Utilizada amplamente no tratamento de Leucemias Linfoblásticas Agudas, a L-Asparaginase é uma enzima que atua diminuindo a concentração de L-asparagina livre no plasma e, dessa forma, impede a proliferação de células cancerígenas. Isso ocorre porque tais células, ao contrário das células saudáveis, não conseguem sintetizar o aminoácido L-asparagina que necessitam para a síntese proteica por não possuírem a enzima asparagina sintetase devido a um silenciamento genético. A L-Asparaginase utilizada no Brasil era importada e produzida em bactéria, o que gerava problemas com custo e abastecimento, além de causar algumas reações imunológicas aos usuários. Isso impulsiona a encontrar alternativas para produção nacional de tal enzima e, se possível, com menor potencial alergênico. Para isso, foi estudada a produção da enzima L-Asparaginase do gene ASP1 de Saccharomyces cerevisiae em sistema de expressão heteróloga Pichia pastoris através da clonagem do gene sintético (ASP1), com códons otimizados para expressão em P. pastoris, estudo este nunca antes realizado ao que se sabe. Além disso, a produção da enzima foi realizada com auxílio de um planejamento experimental fatorial em agitador orbital levando em conta as variáveis: pH, temperatura e concentração do indutor. A melhor condição encontrada dentre as estudadas neste trabalho foi, a temperatura de 20°C, pH 6,0 e concentração de indutor de 1,5% que alcançou uma atividade de 6,9 U/g de célula e apesar do esforços, o peptídeo sinal utilizado (alfa da S. cerevisiae) não foi capaz de promover a secreção da enzima para o meio extracelular.Deve-se salientar que a realização de um maior número de ensaios através de um planejamento experimental fatorial fracionário para encontrar uma região de rendimentos máximos talvez melhore o ajuste dos modelos mostrados. Este trabalho foi a primeira tentativa de expressão do gene ASP1 de S. cerevisiae em Pichia pastoris até o momento, e pretende-se aprofundar mais este estudo. / Used widely in the treatment of Acute lymphoblastic leukemia, L-Asparaginase is an enzyme that acts by decreasing the concentration of L-asparagine free in the plasma and thus prevents the proliferation of cancer cells. This is because such cells, in contrast to healthy cells can not synthesize L-asparagine amino acid for protein synthesis need not possess the enzyme asparagine synthetase due to a gene silencing. The L-asparaginase used in Brazil was imported and produced in bacteria, which caused problems with cost and supply, as well as cause some immune responses to users. This boosts find alternatives to domestic production of this enzyme and, if possible, less allergenic potential. For this, the production of L-asparaginase enzyme ASP1 Saccharomyces cerevisiae gene heterologous to Pichia pastoris expression system was investigated by cloning the synthetic gene (ASP1), with codons optimized for expression in P. pastoris, this study never before achieved to what is known. Furthermore, the enzyme production was performed with the aid of a factorial design in an orbital shaker taking into account the following variables: pH, temperature and concentration of inducer. The best condition found among those studied in this work was a temperature of 20 ° C, pH 6.0 and concentration of 1.5% inductor attained an activity of 6.9 U / g cell and despite the efforts, used signal peptide (S. cerevisiae alpha) was not able to promote the secretion of the enzyme into the medium extracelular.Deve be noted that the achievement of a greater number of tests using a fractional factorial design yields to find a region maximum might improve the fit of the models shown. This work was the first attempt to ASP1 gene expression of S. cerevisiae in Pichia pastoris to date, and is intended to further deepen this study.

A L-asparaginase (EC 3.5.1.1) é uma enzima importante para o tratamento da leucemia linfoblástica aguda (LLA), neoplasia mais frequente em crianças e adolescentes. A L-asparaginase hidrolisa a L-asparagina resultando em ácido aspártico e amônio, impedindo que as células tumorais utilizem esse aminoácido para síntese proteica, ocasionando a morte celular apoptótica. Atualmente a enzima é obtida a partir de Escherichia coli e Erwinia chrysanthemi; no entanto, ambas as formulações estão associadas a um alto índice de efeitos adversos que comprometem a evolução e eficácia do tratamento. A levedura Saccharomyces cerevisiae tem o gene ASP1 responsável pela produção de L-asparaginase 1 (Sc_ASPase1) que tem sido pouco estudada. Para elucidar as características de Sc_ASPase1 nós expressamos a proteína em E. coli BL21(DE3) e a purificamos por cromatografia de afinidade. Sc_ASPase1 tem uma atividade especifica de 195,4 U/mg para L-asparagina e de 0,36 U/mg para L-glutamina, e um comportamento alostérico com um K0.5 de 75 µM para L-asparagina. Por meio de mutação sitio dirigida demonstramos a importância dos resíduos Thr64-Thy78-Th141-Lys215 para a catálise. As isoformas mutantes da proteína A331D, K335E, Y243S, S301N e ΔG77 não apresentaram melhoria nos parâmetros cinéticos ou atividade específica. Construímos e clonamos Sc_ASPase1 com a deleção dos primeiros 52 aminoácidos, porém nas condições testadas a proteína foi expressa na forma insolúvel. Demonstramos que Sc_ASPase1 possui potencial antineoplásico, pois com 10 U/mL de enzima foi capaz causar a 85% de mortalidade da linhagem leucêmica MOLT-4. Na mesma concentração, a enzima de E. coli é capaz de matar 95% de células dessa mesma linhagem. / L-Asparaginase (EC 3.5.1.1) is an important enzyme for the treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL), the most common malignancy in children and adolescents. L-asparaginase hydrolyzes L-asparagine resulting in ammonium and aspartic acid, preventing tumor cells of using such amino acid for protein synthesis, leading to apoptotic cell death. Currently, the enzyme is obtained from Escherichia coli and Erwinia chrysanthemi; however, both formulations are associated with a high incidence of side effects that compromise the progress and effectiveness of treatment. The yeast Saccharomyces cerevisiae has ASP1 gene responsible for the production of L-asparaginase 1 (Sc_ASPase1) that has been poor studied. To elucidate the characteristics of Sc_ASPase1, we expressed the protein in E. coli BL21 (DE3) cells and purified it by affinity chromatography. Sc_ASPase1 has a specific activity of 195.4 U/mg for L-asparagine and 0.36 U/mg for L-glutamine, and an allosteric behavior with a K0.5 of 75 µM for L-asparagine. Through site directed mutation, we demonstrated the importance of Thr64-Thy78-Th141-Lys215 residues for catalysis. The mutant protein isoforms A331D, K335E, Y243S, S301N and ΔG77 showed no improvement in kinetic parameters or specific activity. We build and cloned Sc_ASPase1 with the deletion of the first 52 amino acids, but under the conditions tested the protein was expressed in insoluble form. Sc_ASPase1 have demonstrated potential antineoplastic activityc, since 10 U/mL of enzyme lead to 85% of mortality in leukemia cell line MOLT-4. At the same concentration, the E. coli enzyme kills 95% of the cells of the same line.

