Submitted by Marlene Santos (marlene.bc.ufg@gmail.com) on 2016-06-15T20:56:23Z No. of bitstreams: 2 Dissertacão - Petain Jose Ferreira Neto - 2015.pdf: 1935098 bytes, checksum: 58b97940c1a11dda51ddc983a41e4bd9 (MD5) license_rdf: 19874 bytes, checksum: 38cb62ef53e6f513db2fb7e337df6485 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-06-28T13:06:35Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertacão - Petain Jose Ferreira Neto - 2015.pdf: 1935098 bytes, checksum: 58b97940c1a11dda51ddc983a41e4bd9 (MD5) license_rdf: 19874 bytes, checksum: 38cb62ef53e6f513db2fb7e337df6485 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-28T13:06:36Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertacão - Petain Jose Ferreira Neto - 2015.pdf: 1935098 bytes, checksum: 58b97940c1a11dda51ddc983a41e4bd9 (MD5) license_rdf: 19874 bytes, checksum: 38cb62ef53e6f513db2fb7e337df6485 (MD5) Previous issue date: 2015-07-13 / The Cerrado is the second largest biome in Brazil. Such an environment has a different soil several other regions. There are various living beings in this biome, among them, the actinobacteria. They are microorganisms whose cell wall Gram-positive, >50% G+C (guanine + cytosine) in its DNA, produce substances with high economic value. Actinobacteria are major producers of enzymes useful to humans. L-asparaginase enzyme is used in acute limphoblastic leukemias therapy (ALL) also being used in the pre-treatment of foods rich in reducing sugars, inhibiting the formation of acrylamide. The aim of this study was to produce L-asparaginase enzyme isolated from a soil actinobacteria, characterize the enzyme and identify the species of bacteria isolated. A soil sample from Cerrado was collected and submited to a pretreatment. Chemotaxis of Actinoplanetes spores used for the selection of this organism. Nineteen morphspecies were recovered. We used a medium inducing L-asparaginase, and the pink halo around the colony measured. Isolated BC-A.1 produced the largest halo in less time, with an average enzyme content of 4.1. After the completion of the production steps, partial purification and optimization of enzymatic activity, it was realized that the enzyme produced by isolated morphospecies is very efficient at 40 ° C and pH 8.0. Biochemical, physiological and molecular tests were performed, and the observation with optical microscopy and scanning electron microscopy, but it was not possible to identify the species isolated, probably belongs to the genus Streptomyces. / O Cerrado é o segundo maior bioma do Brasil. Tal ambiente possui um solo diferenciado de várias outras regiões. Existem vários seres vivos neste Bioma, dentre estes, as actinobactérias. São micro-organismos cujas células têm parede celular Gram-positiva, >50% de G+C (guanina + citosina) em seu DNA, produzem diversas substâncias com alto valor agregado. Actinobactérias são importantes produtores de enzimas úteis aos seres humanos. A enzima L-asparaginase é utilizada na terapia de Leucemias Linfoblásticas Agudas (ALL) sendo também empregada no pré-tratamento de alimentos ricos em açúcares redutores, inibindo a formação de acrilamida. O objetivo deste estudo foi produzir a enzima L-asparaginase a partir de uma actinobactéria isolada do solo, caracterizar a enzima e identificar a espécie do isolado bacteriano. Uma amostra do solo foi coletada no Cerrado e passou por um pré-tratamento. Foi utilizada a quimiotaxia dos esporos de Actinoplanetes para a seleção deste organismo. Foram recuperadas 19 morfoespécies. Utilizou-se um meio indutor de L-asparaginase, e o halo róseo ao redor da colônia medido. O isolado BC-A.1 produziu o maior halo em tempo menor, com índice enzimático médio de 4,1. Após a realização das etapas de produção, purificação parcial e otimização da atividade enzimática, percebeu-se que a enzima produzida pela morfoespécie isolada é muito eficiente a 40°C e pH 8,0. Foram realizados testes bioquímicos, fisiológicos e moleculares, bem como a observação em microscopia óptica e microscopia eletrônica de varredura, mas não foi possível identificar a espécie do isolado, provavelmente pertence ao gênero Streptomyces.

