce travail de thèse porte sur l’étude des ARN polymérases ARN dépendant impliquées dans le RNA silencing chez Arabidopsis thaliana. Durant ma thèse, la recherche d'interacteurs des RDR, parmi des protéines impliquées dans le RNA silencing, a permis la détection d'interaction entre RDR6 et SDE3, RDR6 et SGS3, mais aussi entre SDE3 et SGS3 en Co-IP et BiFC. Une co-localisation de ces protéines a été observée lorsqu'elles sont produites transitoirement dans des cellules épidermales de N. benthamiana.Un crible d’une banque d’ADNc d’A. thaliana par double hybride de levure, a permis d’isoler des interacteurs potentiels de RDR6. Deux interacteurs potentiels, AtUAP56-1 et U2B’’, sont impliqués dans l’épissage des précurseurs des ARNm. Un effet sur le RNA silencing dans des mutants de l’épissage en 3’ des ARNm était connu et nous avons confirmé l’interaction entre RDR6 et AtUAP56-1 par BiFC. L’étude de lignées mutantes pour AtUAP56-1 a donc été initiée.Une étude biochimique de RDR6 et de RDR2 a été réalisée. Des formes recombinantes de RDR2 et RDR6 ont été produites de façon transitoire dans des feuilles de N. benthamiana, et une étude comparative de RDR2 et RDR6 a été réalisée. Les deux RDR sont actives sur des matrices ARN et ADN, et montrent in vitro une activité amorce-indépendante. De plus, nous avons détecté pour la première fois une activité amorce-dépendante de RDR6 et RDR2. Ces résultats apportent de nouvelles données biochimiques qui sont en accord avec les études menées in vivo et enrichissent les modèles actuels du RNA silencing. / The aim of this work was to study RNA-dependent RNA polymerases involved in RNA silencing in Arabidopsis thaliana. During my thesis, the search for RDR interactors among proteins involved in RNA silencing allowed the detection of interactions between RDR6 and SDE3, RDR6 and SGS3, and also between SDE3 and SGS3 using Co-IP and BiFC. In addition, the co-localisation of these proteins was observed when produced transiently in epidermal cells of N. Benthamiana.A screen of an A. thaliana cDNA library by yeast two hybrid allowed us to identify some putative new RDR6 interactors. Two putative RDR6 interactors, AtUAP56 and U2B’’, are known to be involved in pre-miRNA splicing. Furthermore, a link between pre-mRNA 3’ splicing and RNA silencing was previously reported. We also confirmed the interaction between AtUAP56-1 and RDR6 by BiFC. An investigation of A. thaliana of AtUAP56-1 mutants has been initiated.Recombinant RDRs were produced transiently in N. Benthamiana, and a biochemical comparative study of RDR2 and RDR6 performed. We found that RDR2, like RDR6, has a de novo polymerase activity on DNA and RNA templates, and for both RDRs we also showed, for the first time, a primer-dependant synthesis of dsRNA from RNA template. These findings provide important new insights into our understanding of the molecular mechanisms of RNA silencing amplification in Arabidopsis.