Submitted by Jean Medeiros (jeanletras@uepb.edu.br) on 2018-05-21T15:25:31Z No. of bitstreams: 1 PDF - Anna Emmanuela Medeiros de Brito.pdf: 29262242 bytes, checksum: b0fe663b1a5e1b8e8d845a03a6b68c4a (MD5) / Approved for entry into archive by Secta BC (secta.csu.bc@uepb.edu.br) on 2018-05-23T16:59:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 PDF - Anna Emmanuela Medeiros de Brito.pdf: 29262242 bytes, checksum: b0fe663b1a5e1b8e8d845a03a6b68c4a (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-23T16:59:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PDF - Anna Emmanuela Medeiros de Brito.pdf: 29262242 bytes, checksum: b0fe663b1a5e1b8e8d845a03a6b68c4a (MD5) Previous issue date: 2017-02-17 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Acute lymphocytic leukemia (ALL) is a type of cancer that compromises the maturation of blood cells of the lymphoblastic lineage, being prevalent in children, but with a good chance of cure due to chemotherapy. The biopharmaceutical L-asparaginase (L- ASNase) is one of the main drugs used in the treatment of this neoplasm, but the immunogenicity derived from the bacterial origin of the enzyme currently produced and the consequent short half-life are challenges to be overcome by the pharmaceutical industry. In this sense, nanobiotechnology is a broad platform for the development of drug delivery aimed at the transport of therapeutic enzymes, besides being able to overcome these problems, it still allows better protein stability with regard to aggregation and denaturation that result in a decrease in enzymatic activity and consequently the pharmacological action. Thus, the objective of this work was to obtain and characterize poly (lactic acid-co-glycolic acid) nanoparticles (PLGA) for L-ASNase encapsulation. The double emulsification method by homturrizing with ultraturrax or cavitation with ultrasound probe was used to obtain the systems, using different times (30 or 60 s) and from two types of PLGA 50:50 with different molecular weights (30-60 KDa e 24-38 KDa) and polyvinyl alcohol (PVA) at concentrations of 0.5, 1, 1.5 and 2%. The size and polydispersity of the nanoparticles were evaluated by dynamic light scattering (DLS). The evaluation of the ASNase encapsulation was performed by quantification of total proteins by the indirect (in the supernatant) and direct method (in the ruptured nanoparticle system). By the nessler method, it was possible to observe that the encapsulated enzyme presented greater activity than the free enzyme. The enzyme release study was performed by dialysis, where < 60% of protein was released in 48 hours. The L-ASNase encapsulation monitoring was performed using native gel electrophoresis and zymogram. Circular dichroism was also used to evaluate the conformational changes of the encapsulated enzyme. From PLGA 30-60 KDa systems were obtained with sizes predominantly between 400 and up to more than 1 μm, with large variation in sizes between them, and for PLGA 24-38 KDa the size range is from 380 nm to 670 nm. Cavitation and higher concentration of PVA resulted in the formation of systems without coalescence. The system made with PLGA 24-38 KDa obtained by cavitation with 1% PVA with homogenization time of 60 s was chosen for ASNase encapsulation and presented encapsulation efficiency by the direct method of 86.67% (± 1.84) and by the method of 95.35% (± 0.06). According to the hemolysis essay, the systems with and without the enzyme were nonhemolytic. / A Leucemia Linfoide Aguda (LLA) é um tipo de câncer que compromete a maturação das células sanguíneas da linhagem linfoblástica, sendo prevalente em crianças, mas com boas chances de cura advinda da quimioterapia. O biofármaco L-asparaginase (L- ASNase) é um dos principais fármacos usados no tratamento desta neoplasia, porém a imunogenicidade advinda da origem bacteriana da enzima atualmente produzida e o consequente tempo de meia-vida curto são desafios a serem vencidos pela indústria farmacêutica. Neste sentido, a nanobiotecnologia é uma ampla plataforma para o desenvolvimento de drug delivery visando o carreamento de enzimas terapêuticas, podendo além de contornar estes problemas, ainda permitir melhor estabilidade das proteínas no que diz respeito à agregação e desnaturação que resultam em diminuição da atividade enzimática e consequentemente da ação farmacológica. Assim, o objetivo deste trabalho foi a obtenção e caracterização de nanoparticulas do tipo nanoesferas de poli (ácido lático- co- glicólico) (PLGA) para encapsulação da L-ASNase. O método de dupla emulsificação por homogeinização com ultraturrax ou cavitação com sonda de ultrassom foi usado para obtenção dos sistemas, empregando diferentes tempos (30 ou 60 s) e a partir de dois tipos de PLGA 50:50 com diferentes pesos moleculares (30-60 KDa e 24-38 KDa) e álcool polivinílico (PVA) nas concentrações de 0,5;1;1,5 e 2%. O tamanho e polidispersão das nanopartículas foram avaliados por espalhamento de luz dinâmico (DLS). A avaliação da encapsulação da L-ASNase foi realizada por meio da quantificação de proteínas totais através do método indireto (no sobrenadante) e direto (no sistema de nanapartículas rompido). Através da nesslerização foi possível observar que a enzima encapsulada apresentou maior atividade que a enzima livre. O estudo de liberação da enzima foi realizado por meio de diálise, onde foi liberada < 60% de proteína em 48 horas. O monitoramento da encapasulação da L-ASNase foi feito por meio de eletroforese com gel nativo e zimograma. Também foi empregado dicroísmo circular para avaliação das alterações conformacionais da enzima encapsulada. A partir do PLGA 30-60 KDa foram obtidos sistemas com tamanhos predominantemente entre 400 nm e até mais de 1 µm, com grande variação de tamanhos entre eles, já para PLGA 24-38 KDa a faixa de tamanho é de 380 nm a 670 nm. A cavitação e maior concentração de PVA resultou na formação de sistemas sem coalescência. O sistema feito com PLGA 24-38 KDa obtido por cavitação com PVA 1% com tempo de homogeneização de 60 s foi escolhido para encapsulação da ASNase e apresentou eficiência de encapsulação pelo método direto de 86,67 % (± 1,84) e pelo método indireto de 95,35%(± 0,06). De acordo com o ensaio de hemólise, os sistemas com e sem a enzima se mostraram não hemolíticos.