Il existe actuellement plusieurs tests globaux permettant l’évaluation de l’hémostase. Ces outils ont l’avantage, contrairement aux dosages individuels de facteurs ou aux tests classiques de coagulation (temps de prothrombine, temps de thromboplastine partielle activée), d’explorer le potentiel de coagulation global d’un individu, résultant de l’action combinée des facteurs pro et anti coagulants. Parmi ces tests, le test de génération de thrombine et les tests viscoélastiques ont retenu notre attention. Ils ont été utilisés pour explorer trois pathologies.La première partie de ce travail s’est focalisée sur l’évaluation du potentiel hémostatique chez les enfants atteints de leucémie aiguë lymphoblastique pendant le traitement par asparaginase native ou pégylée. L’asparaginase et les corticoïdes sont des molécules importantes du traitement, mais comportent différents effets indésirables, entre autre sur le système hémostatique avec l’apparition de thromboses. Le test de génération de thrombine a été exploré chez 56 enfants atteints de leucémie et a permis de mettre en évidence un potentiel de coagulation augmenté au diagnostic et pendant le traitement d’induction. Cet effet était moins marqué pour les patients sous asparaginase pégylée que sous asparaginase native.La deuxième étude a exploré l’hémostase chez les patients drépanocytaires greffés. Ces derniers ayant un profil hypercoagulable, l’étude a évalué l’influence de la greffe sur la balance hémostatique. Dix-sept patients ont été inclus. Les résultats confirment un profil hypercoagulant en situation pré-greffe et une correction, certes incomplète, de ce profil vers un profil normal en situation post-greffe.La troisième partie a étudié l’efficacité in vitro de l’acide tranexamique sur la fibrinolyse, particulièrement dans la chirurgie cardiaque pédiatrique. Pendant ce type d’intervention, le système vasculaire du patient est exposé à toute une série d’agressions qui conduisent à un risque non négligeable de saignement. Afin d’accroitre la stabilité du caillot, l’acide tranexamique, agent antifibrinolytique, est largement utilisé. La concentration plasmatique minimale à cibler, permettant une inhibition complète de la fibrinolyse est peu renseignée surtout dans la population pédiatrique. Afin de répondre à cette interrogation, la dose minimale d’acide tranexamique nécessaire pour inhiber la fibrinolyse a été déterminée, après sensibilisation d’un test viscoélastique à la fibrinolyse. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Pharmacie) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L-asparaginase (L-ASNase) é uma enzima com propriedades interessantes para a indústria médica, farmacêutica e de alimentos, que tem recebido atenção especial, inclusive no Brasil, por fazer parte do protocolo de tratamento de distúrbios linfoproliferativos, como a leucemia linfoblástica aguda (LLA). No mercado desde a década de 1970, as enzimas de origem bacteriana enfrentam algumas limitações por provocarem reações adversas graves em quase 80% dos pacientes em tratamento. Nesse contexto, L-ASNases provenientes de leveduras se destacam como alternativa, por serem mais próximas às congêneres humanas. A Antártica ainda é um ambiente pouco explorado, com grande diversidade de microrganismos com potencial para a produção de moléculas biológicas de interesse industrial. Nesse contexto, 150 leveduras isoladas de amostras de sedimento marinho coletadas na Península Antártica como parte do projeto MICROSFERA (PROANTAR/CNPq) foram avaliadas para a produção de L-ASNase. A triagem resultou em 9 isolados produtores, dos quais 7 pertencem ao gênero Leucosporidium. A linhagem L. muscorum CRM 1648 foi a que produziu mais enzima (540 U.L-1), com maior produtividade (5,6 U.L-1.h-1) e, por isso, foi alvo deste estudo. A análise univariada de fontes de carbono e nitrogênio indicou maior crescimento desse microrganismo e produção de L-ASNase em meio CD com extrato de levedura, prolina e sacarose. Ureia, cloreto de amônio e sulfato de amônio resultaram em baixa ou nenhuma produção da enzima, sugerindo que a metabolização de fontes de nitrogênio por essa linhagem está sob a influência do fenômeno de repressão catabólica pelo nitrogênio (RCN). Dois delineamentos experimentais do tipo fatorial completo resultaram em um aumento de 10 vezes na produção e produtividade da enzima (4582,5 U.L-1 e 63,6 U.L-1.h-1, respectivamente). A análise univariada da concentração inicial de inóculo (X0), pH inicial do meio, temperatura e adição de água do mar mostrou que a melhor condição para a produção foi: pH = 5,5 ou 6,5, cultivo a 15°C com adição de água do mar (25-50% m/v). A variável X0 não foi significativa nas concentrações avaliadas. Cultivos em biorreator (batelada) foram conduzidos