Le cilié Paramecium tetraurelia est un modèle intéressant pour l'étude de la diversité et de l'évolution des voies d'ARN interférence (ARNi) chez les eucaryotes. L'une des voies d'ARNi végétatives peut être induite en nourrissant les paramécies de bactéries produisant un ARN double-brin (ARNdb) homologue à un gène donné, dont l'expression est inactivée de manière post-transcriptionnelle par la production de siARN de 23 nt. Un crible de mutagénèse a permis d'obtenir des mutants mendéliens déficients pour l'ARNi, dont les génomes ont été séquencés afin d'identifier sans a priori des gènes impliqués dans cette voie. 6 gènes ont été identifiés: un Dicer, deux ARN polymérases ARN-dépendantes (RDR1 et 2), une nucléotidyl-transférase (CID1) et deux gènes codant de nouvelles protéines (PDS1 et 2). Pour étudier leur rôle dans la biosynthèse ou l'action des siARN, ces derniers ont été séquencés à partir de cellules sauvages ou mutantes, nourries d'un ARNdb homologue à un gène non essentiel. L'analyse bio-informatique a montré que des siARN dits 'primaires' sont produits à partir de l'ARNdb bactérien, tandis que des siARN dits 'secondaires' sont produits à partir de la totalité de l'ARNm endogène ciblé, et sont majoritairement de polarité anti-sens. Alors que la production des siARN primaires dépend de tous les gènes étudiés, les résultats n'impliquent que RDR2 dans celle des siARN secondaires. Enfin, j'ai montré que certains clusters de siARN endogènes dépendent de RDR1 et de CID1, tandis que d'autres dépendent de RDR2. La paramécie produit également des siARN antisens aux ARN ribosomaux bactériens, suggérant de nouvelles hypothèses quant à la fonction naturelle de cette voie. / The ciliate Paramecium tetraurelia is an interesting model to study the diversity and evolution of RNA interference (RNAi) pathways. One of the vegetative RNAi pathways is induced by feeding cells with bacteria producing double-stranded RNA (dsRNA) homologous to a given gene, which is then post-transcriptionally silenced through the production of 23-nt siRNAs. A forward genetic screen allowed us to obtain Mendelian mutants deficient in dsRNA-induced RNAi, and mutated genes were identified by whole-genome resequencing. 6 genes were identified: one Dicer, two RNA-dependent RNA polymerases (RDR1 et 2), one nucleotidyl-transferase (CID1) and two genes encoding novel poteins (PDS1 and 2). To study their roles in siRNA biosynthesis or action, we sequenced small RNAs from wild-type or mutants cells fed with a dsRNA homologous to a non-essential endogenous gene. Bioinformatic analyses showed that 'primary' siRNAs are produced from the bacterial dsRNA trigger, while 'secondary' siRNAs, predominantly of antisense polarity, are produced from the whole length of the targeted endogenous mRNA. While primary siRNA production requires all of the genes studied, the results only implicate RDR2 in the production of secondary siRNAs. Finally, I showed that some clusters of endogenous siRNAs depend on RDR1 and CID1, whereas others depend on RDR2. Paramecium was also shown to produce siRNAs that are antisense to bacterial ribosomal RNAs, suggesting new hypotheses about the possible natural functions of this pathway.

Chez Saccharomyces cerevisiae, les souches mutantes pour Rrd1, une protéine qui possède une activité de peptidyl prolyl cis/trans isomérase, montrent une résistance marquée à la rapamycine et sont sensibles au 4-nitroquinoline 1-oxide, un agent causant des dommages à l’ADN. PTPA, l’homologue de Rrd1 chez les mammifères, est reconnu en tant qu’activateur de protéine phosphatase 2A. Notre laboratoire a précédemment démontré que la surexpression de PTPA mène à l’apoptose de façon indépendante des protéines phosphatase 2A. La fonction moléculaire de Rrd1/PTPA était encore largement inconnue au départ de mon projet de doctorat. Mes recherches ont d’abord montré que Rrd1 est associé à la chromatine ainsi qu’à l’ARN polymérase II. L’analyse in vitro et in vivo par dichroïsme circulaire a révélé que Rrd1 est responsable de changements au niveau de la structure du domaine C-terminal de la grande sous-unité de l’ARN polymérase II, Rpb1, en réponse à la rapamycine et au 4-nitroquinoline 1-oxide. Nous avons également démontré que Rrd1 est requis pour modifier l’occupation de l’ARN polymérase II sur des gènes répondant à un traitement à la rapamycine. Finalement, nous avons montré que suite à un traitement avec la rapamycine, Rrd1 médie la dégradation de l’ARN polymérase II et que ce mécanisme est indépendant de l’ubiquitine. La dernière partie de mon projet était d’acquérir une meilleure connaissance de la fonction de PTPA, l’homologue de Rrd1 chez les mammifères. Nos résultats montrent que le «knockdown» de PTPA n’affecte pas la sensibilité des cellules à différentes drogues telles que la rapamycine, le 4-nitroquinoline 1-oxide ou le peroxyde d’hydrogène (H2O2). Nous avons également tenté d’identifier des