Orientador: Ladaslav Sodek / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T03:29:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Antunes_Flavia_D.pdf: 1073820 bytes, checksum: 6e64fd3cfacb0349c805df4ac60bcf24 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: O sistema radicular da soja (Glycine max L.) é um importante sítio da assimilação do nitrogênio (N), seja pela assimilação do nitrato nas raízes, seja pela fixação simbiótica de N atmosférico nos nódulos. Os principais produtos da assimilação do N inorgânico, os aminoácidos asparagina e glutamina, os ureídeos, a alantoína e o ácido alantóico, são usados no transporte de N para a parte aérea. Assim, esses produtos representam uma fonte de N reduzido tanto para os sítios de consumo, quanto para a formação de outros aminoácidos, proteínas, ácidos nucléicos e dos demais compostos nitrogenados sintetizados na célula. O transporte do N assimilado no sistema radicular para a parte aérea é realizado exclusivamente via xilema. Portanto, o objetivo geral deste trabalho foi, relacionar mudanças na composição de aminoácidos transportados no xilema de plantas de soja, provocadas pela deficiência de N, com o comportamento de enzimas de assimilação do N, encontradas no sistema radicular. Para causar a deficiência do N, as plantas de soja foram transferidas para um meio hidropônico sem nitrato ou qualquer outra fonte de N inorgânico. Nas plantas não-noduladas a deficiência se deu pela ausência do nitrato no meio de cultivo, e nas plantas noduladas, a manutenção em hidroponia inibiu a fixação do N2. Foi observado um aumento na razão aspartato/asparagina (ASP/ ASN) na seiva do xilema das plantas não-noduladas e noduladas, quando foram submetidas à deficiência do N. Contudo, nas plantas noduladas esse aumento foi acentuado apenas no primeiro dia do tratamento. A recuperação do estresse só ocorreu em plantas não-noduladas, nas quais as concentrações de ASP e ASN retomaram seus valores. As análises da expressão dos genes que codificam a asparagina sintetase (AS) no sistema radicular das plantas de soja, durante o , leva à uma diminuição dos níveis de glutamina, produto imediato da assimilação do íon amônio através da enzima glutamina sintetase (GS). Com a redução dos níveis de glutamina a atividade da AS também é reduzida, resultando na menor utilização de ASP. Em plantas não-noduladas, após transferência para o meio hidropônico sem nitrato, a expressão dos três genes para AS diminuiu bruscamente, e após o retorno das plantas ao meio com nitrato, os genes da AS foram expressos novamente. Nas plantas noduladas a expressão gênica da AS também reduziu durante o tratamento de deficiência de N, porém, apenas o gene SAS1 parece ter sido afetado. O gene SAS1 não recuperou seus níveis de expressão durante a tentativa de recuperação do estresse. Este fato é mais uma evidência da relação da AS com as alterações no perfil de aminoácidos transportados na seiva do xilema, pois as concentrações de ASN e ASP na seiva do xilema também não foram retomadas. tratamento e recuperação do estresse de N, indicam que essa enzima está relacionada com as alterações na razão ASP/ASN. A AS é a enzima que catalisa a biossíntese da ASN, transferindo o grupo amino da glutamina para o aspartato, produzindo asparagina e glutamato. A queda no suprimento de N, seja pelo impedimento da assimilação do nitrato ou da fixação do N2. Devido à importância da enzima redutase do nitrato (RN) no processo de assimilação do nitrato pelo sistema radicular, foi avaliado o seu comportamento durante o tratamento de deficiência do nitrato e sua recuperação. A atividade da RN aumentou, consideravelmente, quando as plantas foram expostas ao nitrato. Esse aumento pôde ser observado em raízes de plantas de soja não-noduladas e também no sistema radicular (raízes e nódulos) das plantas noduladas. Quando as plantas não-noduladas foram transferidas para uma solução sem nitrato, a atividade da RN caiu, apresentando valores muito baixos dentro de 24 horas. As atividades da RN ) parece bastante clara. De qualquer forma, a forte dependência da RN da presença do nitrato é um dado inédito para raízes de plantas de soja. O nitrato também afetou a expressão gênica da AS nas raízes de plantas noduladas, cultivadas sem nenhuma fonte de N mineral. A expressão dos genes da AS aumentou quando essas plantas receberam solução contendo nitrato. nas raízes e nódulos de plantas de soja, cultivadas na ausência do nitrato, foram muito baixas, sendo que em nódulos a atividade sempre foi ligeiramente maior que nas raízes. A baixa atividade encontrada nas raízes e nódulos de soja pode representar a forma constitutiva da enzima, pois as plantas foram cultivadas sem a adição do nitrato durante o ciclo todo. Entretanto, não pode ser descartada a possibilidade da presença de traços de nitrato na água usada para regar as plantas e isto ter sido suficiente para induzir a baixa atividade encontrada. Se por um lado podem existir dúvidas quanto ao fato da enzima ser constitutiva, a indução da enzima pelo substrato (NO3- Os dados sobre o comportamento das enzimas avaliadas aqui indicam que as alterações em aminoácidos