em quatro diferentes níveis de oxigênio dissolvido (OD): (1) OD não controlado e abaixo de 20%, (2) OD não controlado e acima de 20%, (3) OD controlado em 80% e (4) OD controlado em 20%. Os resultados mostraram que OD é fator limitante para o crescimento de L. muscorum CRM 1648 e produção de L-ASNase por essa levedura e deve ser mantido acima de 35% para maior produção da enzima.Neste trabalho, a composição do meio e condições de cultivo foram estabelecidas para favorecer a produção de uma nova L-ASNase livre de atividade glutaminásica por levedura adaptada ao frio, abrindo espaço para novos estudos acerca de seu potencial antileucêmico e possível uso como alternativa às enzimas já existentes no mercado no tratamento de LLA. / L-asparaginase (L-ASNase) is an enzyme with interesting properties for medical, pharmaceutical and food industry, which has received special consideration, especially in Brazil, for being part of lymphoproliferative disorders treatment, such as acute lymphoblastic leukemia (ALL). Bacterial enzymes are on the market since the 1970s and face some limitations related to theirserious adverse reactions that reach almost 80% of all patients in treatment. In this context, L-ASNases from yeasts are highlighted as important alternative to bacterial enzymes, due to the closerphylogeny to human congeners. Antarctic environment has much to be explored, with a vast diversity of microorganisms with potential to produce biomolecules with industrial interest. A total of 150 yeasts isolated from Antarctic marine sediments as part of MICROSFERA project (PROANTAR/CNPq) were evaluated for L-ASNase production. The screening resulted in 9 producers, 7 species from the genus Leucosporidium. L. muscorum CRM 1648 was the strain that yielded the highest L-ASNase activity (540 U.L-1) and volumetric productivity (5.6 U.L-1.h-1). Carbon and Nitrogen sources were evaluated by a method of one-factor at a time (OFAT). From the gather results, sucrose, yeast extract and proline resulted in a maximal growth and highest enzyme production.The absence or low production of L-ASNase in medium with urea, ammonium chloride and ammonium sulfate suggests the presence of nitrogen catabolic repression (NCR). Carbon and nitrogen concentration were evaluated by full factorial design and yielded about ten times higher enzyme and volumetric productivity (4582.5 U.L-1 and 63.6 U.L-1.h-1, respectively). Initial inoculum concentration (X0), initial pH, temperature and concentration of seawater in the culture were evaluated by OFAT analysis and the best condition for L-ASNase production was: pH = 5.5 or 6.5, at 15 °C with addition of seawater (25-50 wt%). X0 was not considered a significant variable. Bioreactor assays (in batch regime) were performed in four different dissolved oxygen (DO) levels: (1) without DO control (DO remained under 20%), (2) without DO control (DO remained above 20%), (3) DO controlled at 80%, and (4) DO controlled at 20%.The results showed that DO is a key factor for growth of L. muscorum CRM 1648 and production of L-ASNase by this yeast and should be maintained above 35% for higher production of this enzyme.At this work, the medium and culture conditions were established to support the production of a novel glutaminase-free L-ASNase by a cold adapted yeast, opening a new path for further studies regarding its antileukemic potential and possible use as an alternative for ALL treatment.

A L-asparaginase (EC 3.5.1.1) é a enzima responsável pela hidrólise da L-asparagina em ácido L-aspártico e amônia, sendo utilizada como agente antitumoral e também para reduzir o conteúdo de acrilamida, composto neurotóxico e carcinogênico, presente em certos alimentos processados a altas temperaturas. Atualmente, o número de trabalhos referentes à produção de L-asparaginase por leveduras e fungos é limitado, principalmente quanto à produção da enzima de forma extracelular em fermentação em estado sólido (FES). Assim, o presente trabalho visou avaliar a produção de L-asparaginase extracelular por FES utilizando fungos e leveduras. Foi avaliado um grupo de 10 cepas de microrganismos como potenciais produtores de L-asparaginase extracelular. Na FES empregou-se o bagaço de cana-de-açúcar (80% de umidade relativa) como suporte suplementado com meio Czapek-Dox modificado e essas foram realizadas em frascos Erlenmeyer de 50 mL a 30 °C por 72 horas para leveduras e 96 horas para o fungo A. terreus. A atividade enzimática foi determinada pela metodologia do hidroxamato e confirmada por testes de cromatografia em camada delgada. Após a seleção dos microrganismos produtores de L-asparaginase extracelular, foi testada a influência de diferentes fontes de carbono, fontes de nitrogênio, pH, tamanhos de partícula e temperaturas na produção