partenaires protéiques pour PTPA grâce à la méthode TAP, mais nous ne sommes pas parvenus à identifier de partenaires stables. Nous avons démontré que la surexpression de la protéine PTPA catalytiquement inactive n’induisait pas l’apoptose indiquant que l’activité de PTPA est requise pour produire cet effet. Finalement, nous avons tenté d’étudier PTPA dans un modèle de souris. Dans un premier lieu, nous avons déterminé que PTPA était exprimé surtout au niveau des tissus suivants : la moelle osseuse, le thymus et le cerveau. Nous avons également généré avec succès plusieurs souris chimères dans le but de créer une souris «knockout» pour PTPA, mais l’allèle mutante ne s’est pas transférée au niveau des cellules germinales. Mes résultats ainsi que ceux obtenus par mon laboratoire sur la levure suggèrent un rôle général pour Rrd1 au niveau de la régulation des gènes. La question demeure toujours toutefois à savoir si PTPA peut effectuer un rôle similaire chez les mammifères et une vision différente pour déterminer la fonction de cette protéine sera requise pour adresser adéquatement cette question dans le futur. / In Saccharomyces cerevisiae, mutants devoid of Rrd1, a protein possessing in vitro peptidyl prolyl cis/trans isomerase activity, display striking resistance to rapamycin and show sensitivity to the DNA damaging agent 4-nitroquinoline 1-oxide. PTPA, the mammalian homolog of Rrd1, has been shown to activate protein phosphatase 2A. Our laboratory previously found that overexpression of PTPA leads to apoptosis independently of PP2A. At the outset of my thesis work, the molecular function of Rrd1/PTPA was largely unknown. My work has shown that Rrd1 is associated with the chromatin and interacts with RNA polymerase II. In vitro and in vivo analysis with circular dichroism revealed that Rrd1 mediates structural changes of the C-terminal domain of the large subunit of RNA pol II, Rpb1, in response to rapamycin and 4-nitroquinoline 1-oxide. Consistent with this, we demonstrated that Rrd1 is required to alter RNA pol II occupancy on rapamycin responsive genes. We also showed that upon rapamycin exposure Rrd1 mediates the degradation of RNA polymerase II and that this mechanism is ubiquitin-independent. Another part of my work was to gain insight into the function of PTPA, the mammalian counterpart of Rrd1. PTPA knockdown did not affect sensitivity to rapamycin, 4-nitroquinoline 1-oxide or H2O2. We also attempted to find protein interaction partners for PTPA using tandem affinity purification, but no stable partners for PTPA were found. We also demonstrated that overexpression of a catalytically inactive PTPA mutant did not induce apoptosis, indicating that PTPA activity is required to produce this effect. Finally, we attempted to study PTPA in a mouse model. We first determined that PTPA was expressed in a tissue-specific manner and was most abundant in bone marrow, thymus and brain. We pursued creation of a knockout mouse and successfully generated chimeras, but the mutated allele was not transmitted to the germline. My data and other data from our laboratory regarding the yeast work suggest a general role for Rrd1 in regulation of gene transcription. Whether PTPA has a similar function in mammalian cells remains unknown, and a different vision of what the protein does in mammalian cells will be required to adequately address this question in the future.

Les ARN messagers (ARNm) fonctionnels sont produits au cours d'un mécanisme complexe qui allie la transcription, qui permet la synthèse d'un pré-ARNm, la maturation de ce transcrit et son export. De plus, ces différentes machineries vont devoir faire face à la structure compacte de la chromatine, nécessitant une activité de décondensation/recondensation de la chromatine qui est notamment régulée par les mécanismes épigénétiques. Un très grand nombre de facteurs sont donc requis pour la production des ARNm fonctionnels . Parmi ces facteurs, les protéines Spt6 et Iws1 sont impliquées dans le mécanisme général de la transcription, dans la modulation de la structure de la chromatine et la maturation et l'export des ARNm. Ces travaux de thèse ont permis de caractériser biochimiquement, structuralement et fonctionnellement ces deux protéines, leur complexe et leur interaction avec d'autres effecteurs de la transcription. Ces travaux ont notamment permis de comprendre en termes moléculaires et fonctionnels (i) comment Spt6 est recrutée par l'ARN polyméraseII au cours de la transcription et (ii) comment le complexe Spt6/Iws 1 est formé. Ils ont également permis d'identifier de nouveaux interactants potentiels de Spt6, et notamment le facteur d'élongation de la transcription TFIIS. Ces travaux ont ainsi permis de révéler le rôle essentiel et extrêmement complexe joué par Spt6 et Iws1 lors de la production d'un ARNm, mais également de permettre l'étude future de leur interaction avec d'autres facteurs transcriptionnels.