transportados no xilema, em plantas de soja submetidas à deficiência de N, estão relacionadas com os processos assimilatórios do sistema radicular, e que a AS parece ser a principal responsável pelas alterações na razão ASP/ASN / Abstract: The root system of soybean (Glycine max L.) is an important site for the assimilation of nitrogen, whether by nitrate assimilation in the roots, or by symbiotic nitrogen fixation in the nodules. The main products of inorganic nitrogen assimilation, the amino acids asparagine and glutamine and the ureides allantoin and allantoic acid, are used in the transport of assimilated nitrogen to the shoot. Thereby, these products represent a source of reduced nitrogen for the sink tissues, for the formation of other amino acids, proteins, nucleic acids and all the other nitrogenous compounds synthesized in the cell. Therefore, the objective of this study was to relate changes in the transport of nitrogen in the xylem of soybean caused by nitrogen deficiency with the behaviour of certain enzymes of nitrogen assimilation in the root system. Nitrogen deficiency was induced by the transfer of soybean plants to a hydroponic system without nitrate or any other source of inorganic nitrogen. In the case of non-nodulated plants deficiency was imposed by the interruption of nitrate assimilation by the roots, and for the nodulated plants nitrogen fixation was inhibited by immersion of the nodules in the hydroponic system. Under nitrogen deficiency, an increase in the aspartate/asparagine (ASP/ASN) ratio of the xylem sap was observed in both nodulated and non-nodulated plants. Nevertheless, this increase was substantial only on the first day of treatment. The recovery from the stress was only observed for the non-nodulated plants, where the levels of ASP and ASN returned to their initial values. Analyses of asparagine synthetase expression in the root system of soybean during treatment and recovery from nitrogen stress indicates that this enzyme can underlay the changes in ASP/ASN ratios. AS is an enzyme that catalyses the biosynthesis of Asn, by transferring the amide nitrogen from glutamine to aspartate, producing asparagine and glutamate. The fall in N supply, whether by interruption of nitrate assimilation or nitrogen fixation, leads to a decline in glutamine, the immediate product of ammonium ion assimilation via glutamine synthetase. With the reduction in glutamine levels the activity of AS is also reduced resulting in diminished utilization of ASP. In non-nodulated plants, after the transfer to the hydroponic system without nitrate, the expression of the three genes declines sharply, and after the return of the plants to a supply of nitrate the AS genes are expression again. In nodulated plants the expression of AS was also reduced during treatment, however, in this case only the gene SAS1 was affected. The SAS1 gene did not recover its initial levels of expression after removing the stress which is further evidence for the correlation between AS activity and the changes in ASP/ASN ratios in the xylem sap, since these ratios were also not recovered. In view of the importance of nitrate reductase (NR) in the process of nitrate assimilation by the root system, its behaviour was evaluated during nitrate deficiency and recovery. The activity of NR increased considerably when plants were supplied with nitrate, in the case of roots of non-nodulated as well as the root system (roots and nodules) of nodulated plants. When non-nodulated plants were transferred to a nutrient solution free of nitrate, NR activity fell sharply, almost disappearing within 24 hours. RN activities in roots and nodules of soybean grown in the absence of nitrate were very low, with activity in the nodules being somewhat higher than in the roots. The low activity found in the roots and nodules could be due to a constitutive enzyme since plants were grown throughout with nitrate-free medium. However, the possible presence of trace amounts of nitrate in the tap water used to irrigate the plants cannot be discarded and may have been sufficient to induce the low levels of enzyme found. If on the one hand there are doubts as to the presence of a constitutive enzyme, the presence of the induced form is very clear. In any case, the strong dependence of NR on the presence of nitrate is an unknown fact for soybean roots. Nitrate also affected the expression of AS in roots of nodulated plants grown without any mineral source of nitrogen, since its expression increased tremendously when such plants were supplied with nitrate. The data concerning the behaviour of the enzymes studied here indicate that alterations in xylem amino acids of soybean plants subjected to nitrogen deficiency are related to the assimilatory processes of the root system, and that AS appears to be mainly responsible for the changes in ASP/ASN ratios / Doutorado / Biologia Vegetal / Doutor em Biologia Vegetal