de L-asparaginase extracelular por FES utilizando um arranjo ortogonal Taguchi L\'16. Após essa etapa de seleção das variáveis foram realizados ensaios visando a otimização do processo, avaliando o efeito da concentração da fonte de carbono e nitrogênio por planejamento composto central rotacional (DCCR) 24. Finalmente, e com as melhores condições, avaliou-se a produção de L-asparaginase em reator em coluna de leito fixo com volume de 180 mL. Dos microrganismos testados na etapa de seleção, o fungo filamentoso Aspergillus terreus CCT7693 demostrou resultados positivos de atividade asparaginolítica, sendo este selecionado para os experimentos posteriores. De acordo com o arranjo ortogonal Taguchi L\'16, a maior produção de L-asparaginase extracelular (112,57 ± 13,65 U/L) foi obtida quando a maltose foi utilizada como fonte de carbono; a glutamina como fonte de nitrogênio (indutor); pH de 5,5; tamanho de partícula inferior a 0,850 mm e temperatura de 25 °C. No DCCR foram determinadas como condições otimizadas uma concentração de amido de 0,54%; ausência de maltose; concentração de L-asparagina de 0,44% e concentração de L-glutamina de 1,14%, obtendo-se uma atividade L-asparaginase máxima de 120,732 ± 16,77 U/L atingindo uma produção 7,39 vezes superior àquela obtida inicialmente (16,34 ± 3,28 U/L). Na etapa de produção da enzima em reator em coluna de leito fixo obteve-se uma atividade enzimática máxima total de 105,3 U/L demonstrando que este novo modo de produção utilizado foi eficaz. Assim, o presente trabalho permitiu avaliar aspectos relacionados com as condições de cultivo e selecionar o fungo Aspergillus terreus CCT7693 como microrganismo produtor de L-asparaginase extracelular por FES, abrindo perspectivas para explorar este sistema visando aumento de escala de produção. / L-asparaginase (EC 3.5.1.1) is the enzyme that hydrolyses L-asparagine into L-aspartic acid and ammonia. It can be used as a chemotherapeutic agent and also to reduce acrylamide concentration, a neurotoxic and carcinogenic compound, present in certain foods processed at high temperatures. Currently, the amount of works related to Lasparaginase production by yeast and fungi is limited, mainly when it comes to extracellular enzyme production under solid-state fermentation (SSF). Thus, the present work aimed to evaluate the production of extracellular L-asparaginase by SSF using fungi and yeasts. The potential to produce extracellular L-asparaginase was evaluated within a group of 10 strains of microorganisms. In the SSF, sugarcane bagasse (80% relative humidity) was used as support, supplemented with modified Czapek-Dox medium, and the fermentations were done in 50 mL-Erlenmeyer flasks at 30 °C, for 72 hours for yeasts and 96 hours for A. terreus fungus. The enzymatic activity was determined by hydroxamate methodology and confirmed by thin-layer chromatography. After the selection of the extracellular Lasparaginase producing microorganisms, the influence of different carbon and nitrogen sources (inductor), pH, particle sizes and temperatures was tested for the extracellular Lasparaginase production by SSF, using a Taguchi L\'16 orthogonal array. After this initial screening of variables stage, assays aiming at optimizing the process were performed, evaluating the effect of carbon and nitrogen source concentration by central composite design 24 (CCD). With the best conditions, the production of L-asparaginase was assayed in a fixed-bed column reactor with a volume of 180 mL. Among the microorganisms tested in the selection stage, only the filamentous fungus Aspergillus terreus CCT7693 showed positive results for asparaginolytic activity, and it was selected for the later experiments. According to orthogonal array Taguchi L\'16, the highest production of extracellular Lasparaginase (112.57 ± 13.65 U/L) was obtained when maltose was used as carbon source; L-glutamine as nitrogen source (inductor); pH 5.5; particle size less than 0.850 mm and temperature of 25 °C. Through CCD, the optimized conditions were set as: 0.54% starch concentration; absence of maltose; 0.44% L-asparagine concentration and 1.14% Lglutamine concentration. The maximum L-asparaginase activity obtained was 120.723 ± 16.77 U/L, reaching a production 7.39 folds higher than an obtained initially (16.34 ± 3.28 U/L). In the stage of enzyme production in a fixed-bed reactor, a total enzymatic activity of 105.3 U/L was obtained, which indicates that the new production mode was efficient. Thus, the present work allowed to evaluate aspects related to the culture conditions and to select the fungus Aspergillus terreus as a microorganism producer of extracellular L-asparaginase by FES, opening perspectives to explore this system, aiming at increasing scale production.