Le virus T lymphotropique humain HTLV-1 est l'agent étiologique de la leucémie-lymphome T de l'adulte (ATLL) et de nombreuses maladies inflammatoires. HTLV-1 est associée à de nombreuses modifications quantitatives de l'expression des gènes cellulaires. À ce jour, ces modifications ont été décrites essentiellement à l'échelle transcriptionnelle à travers notamment les effets de l'oncoprotéine virale Tax, et plus récemment HBZ. Outre leurs impacts sur les niveaux d'activité des promoteurs, certains facteurs apparaissent jouer également un rôle dans la régulation de l'épissage alternatif. Ce mécanisme essentiel à la diversité du transcriptome et du protéome cellulaire, apparait étroitement couplé à la transcription et ses dérégulations sont de plus en plus décrites dans les phénomènes cytotoxiques et pathogènes tels que les infections et les cancers. Dans ce contexte, mon travail s'est intéressé à caractériser les profils d'expression des exons des cellules T CD4+ infectées ou non, et transformée ou non par HTLV-1 in vivo. Dans une seconde étude, j'ai abordé les aspects mécanistiques des modifications d'épissage alternatif par HTLV-1. Mes données montrent que, outre ses effets sur la régulation quantitative de l'expression des gènes cellulaires, l'activation de la voie NF-kB par l'oncogène Tax est impliquée dans la reprogrammation de l'épissage alternatif de nombreux gènes. Ces données révèlent un nouveau degré de complexité dans les mécanismes de dérégulation de l'expression des gènes cellulaires par HTLV-1 et ouvre de nouvelles perspectives d'investigations dans la compréhension des processus leucémogènes associés à l'infection par le virus HTLV-1

Les ARN messagers (ARNm) fonctionnels sont produits au cours d'un mécanisme complexe qui allie la transcription, qui permet la synthèse d'un pré-ARNm, la maturation de ce transcrit et son export. De plus, ces différentes machineries vont devoir faire face à la structure compacte de la chromatine, nécessitant une activité de décondensation/recondensation de la chromatine qui est notamment régulée par les mécanismes épigénétiques. Un très grand nombre de facteurs sont donc requis pour la production des ARNm fonctionnels . Parmi ces facteurs, les protéines Spt6 et Iws1 sont impliquées dans le mécanisme général de la transcription, dans la modulation de la structure de la chromatine et la maturation et l'export des ARNm. Ces travaux de thèse ont permis de caractériser biochimiquement, structuralement et fonctionnellement ces deux protéines, leur complexe et leur interaction avec d'autres effecteurs de la transcription. Ces travaux ont notamment permis de comprendre en termes moléculaires et fonctionnels (i) comment Spt6 est recrutée par l'ARN polyméraseII au cours de la transcription et (ii) comment le complexe Spt6/Iws 1 est formé. Ils ont également permis d'identifier de nouveaux interactants potentiels de Spt6, et notamment le facteur d'élongation de la transcription TFIIS. Ces travaux ont ainsi permis de révéler le rôle essentiel et extrêmement complexe joué par Spt6 et Iws1 lors de la production d'un ARNm, mais également de permettre l'étude future de leur interaction avec d'autres facteurs transcriptionnels. / Production of functional messenger RNA (mRNA) requires a complex mechanism that couples transcription with maturation and export of the mRNA. In addition to this mechanism, chromatin needs to be unwound to allow the transcription machinery access the DNA, this unwinding being also highly regulated. Thus, production of a functional mRNA requires a huge number of factors implicated in these different processes. Among these proteins Spt6 and Iws1 are participating in the mechanism of transcription, chromatin unwinding, and maturation and export of the mRNA. The work carried out during this thesis has enabled the biochemical, structural and functional characterization of these proteins, their complex and their interaction with other effectors of transcription. This work has specifically enabled the molecular and functional characterization (i) of the recruitment of Spt6 by RNA polymerase II and (ii) of the formation of the Spt6/Iws1 complex. Moreover, this work has identified putative new partners of Spt6, not ably the elongation factor TFIIS. Thus, our work has highlighted the essential and complex role of Spt6 and Iws1 during the production of functional mRNA, and has also enabled future studies of the complexes formed by these two proteins with other transcriptional factors.