Submitted by Irene Nascimento (irene.kessia@ufpe.br) on 2017-04-10T17:01:48Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Iasmim Lucas da Silva.pdf: 2916095 bytes, checksum: c23cab722c74173251220dd40ba0f0cc (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-10T17:01:48Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Iasmim Lucas da Silva.pdf: 2916095 bytes, checksum: c23cab722c74173251220dd40ba0f0cc (MD5) Previous issue date: 2016-07-28 / Facepe / A L-asparaginase (E.C. 3.5.1.1) é essencial para um curso normal do ciclo celular, estando presente em bactérias, fungos, animais e plantas e não é encontrada em seres humanos. Importante para o tratamento da leucemia linfoblástica aguda dentre outras doenças leucêmicas e a doença de Hodgkin. As Pseudomonas são ocorrentes no solo e água, apresentam a capacidade de produzir enzimas, como é o caso da L-asparaginase do Tipo I e II. Com isso, o objetivo deste trabalho foi obter melhores parâmetros para otimização, purificação parcialmente da L-asparaginase excretada por Pseudomonas sp. isolada da rizosfera da Caesalpinia. pyramidalis. No presente estudo visando otimizar a produção do complexo de L-asparaginase foi realizado um planejamento experimental central composto (23) com 4 pontos centrais, sendo as variáveis pH (4, 7 e 10), temperatura (30°C, 40°C e 50°C) e concentração da L-asparagina (0,2%, 0,5% e 0,8%) estudadas. Posteriormente realizou-se a análise estatística das variáveis e a análise da variância (ANOVA) dos resultados obtidos que foram avaliados através do programa Statistica, versão 7.0 (StatSoft Co., USA). Em seguida, realizou-se a purificação da enzima L-asparaginase excretada por Pseudomonas sp. através da técnica de cromatografia de troca iônica e uma eletroforese SDS-PAGE. Posteriormente, foi realizada a caracterização da enzima purificada, avaliando os efeito e estabilidades em diferentes valores de pH e temperaturas, por fim a enzima em diferentes substratos e íons. Finalizando foram efetuadas as identificações morfológica e molecular da bactéria, utilizando o Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV) e a nível de espécie usou-se o primer 16 S respectivamente. Os resultados obtidos no procedimento de otimização da atividade de L-asparaginase foram obtidos nos ensaios com concentração de L-asparagina a 0,8%, pH 4 e temperatura de 30°C, com valores de atividades 0,5604 U/mL e 0,0632 mg de proteína/mL, respectivamente. Os melhores dados da cromatografia de troca iônica mostraram que das 57 frações coletadas, as de melhor atividade para L-asparaginase, foram as frações de valores 1,1412 U/mL e 1,1417 U/mL, com um rendimento de 0,64% e 18,6 U/mg de atividade específica. Realizou-se uma eletroforese PAGE-SDS para obter o peso molecular da proteína, apresentando como peso molecular de 32 kDa. Na caracterização enzimática, a enzima se mantem estável em pH 7, em relação a temperatura, tivemos a melhor estabilidade 30 °C, a L-asparaginase apresentou melhor efeito nos substratos L-asparagina seguido da L-glutamina e por fim o nitrato de sódio (NaNO3), cloreto de Mercúrio (HgCl2), cloreto de magnésio (MgCl2) e ureia apresentaram os melhores efeitos de íons. Em relação à identificação bacteriana encontrou-se colônias em forma de bastonetes curtos, com longos flagelos e a nível de espécie foi denominada com sendo Pseudomonas aeruginosa. Portanto, os resultados obtidos da L-asparaginase caracterizada, isolada da P. aeruginosa, mostraram resultados significativos e extremamente importantes para a indústria biotecnológica, apresentando assim a viabilidade e confiabilidade do estudo realizado. / L-asparaginase (E.C. 3.5.1.1) is essential for the normal course of cell cycle being present in bacteria, fungi, animals and plants and is not found in humans. Important for the treatment of acute lymphoblastic leukemia among other leukemic disease and Hodgkin's disease. The Pseudomonas are occurring in soil and water, have the capacity to produce enzymes, such as L-asparaginase Type I and II. Thus, the aim of this study was to obtain the best parameters for optimization, purification part of L-asparaginase secreted by Pseudomonas sp. isolated from the rhizosphere of Caesalpinia pyramidalis. In the present study to optimize the production of L-asparaginase complex was performed a central experimental design compound (23) with four central points and the variables pH (4, 7 and 10), temperature (30°C, 40°C and 50°C) and concentration of L-asparagine (0,2%, 0,5% and 0,8%) studied. Later there was the statistical analysis of the variables and analysis of variance (ANOVA) of the results that were evaluated through Statistica, version 7.0 (StatSoft Co., USA). Then there was the purification of L-asparaginase enzyme secreted by Pseudomonas sp. by ion exchange chromatography technique and SDS-PAGE electrophoresis. Afterwards, the characterization of the purified enzyme was carried out to evaluate the effect and stability at different pH values and temperatures, and finally the enzyme on different substrates and ions. Finalizing were made the morphological and molecular identification of bacteria using the Scanning Electron Microscope (SEM) and the kind of level we used the primer 16S respectively. The results of the optimization procedure for L-asparaginase activity in the assays were obtained with a concentration of L-asparagine to 0,8%, pH 4 and 30°C, with activity values 0,5604 U/mL and 0,0632 mg of protein/mL, respectively. The best data ionic exchange chromatography showed that the 57 collected fractions, the best activity to L-asparaginase were fractions values 1,1412 U/mL and 1,1417 U/mL, with a yield of 0,64 % and 18,6 U/mg specific activity. We performed a SDS-PAGE electrophoresis for the molecular weight of the protein, presenting as molecular weight of 32 kDa. In the enzyme characterization, the enzyme is stable at pH 7 with respect to temperature had better 30 °C stability, L-asparaginase had a better effect on the L-asparagine substrate followed by L-glutamine and finally sodium nitrate (NaNO3), mercury chloride (HgCl2), magnesium chloride (MgCl2) and urea showed the best effects ions. Regarding the bacterial identification met colonies in the form of short rods with flagella long and species level was named as being Pseudomonas aeruginosa. Therefore, the results of characterized L-asparaginase, isolated from P. aeruginosa, showed significant results and extremely important for the biotechnology industry, thus presenting the viability and reliability of the study performed.