As L-asparaginases bacterianas (L-asparaginase amidohidrolase, E.C.3.S.1.1) são enzimas de alto valor terapêutico devido ao seu uso no tratamento de leucemia linfocítica aguda. A L-asparaginase da Escherichia coli por ser uma enzima periplásmica com alta afinidade, é particularmente efetiva em certas terapias de câncer infantil. Muitos agentes terapêuticos recentes são proteínas e peptídeos que surgiram do design molecular de drogas e tecnologia de DNA recombinante. Numerosos estudos têm demonstrado que aditivos preservam a estrutura e a atividade biológica de cada molécula destas proteínas. Entretanto, o mecanismo de proteção, pelo qual estes aditivos funcionam, não tem sido totalmente elucidado. O objetivo do presente trabalho é investigar detalhadamente o efeito da liofilização sobre a estrutura e a atividade enzimática da L-asparaginase, tanto em células íntegras de Escherichia coli, como na enzima purificada. Até recentemente a maneira para se avaliar o comportamento de um aditivo e o comportamento da água na estabilização de uma proteína durante a liofilização consistia na medida dos parâmetros de atividade após a reidratação, porém atualmente modernas técnicas de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) de baixa resolução são utilizadas para se entender o comportamento da água nas interações com proteínas. E a Espectroscopia de Infravermelho por Transformada de Fourier apresenta grande potencial no estudo de estabilização de proteínas durante a liofilização. Utilizou-se o cálculo de porcentagem de retenção de atividade para expressar os valores de atividade enzimática estudados. Estes cálculos foram realizados para os sistemas congelados e para os sistemas congelados e liofilizados. Os sistemas foram tratados em velocidades de congelamento diferentes (20°C/min, SOC/min e 2°C/min), sendo em seguida liofilizados por 24 horas. São apresentados resultados sobre o efeito das diferentes velocidades de congelamento e o efeito da liofilização nos diferentes sistemas aditivo-enzima e aditivo-célula. Utilizaram-se os aditivos: sacarose, maltose, lactose, inositol, manitol e trealose testados em diferentes concentrações (30, 90 e 150mM). Para identificar quais as condições e os aditivos que apresentaram uma crioproteção satisfatória. Nos sistemas maltose-enzima e trealose-enzima observou-se um aumento da crioproteção com o aumento da concentração de aditivo. Para os sistemas maltose-enzima, congelados lentamente, os resultados de retenção de atividade foram: 8,67%, 14,02% e 30,80% respectivamente para 30, 90 e 150mM. O sistema enzima-maltose (150mM) congelado rapidamente e liofilizado apresentou a maior retenção de atividade (111,11 %) e também o maior valor de T2 (81µs) nos resultados referentes a RMN. Nos sistemas trealose-enzima nas concentrações de 90 e 150mM apresentaram retenção de atividade 89,93% e 79,74%, respectivamente. / Bacterial L-asparaginase (L-asparaginase amidohydrolase, E.C. 3.5.1.1) are enzymes of high therapeutic value due to their use in the treatment of lymphocytic acute leukemia. Escherichia coli L-asparaginase is a periplasmic enzyme of high affinity, particularly effective in some kinds of childhood cancer therapies. Several studies have showed that there are specific stabilizing additives preserve the structure and the biological activity of protein molecules (lyoprotectant). However, the protection mechanism for these excipients has not been totally elucidated yet. The aim of this work was investigate the effect of freeze-drying on the enzymatic activity of L-asparaginase using both the purified enzyme as well as intact cells of Escherichia coli. Until recently the way to evaluate the behavior of an addictive one and the behavior of the water in the stabilization of a protein during the freeze-drying consisted of the measure of the activity parameters after the reidratação, even so now modem techniques of the Nuclear Magnetic Resonance of low resolution have been used to understand the behavior of the water in the interactions with proteins. It is Infrared Spectroscopy for Fourier Transformed it presents a great potential in the study of stabilization of proteins during the freeze-drying. The calculation of percentage of activity retention was used to express the studied values of enzymatic activity. These calculations were accomplished for the frozen systems and for the frozen systems and freeze-dryied. The systems were treated in three speeds of different freezing (20°C/min, 5°C/min and 2°C/min), being the freeze-drying for 24 hours. Results are presented on the effect of the freeze-drying in the different systems addictive-enzyme and addictive-cell. The addictive ones were used: sucrose, maltose, lactose, inositol, manitol and trehalose tested in different concentrations (30, 90 and 150mM), to identify which the conditions and the addictive ones that presented a satisfactory cryoprotection. For the systems enzyme-maltose, frozen slowly, the results of activity retention were: 8,67%, 14,02% e 30,80% to 30,90 e 150mM,respectively . The system enzyme-maltose (150mM) frozen quickly and freeze-dryied presented the largest activity retention (111,11 %) and also the largest value of T2 (81 µs) in the referring results NMR. The systems enzyme-trealose in the concentrations of 90 and 150mM they presented retention of activity 89,93% and 79,74%, respectively.