Le virus influenza de type A est un virus à ARN simple brin de polarité négative qui se réplique dans le noyau des cellules infectées. Son génome se compose de huit segments d'ARN viral (ARNv). Chaque segment est recouvert de multiples copies de nucléoprotéines virales (NP). Chacune des extrémités strictement conservées 3' et 5' des huit segments d'ARNv interagit avec une ARN-polymérase ARN-dépendante. Le complexe entre l'ARNv, NP et l'ARN-polymérase ARN-dépendante forme une particule appelée ribonucléoprotéine (RNP) constituant l'entité fonctionnelle pour la réplication du génome viral et sa transcription en ARN messagers. Dans le contexte de la RNP, ces deux processus sont assurés par l'ARN-polymérase ARN-dépendante formée de trois protéines (PA, PB1 et PB2). L'ARN-polymérase du virus influenza A fait l'objet de nombreuses études. Son étude structurale se heurte à la difficulté d'obtenir ce complexe hétérotrimérique sous forme soluble et en grande quantité, deux conditions qu'impose la biologie structurale. Ainsi, durant les huit dernières années, les données structurales à l'échelle atomique n'ont été obtenues que sur des domaines isolés de l'ARN-polymérase laissant l'essentiel de la structure de PB1 inconnue. Pour contourner ce problème, une nouvelle stratégie s'appuyant sur le système d'expression en cellules d'insecte infectées par baculovirus a été développée. Cette stratégie a permis la production d'une forme tronquée de l'ARN-polymérase du virus influenza de type A qui a été étudiée d'un point de vue structural et fonctionnel. Plusieurs reconstructions en trois dimensions ont été obtenues par microscopie électronique et une structure cristalline à faible résolution (7,7 Å) a pu être résolue. Les études fonctionnelles se sont axées sur les activités portées par l'hétérotrimère tronqué et un accent particulier a été mis sur l'étude des interactions avec l'ARN. Les informations sur les activités catalytiques obtenues in vitro ont mis en évidence un rôle clef de certains ions métalliques. Afin de connaitre l'environnement en ions métalliques et cibler leur rôle à l'échelle cellulaire, leur distribution dans la cellule infectée par le virus influenza A a été étudiée par microscopie rayons-X. Cet aspect de l'infection étant très peu documenté, cette étude s'inscrit dans une démarche originale et a offert l'opportunité d'intégrer les données biochimiques et biophysiques à l'échelle de la cellule entière. / Influenza A virus is a negative single stranded RNA virus that replicates in the nucleus of infected cells. Its genome contains eight single stranded negative-sense RNA segments (vRNA) covered by the viral nucleoprotein (NP). The highly conserved 3' and 5' ends of the vRNA are bound to the RNA-dependent RNA-polymerase (RdRp) which consists of three subunits, PA, PB1 and PB2. The complex between vRNA, NP and the RdRp forms a particle called ribonucleoprotein (RNP). The RNP acts as an independent molecular machine for transcription and replication in the nucleus. Within the context of the RNP, these two processes are mediated by the RdRp. The influenza A RdRp complex has been remarkably intractable to structural analysis and in the last eight years, crystal structures of independent domains covering roughly half of the heterotrimeric RdRp have been determined. In addition, electron microscopy reconstructions have described the RdRp. Nonetheless, a complete model characterizing the RdRp as a whole is still lacking. To overcome this issue, a new strategy has been developed to obtain the RdRp heterotrimeric complex using the baculovirus infected cells expression system. This method has produced a truncated form of the flu A RdRp which has been studied from a structural and functional point of view. Several three-dimensional reconstructions by electron microscopy have been obtained and a crystal structure at low resolution (7,7 Å) has been solved. Functional studies focused on the activities carried by the truncated RdRp and a particular emphasis was placed on the study of the interactions with RNA. In vitro functional data showed highly metal ion-dependent activities. To know more about the subcellular metal context, metallic ions distribution in influenza A infected cells has been studied by X-ray microscopy giving the opportunity to integrate biochemical and biophysical data in the context of the whole cell.