A enzima L-asparaginase (L-asparagina amino hidrolase, E.C. 3.5.1.1) é uma das drogas mais utilizadas no tratamento da leucemia linfoblástica aguda. A enzima catalisa a hidrólise do aminoácido asparagina em ácido aspártico e amônia. Algumas linhagens de células tumorais não são capazes de produzir asparagina, dependendo do aminoácido presente no plasma para a síntese proteica. A redução dos níveis plasmáticos de asparagina inibe a síntese de proteínas e depois a síntese de RNA e DNA das células leucêmicas levando-as a morte por apoptose. A cepa de Aspergillus terreus (PC-1.7.A) utilizada nesse trabalho foi isolada de solo e produziu altas concentrações de L-asparaginase. O objetivo do presente trabalho foi purificar, caracterizar, conjugar a enzima e avaliar sua atividade citotóxica em linhagens de células tumorais in vitro. Para a purificação da enzima foram utilizados métodos cromatográficos de interação por troca iônica (DEAE Sepharose) e por gel filtração em diferentes fluxos (Sephacryl S-200HR). A enzima pura foi conjugada com metóxi polietilenoglicol e manteve 93% da atividade inicial. A enzima presente no fluido da cultura dialisado e concentrado manteve sua atividade por até 90 dias a 5ºC. Composta por uma subunidade com massa molecular de 125 kDa a L-asparaginase purificada de A. terreus apresentou atividade catalítica ótima em pH 9,5 e 40ºC e foi estável nessa temperatura por pelo menos 120 minutos. A enzima pura e pura-conjugada apresentou valores de Km de 2,42 e 2,51 mmol/L e Vmax de 11,91 e 12,08 umol.min-1.mg-1, respectivamente. A enzima pura-conjugada perdeu metade de sua atividade em trinta minutos quando incubada com enzimas proteolíticas, enquanto que a enzima pura perdeu metade de sua atividade em cinco minutos sob as mesmas condições. A L-asparaginase pura na concentração de 200 ug/mL reduziu em 50% as células viáveis das linhagens tumorais HL-60 e RS4;11 nos tempos de incubação de 72 e 96 horas, respectivamente, sob as mesmas condições a enzima pura não apresentou atividade citotóxica contra a linhagem controle (PBMC). / The enzyme L-asparaginase (L-asparagin amino hydrolase, E.C. 3.5.1.1) is one of the most commonly used drugs in the treatment of acute lymphoblastic leukaemia. This enzyme catalyzes a hydrolysis of amino acid asparagine into aspartic acid and ammonia. Some tumour cell lines are unable to produce asparagine depending on the amino acid in plasma for protein synthesis. Reduced levels of plasma asparagine inhibit protein synthesis and later synthesis of RNA and DNA in leukemic cells causing them to die by apoptosis. The strain of Aspergillus terreus (PC-1.7.A) in this work was isolated from soil and produced high concentrations of L-asparaginase. The aim of this study was to purify, characterize, conjugate the enzyme and to evaluate its cytotoxic activity in tumour cell lines in vitro. Enzyme purification was achieved by applying chromatography methods of ion exchange (DEAE Sepharose) and gel filtration (Sephacryl S-200HR) at different flows. The pure enzyme was conjugated with methoxy polyethylene glycol and kept 93% of initial activity. The enzyme present in dialysed and concentrated culture fluid maintained its activity for up to 90 days at 5°C. Composed of a subunit with molecular mass of 125 kDa, L-asparaginase purified from A. terreus showed optimum catalytic activity at pH 9.5 and 40°C and was stable at this temperature for at least 120 minutes. The pure and pure-conjugated enzymes showed Km values of 2.42 and 2.51 mmol/L and Vmax of 11.91 and 12.08 umol.min-1.mg-1 respectively. The pure-conjugated enzyme lost half of its activity in thirty minutes when incubated with proteolytic enzymes, while pure enzyme lost half of its activity in five minutes under same conditions. Pure L-asparaginase at a concentration of 200 ug/mL reduced by 50% number a viable cells in tumour cell lines HL-60 and RS4;11 in incubation times of 72 and 96 hours, respectively. Under same conditions pure enzyme showed no cytotoxic activity against control cell line.