As L-asparaginases bacterianas (L-asparaginase amidohidrolase, E.C.3.S.1.1) são enzimas de alto valor terapêutico devido ao seu uso no tratamento de leucemia linfocítica aguda. A L-asparaginase da Escherichia coli por ser uma enzima periplásmica com alta afinidade, é particularmente efetiva em certas terapias de câncer infantil. Muitos agentes terapêuticos recentes são proteínas e peptídeos que surgiram do design molecular de drogas e tecnologia de DNA recombinante. Numerosos estudos têm demonstrado que aditivos preservam a estrutura e a atividade biológica de cada molécula destas proteínas. Entretanto, o mecanismo de proteção, pelo qual estes aditivos funcionam, não tem sido totalmente elucidado. O objetivo do presente trabalho é investigar detalhadamente o efeito da liofilização sobre a estrutura e a atividade enzimática da L-asparaginase, tanto em células íntegras de Escherichia coli, como na enzima purificada. Até recentemente a maneira para se avaliar o comportamento de um aditivo e o comportamento da água na estabilização de uma proteína durante a liofilização consistia na medida dos parâmetros de atividade após a reidratação, porém atualmente modernas técnicas de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) de baixa resolução são utilizadas para se entender o comportamento da água nas interações com proteínas. E a Espectroscopia de Infravermelho por Transformada de Fourier apresenta grande potencial no estudo de estabilização de proteínas durante a liofilização. Utilizou-se o cálculo de porcentagem de retenção de atividade para expressar os valores de atividade enzimática estudados. Estes cálculos foram realizados para os sistemas congelados e para os sistemas congelados e liofilizados. Os sistemas foram tratados em velocidades de congelamento diferentes (20°C/min, SOC/min e 2°C/min), sendo em seguida liofilizados por 24 horas. São apresentados resultados sobre o efeito das diferentes velocidades de congelamento e o efeito da liofilização nos diferentes sistemas aditivo-enzima e aditivo-célula. Utilizaram-se os aditivos: sacarose, maltose, lactose, inositol, manitol e trealose testados em diferentes concentrações (30, 90 e 150mM). Para identificar quais as condições e os aditivos que apresentaram uma crioproteção satisfatória. Nos sistemas maltose-enzima e trealose-enzima observou-se um aumento da crioproteção com o aumento da concentração de aditivo. Para os sistemas maltose-enzima, congelados lentamente, os resultados de retenção de atividade foram: 8,67%, 14,02% e 30,80% respectivamente para 30, 90 e 150mM. O sistema enzima-maltose (150mM) congelado rapidamente e liofilizado apresentou a maior retenção de atividade (111,11 %) e também o maior valor de T2 (81µs) nos resultados referentes a RMN. Nos sistemas trealose-enzima nas concentrações de 90 e 150mM apresentaram retenção de atividade 89,93% e 79,74%, respectivamente. / Bacterial L-asparaginase (L-asparaginase amidohydrolase, E.C. 3.5.1.1) are enzymes of high therapeutic value due to their use in the treatment of lymphocytic acute leukemia. Escherichia coli L-asparaginase is a periplasmic enzyme of high affinity, particularly effective in some kinds of childhood cancer therapies. Several studies have showed that there are specific stabilizing additives preserve the structure and the biological activity of protein molecules (lyoprotectant). However, the protection mechanism for these excipients has not been totally elucidated yet. The aim of this work was investigate the effect of freeze-drying on the enzymatic activity of L-asparaginase using both the purified enzyme as well as intact cells of Escherichia coli. Until recently the way to evaluate the behavior of an addictive one and the behavior of the water in the stabilization of a protein during the freeze-drying consisted of the measure of the activity parameters after the reidratação, even so now modem techniques of the Nuclear Magnetic Resonance of low resolution have been used to understand the behavior of the water in the interactions with proteins. It is Infrared Spectroscopy for Fourier Transformed it presents a great potential in the study of stabilization of proteins during the freeze-drying. The calculation of percentage of activity retention was used to express the studied values of enzymatic activity. These calculations were accomplished for the frozen systems and for the frozen systems and freeze-dryied. The systems were treated in three speeds of different freezing (20°C/min, 5°C/min and 2°C/min), being the freeze-drying for 24 hours. Results are presented on the effect of the freeze-drying in the different systems addictive-enzyme and addictive-cell. The addictive ones were used: sucrose, maltose, lactose, inositol, manitol and trehalose tested in different concentrations (30, 90 and 150mM), to identify which the conditions and the addictive ones that presented a satisfactory cryoprotection. For the systems enzyme-maltose, frozen slowly, the results of activity retention were: 8,67%, 14,02% e 30,80% to 30,90 e 150mM,respectively . The system enzyme-maltose (150mM) frozen quickly and freeze-dryied presented the largest activity retention (111,11 %) and also the largest value of T2 (81 µs) in the referring results NMR. The systems enzyme-trealose in the concentrations of 90 and 150mM they presented retention of activity 89,93% and 79,74%, respectively.

A L-asparaginase (EC 3.5.1.1) é a enzima responsável pela hidrólise da L-asparagina em ácido L-aspártico e amônia, sendo utilizada como agente antitumoral e também para reduzir o conteúdo de acrilamida, composto neurotóxico e carcinogênico, presente em certos alimentos processados a altas temperaturas. Atualmente, o número de trabalhos referentes à produção de L-asparaginase por leveduras e fungos é limitado, principalmente quanto à produção da enzima de forma extracelular em fermentação em estado sólido (FES). Assim, o presente trabalho visou avaliar a produção de L-asparaginase extracelular por FES utilizando fungos e leveduras. Foi avaliado um grupo de 10 cepas de microrganismos como potenciais produtores de L-asparaginase extracelular. Na FES empregou-se o bagaço de cana-de-açúcar (80% de umidade relativa) como suporte suplementado com meio Czapek-Dox modificado e essas foram realizadas em frascos Erlenmeyer de 50 mL a 30 °C por 72 horas para leveduras e 96 horas para o fungo A. terreus. A atividade enzimática foi determinada pela metodologia do hidroxamato e confirmada por testes de cromatografia em camada delgada. Após a seleção dos microrganismos produtores de L-asparaginase extracelular, foi testada a influência de diferentes fontes de carbono, fontes de nitrogênio, pH, tamanhos de partícula e temperaturas na produção de L-asparaginase extracelular por FES utilizando um arranjo ortogonal Taguchi L\'16. Após essa etapa de seleção das variáveis foram realizados ensaios visando a otimização do processo, avaliando o efeito da concentração da fonte de carbono e nitrogênio por planejamento composto central rotacional (DCCR) 24. Finalmente, e com as melhores condições, avaliou-se a produção de L-asparaginase em reator em coluna de leito fixo com volume de 180 mL. Dos microrganismos testados na etapa de seleção, o fungo filamentoso Aspergillus terreus CCT7693 demostrou resultados positivos de atividade asparaginolítica, sendo este selecionado para os experimentos posteriores. De acordo com o arranjo ortogonal Taguchi L\'16, a maior produção de L-asparaginase extracelular (112,57 ± 13,65 U/L) foi obtida quando a maltose foi utilizada como fonte de carbono; a glutamina como fonte de nitrogênio (indutor); pH de 5,5; tamanho de partícula inferior a 0,850 mm e temperatura de 25 °C. No DCCR foram determinadas como condições otimizadas uma concentração de amido de 0,54%; ausência de maltose; concentração de L-asparagina de 0,44% e concentração de L-glutamina de 1,14%, obtendo-se uma atividade L-asparaginase máxima de 120,732 ± 16,77 U/L atingindo uma produção 7,39 vezes superior àquela obtida inicialmente (16,34 ± 3,28 U/L). Na etapa de produção da enzima em reator em coluna de leito fixo obteve-se uma atividade enzimática máxima total de 105,3 U/L demonstrando que este novo modo de produção utilizado foi eficaz. Assim, o presente trabalho permitiu avaliar aspectos relacionados com as condições de cultivo e selecionar o fungo Aspergillus terreus CCT7693 como microrganismo produtor de L-asparaginase extracelular por FES, abrindo perspectivas para explorar este sistema visando aumento de escala de produção. / L-asparaginase (EC 3.5.1.1) is the enzyme that hydrolyses L-asparagine into L-aspartic acid and ammonia. It can be used as a chemotherapeutic agent and also to reduce acrylamide concentration, a neurotoxic and carcinogenic compound, present in certain foods processed at high temperatures. Currently, the amount of works related to Lasparaginase production by yeast and fungi is limited, mainly when it comes to extracellular enzyme production under solid-state fermentation (SSF). Thus, the present work aimed to evaluate the production of extracellular L-asparaginase by SSF using fungi and yeasts. The potential to produce extracellular L-asparaginase was evaluated within a group of 10 strains of microorganisms. In the SSF, sugarcane bagasse (80% relative humidity) was used as support, supplemented with modified Czapek-Dox medium, and the fermentations were done in 50 mL-Erlenmeyer flasks at 30 °C, for 72 hours for yeasts and 96 hours for A. terreus fungus. The enzymatic activity was determined by hydroxamate methodology and confirmed by thin-layer chromatography. After the selection of the extracellular Lasparaginase producing microorganisms, the influence of different carbon and nitrogen sources (inductor), pH, particle sizes and temperatures was tested for the extracellular Lasparaginase production by SSF, using a Taguchi L\'16 orthogonal array. After this initial screening of variables stage, assays aiming at optimizing the process were performed, evaluating the effect of carbon and nitrogen source concentration by central composite design 24 (CCD). With the best conditions, the production of L-asparaginase was assayed in a fixed-bed column reactor with a volume of 180 mL. Among the microorganisms tested in the selection stage, only the filamentous fungus Aspergillus terreus CCT7693 showed positive results for asparaginolytic activity, and it was selected for the later experiments. According to orthogonal array Taguchi L\'16, the highest production of extracellular Lasparaginase (112.57 ± 13.65 U/L) was obtained when maltose was used as carbon source; L-glutamine as nitrogen source (inductor); pH 5.5; particle size less than 0.850 mm and temperature of 25 °C. Through CCD, the optimized conditions were set as: 0.54% starch concentration; absence of maltose; 0.44% L-asparagine concentration and 1.14% Lglutamine concentration. The maximum L-asparaginase activity obtained was 120.723 ± 16.77 U/L, reaching a production 7.39 folds higher than an obtained initially (16.34 ± 3.28 U/L). In the stage of enzyme production in a fixed-bed reactor, a total enzymatic activity of 105.3 U/L was obtained, which indicates that the new production mode was efficient. Thus, the present work allowed to evaluate aspects related to the culture conditions and to select the fungus Aspergillus terreus as a microorganism producer of extracellular L-asparaginase by FES, opening perspectives to explore this system, aiming at increasing scale production.