A enzima L-asparaginase é responsável por converter o aminoácido L-asparagina em ácido L-aspártico e amônio. Esta enzima possui importantes aplicações, principalmente na indústria farmacêutica, onde é empregada como um fármaco antileucêmico e na indústria de alimentos, como uma forma de mitigar a formação de acrilamida, um composto altamente tóxico, formado em alguns alimentos processados a altas temperaturas. Leveduras destacam-se como micro-organismos importantes para a produção da Lasparaginase, uma vez que possivelmente produzem enzimas com menores efeitos colaterais para humanos e são, em geral, organismos GRAS, sem restrições de aplicação na indústria de alimentos. O presente trabalho avaliou metodologias de seleção de novas leveduras produtoras de L-asparaginase, selecionando aquelas capazes de produzir destacadas quantidades desta enzima a partir de um banco contendo 40 cepas e verificando aspectos da sua produção. Foram empregadas metodologias de seleção de leveduras em meio sólido e em meio líquido, avaliando-se a aplicabilidade da quantificação da atividade enzimática pelo método de Nessler e pelo método da hidroxilamina. A produção de L-asparaginase foi posteriormente confirmada por cromatografia em camada delgada. As leveduras selecionadas foram avaliadas quanto à influência dos aminoácidos L-asparagina, L-prolina e L-glutamina como indutores na produção de L-asparaginase e quanto à cinética de produção enzimática. De acordo com os resultados, nenhuma das leveduras foi capaz de produzir L-asparaginase extracelular. Entretanto, duas novas leveduras, até então não citadas na literatura pertinente como produtoras de Lasparaginase, foram capazes de produzir L-asparaginase periplasmática: Issatchenkia orientalis e Rhodotorula glutinis. Verificou-se, também, que a metodologia de screening em meio sólido não foi correlacionável com a produção de L-asparaginase em meio líquido por leveduras. Foi necessária a adição de moléculas indutoras ao meio de cultivo, como os aminoácidos L-asparagina, L-prolina e L-glutamina, para que houvesse produção de Lasparaginase pelas leveduras I. orientalis e R. glutinis. Verificou-se a maior produção de L-asparaginase periplasmática em meio suplementado com L-asparagina e nitrato de amônio para a levedura I. orientalis (20,38 ± 3,55 U.g-1) e em meio suplementado com Lprolina para a levedura R. glutinis (57,05 ± 0,57 U.g-1). Durante os ensaios de cinética, verificou-se que a produção da enzima ocorreu principalmente durante a fase logarítmica do crescimento microbiano, observando-se também estabilidade da atividade enzimática durante as 144 horas do cultivo. Os resultados obtidos no presente trabalho permitiram verificar a viabilidade das metodologias de seleção de novas leveduras produtoras de Lasparaginase bem como selecionar, com sucesso, duas novas leveduras capazes de produzir a enzima L-asparaginase periplasmática, I. orientalis e R. glutinis, determinando aspectos importantes da sua produção em meio líquido. / L-asparaginase is the enzyme responsible for converting the amino acid L-asparagine into L-aspartic acid and ammonium. This enzyme has important applications, mainly in the pharmaceutical industry, where it is used as an antileukemic drug, and in the food industry, as a treatment for mitigating the formation of acrylamide, a highly toxic compound produced in some foods exposed to high temperatures. Yeasts are highlighted as important microorganisms for the production of L-asparaginase since they are capable of producing enzymes with fewer side effects for humans and are, in general, GRAS organisms, being applicable in the food industry without restrictions. This study evaluated screening methods for selecting new yeasts capable of producing L-asparaginase, selecting those capable of producing high amounts of this enzyme from a culture collection containing 40 strains, also verifying aspects of enzyme production. Methods for screening L-asparaginase producing organisms in solid and liquid medium were tested, evaluating the applicability of Nessler and hydroxylamine methods as means for enzyme activity quantification. The production of L-asparaginase was later confirmed through thin layer chromatography. The selected yeasts were evaluated to confirm the influence of the amino acids L-asparagine, L-proline and L-glutamine as inducers in the production of L-asparaginase, and the kinetics of Lasparaginase production were also evaluated. According to the results, none of the assessed yeasts were able to produce extracellular L-asparaginase. However, two novel yeasts, so far not cited in the pertinent literature as L-asparaginase producers, were able to produce periplasmic L-asparaginase: Issatchenkia orientalis and Rhodotorula glutinis. Tests also verified that the screening methods in solid medium did not correlate with the production of L-asparaginase in liquid medium by yeasts. It was necessary to add inducing molecules, such as the amino acids L-asparagine, L-proline and L-glutamine, to stimulate L-asparaginase production by the yeasts I. orientalis and R. glutinis. The highest production of periplasmic L-asparaginase was obtained in liquid medium supplemented with Lasparagine and ammonium nitrate for the yeast I. orientalis (20,38 ± 3,55 U.g-1) and in medium supplemented with L-proline for the yeast R. glutinis (57,05 ± 0,57 U.g-1). The production kinetics assay verified that the production of the enzyme took place mainly during the log phase of microbial growth, being stable after144 hours of cultivation. The results presented in this study were able to confirm the viability of the methods for the screening of novel L-asparaginase producing yeasts as well as to select two novel yeasts able to produce this enzyme, I. orientalis and R. glutinis, determining some important aspects in L-asparaginase production in liquid medium.