Translocation t(12;21) with the presence of the fusion gene ETV6-RUNX1 (TEL-AML1) is the most common chromosomal aberration found in acute lymphoblastic leukemia in childhood. The occurrence of the ETV6-RUNX1 is associated with excellent prognosis and high sensitivity to the treatment with the enzyme L-asparaginase (ASNase). Resistance to the drug aggravates the outlook of the patient and increases the risk of treatment failure, therefore, the CLIP working group has been for a long time involved in the identification of the mechanism of action of ASNase and the origin of the resistance to it. This thesis follows previous findings of the group and is devoted to the analysis of the importance of ETV6-RUNX1 and signalization and metabolic changes accompanying shifts in the L-asparaginase resistance. In the first part of the thesis, the knockout clones with stable increased resistance to ASNase have been established thanks to the CRISPR/Cas9 system, which created frameshift in the fusion gene. The accomplishment in this regard and removal of the fusion protein was confirmed on the level of DNA, mRNA a protein expression. The presence of other significant chromosomal aberrations affection the sensitivity to ASNase was ruled out by the means of SNP analysis. In the second part of the project, the signalization...

Translocation t(12;21) with the presence of the fusion gene ETV6-RUNX1 (TEL-AML1) is the most common chromosomal aberration found in acute lymphoblastic leukemia in childhood. The occurrence of the ETV6-RUNX1 is associated with excellent prognosis and high sensitivity to the treatment with the enzyme L-asparaginase (ASNase). Resistance to the drug aggravates the outlook of the patient and increases the risk of treatment failure, therefore, the CLIP working group has been for a long time involved in the identification of the mechanism of action of ASNase and the origin of the resistance to it. This thesis follows previous findings of the group and is devoted to the analysis of the importance of ETV6-RUNX1 and signalization and metabolic changes accompanying shifts in the L-asparaginase resistance. In the first part of the thesis, the knockout clones with stable increased resistance to ASNase have been established thanks to the CRISPR/Cas9 system, which created frameshift in the fusion gene. The accomplishment in this regard and removal of the fusion protein was confirmed on the level of DNA, mRNA a protein expression. The presence of other significant chromosomal aberrations affection the sensitivity to ASNase was ruled out by the means of SNP analysis. In the second part of the project, the signalization...

Récemment, une nouvelle classe d'ADN circulaire extrachromosomique (eccDNA) appelée microADN a été identifiée dans des tissus humains et murins. Ces microADNs ont une longueur de 100 à 400 pb, sont dérivés de régions génomiques non répétitives uniques et présentent un enrichissement au niveau des régions géniques et riches en GC. Bien qu'il ait été proposé qu'ils puissent provenir du métabolisme de l'ARN ou des défauts de réplication, leurs mécanismes de production et leur éventuelle fonctionnalité restent à déterminer. Grâce à l'analyse des microADNs extraits d'une série de 10 lignées cellulaires lymphoblastoïdes humaines (LCL), nous avons confirmé la distribution nonaléatoire des microADNs vers les régions actives du génome. Les microADNs identifiés présentaient des loci d'origine redondants et une périodicité de taille de 190 pb pouvant correspondre à la fragmentation de l'ADN lors de l'apoptose caspase-dépendante. L'apoptose induite de ces LCLs par des drogues chimiothérapeutiques (méthotrexate ou L-asparaginase) a entrainé la modulation de la diversité et de la taille des microADNs, suggérant qu'une partie de ces entités pourrait être des produits résiduels de la mort cellulaire apoptotique. Ainsi, bien que compatible avec l'observation initiale suggérant que les microADNs proviennent d'un processus physiologique normal, ces résultats impliquent une source de production alternative ou complémentaire. / Recently, a new class of extrachromosomal circular DNA (eccDNA) called microDNA was identified in mouse and human tissues. These microDNAs are 100 to 400 bp long, derive from unique nonrepetitive genomic regions and show an enrichment in GC rich and genic sequences. While it has been proposed that they could arise from RNA metabolism or replication defects, their production mechanisms and eventual functionality remain unclear. Through the analysis of microDNAs extracted from a series of 10 human lymphoblastoid cell lines (LCLs), we confirmed the non-random distribution of microDNA towards active regions of the genome. Identified microDNAs showed redundant loci of origin and a size periodicity of 190 bp that matched caspase-dependant DNA fragmentation of apoptotic cells. Strikingly, the chemotherapeutic drug-induced apoptosis (using methotrexate or Lasparaginase) of these LCLs modulated both diversity and size of microDNAs further suggesting that a part of microDNAs could represent circularized by-products of the programmed cell death. Thus, while compatible with the original observation that microDNAs originated from a normal physiological process, these results imply an alternative or complementary source of production.