Dans les leucémies aiguës myéloïdes (LAM), l’activation anormale de nombreuses voies de signalisation intracellulaires favorise la croissance et la survie des cellules tumorales. L’amélioration des connaissances biologiques de ces pathologies hétérogènes, dont le pronostic est réservé, devrait permettre le développement de thérapies ciblées. La kinase oncogénique mTOR est présente au sein de deux complexes, parmi lesquels mTORC1, activé constitutivement dans la majorité des blastes primaires de patients porteurs de LAM, qui contrôle la synthèse protéique, et mTORC2 activé constitutivement dans 50% des LAM. Les inhibiteurs allostériques de mTORC1 (la rapamycine et ses dérivés) n’inhibent pas la phosphorylation du répresseur traductionnel 4E-BP1, ne diminuent pas la traduction et induisent peu d’apoptose in vitro dans les LAM. Utilisés en monothérapie, leur effet est décevant. De plus ces inhibiteurs n’agissent pas sur le complexe mTORC2. J’ai étudié l’effet d’un inhibiteur catalytique de mTOR, l’AZD8055, actif sur les deux complexes. In vitro, l’AZD8055 inhibe efficacement la signalisation en aval de mTORC1 et de mTORC2, dont les sites de phosphorylation de 4E-BP1 résistants à la rapamycine, ainsi que la synthèse protéique. Il diminue la prolifération, bloque le cycle cellulaire en phase G0G1 et induit une apoptose caspase-dépendante dans les blastes primaires de LAM. Il diminue également la clonogénicité des progéniteurs leucémiques, sans affecter celle des cellules CD34+ normales. Dans un modèle murin de xéno-transplantation, l’AZD8055 inhibe la croissance tumorale et améliore la survie des souris traitées. Je me suis également intéressée à la régulation de l’activité de mTORC1 par les acides aminés. Dans les cellules de mammifères, l’activation de mTORC1 nécessite la présence de glutamine et de leucine qui agissent en coopération via deux transporteurs membranaires, SLC1A5 et SLC7A5/SLC3A2. J’ai montré que la privation en glutamine, obtenue par l’activité glutaminase de la drogue L-asparaginase ou par l’utilisation de milieux de culture spécifiques dépourvus sélectivement en acides aminés, inhibe l’activation de mTORC1 et induit de l’apoptose dans diverses lignées leucémiques et dans les blastes primaires de LAM. La L-asparaginase inhibe la synthèse protéique et ses effets fonctionnels sont liés à son activité glutaminase. J’ai pu également constater une augmentation de l’expression protéique de la glutamine synthase induite par la Lasparaginase, dont l’inhibition majore l’apoptose induite par la L-asparaginase dans certaines lignées leucémiques. J’ai également étudié l’effet de l’inhibition spécifique par un shARN inductible du transporteur SLC1A5, qui permet l’import de glutamine. L’inhibition de SLC1A5 bloque la réactivation de mTORC1 par l’association leucine/glutamine après privation et induit de l’apoptose dans la lignée leucémique MOLM14. Cette inhibition diminue la croissance tumorale dans un modèle de xénogreffe / Acute myeloid leukaemias (AML) are heterogeneous diseases associated with poor prognosis. In AML, aberrant activation of many signaling pathways enhances proliferation and survival of leukemic blast cells. Understanding the mechanisms underlying survival of tumoral cells should allow the development of targeted therapies. The oncogenic kinase mTOR belongs to two distinct multimeric complexes. MTORC1 that controls protein translation, is constitutively activated in most of primary blast cells at AML diagnosis, while mTORC2 is constitutively activated in about half of AML samples. In AML, some phosphorylation events of the translational repressor 4E-BP1, are resistant to allosteric inhibitors of mTORC1 including rapamycin and its analogs. These first generation inhibitors of mTORC1 have only few effects on AML and do not induce significant apoptosis in vitro. I have tested a second generation mTOR kinase inhibitor active on both mTORC1 and mTORC2 complexes. In vitro, AZD8055 blocked mTORC1 and mTORC2 signaling, including 4E-BP1 rapamycin resistant phosphorylation events and protein synthesis. This compound decreased AML blast cells proliferation and cell cycle progression, reduced the clonogenic growth of leukemic progenitors and induced caspase-dependant apoptosis in leukemic cells but not in normal immature CD34+ cells. Finally, AZD8055 reduced tumor growth and improved survival in xenografted mouse model. In the second part of this work, I have studied the regulation of mTORC1 by amino acids in AML. In mammalian cells, activation of mTORC1 requires the presence of glutamine and leucine acting together via two membrane transporters, SLC1A5 and SLC7A5/SLC3A2. I showed that glutamine deprivation, obtained by L-asparaginase glutaminase activity or specific alpha-MEM use, inhibited mTORC1 and induced apoptosis in AML cell lines and primary AML blasts. L-asparaginase also inhibited protein synthesis and I have observed a correlation between the functional effects of L-asparaginase and its glutaminase activity. L-asparaginase induced an up-regulation of glutamine synthase (GS) protein and shRNA-induced GS inhibition increased L-asparaginase-dependant apoptosis in the MV4-11 AML cell line. I have also studied the effects of SLC1A5 inhibition with an inducible shRNA expressed in MOLM14 cells. Inhibition of this high afffinity transporter for glutamine blocked mTORC1 stimulation by leucine and glutamine after deprivation and induced apoptosis in MOLM-14 cell line. SLC1A5 inhibition reduced tumor growth and improved survival in transplanted mice

This study is concerned with the regulation of Lasparaginase (LA) in the cell-free crude extracts from Lactobacillus plantarum (ATCC8014). A previously reported finding that adenosine triphosphate (ATP) inhibits the action of LA in crude extracts was confirmed. The study was extended to include the mono-, di-, and triphosphates of adenosine, guanosine, cytidine, and uridine. These compounds were also shown to inhibit LA activity. These andother studies revealed that LA appears to be an allosteric type enzyme exhibiting positive homotropism with respect to substrate and heterotropism with respect to the nucleotides tested. The regulation of LA activity by high energy compounds, when coupled with asparagine synthetaseL suggests a relationship between amide synthesis-amide degradation and the energy levels of the cell.

Made available in DSpace on 2016-04-04T12:26:00Z (GMT). No. of bitstreams: 2 14.pdf: 930696 bytes, checksum: 4334fa07716ed0ea4227a0d296d9310c (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Fármacos/Farmanguinhos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / A asparaginase de origem bacteriana é o principal medicamento para o tratamento da leucemia linfoblástica aguda, um câncer que afeta principalmente as crianças. Apesar de efetivo, o medicamento causa sérias reações imunológicas por ser produzido por um procarioto. Atualmente, o medicamento existente no mercado brasileiro é importado, o que acarreta dependência tecnológica, alto custo na obtenção do medicamento e dificuldade de abastecimento. As asparaginase II de Saccharomyces cerevisiae codificada pelo gene ASP3 apresenta, por suas características, potencial para uso como medicamento antileucêmico. Em trabalhos anteriores, este gene foi clonado e expresso em altos níveis na levedura Pichia pastoris. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar as propriedades físico-químicas e bioquímicas da asparaginase periplásmica recombinante produzida por P. pastoris, tendo sido avaliados as melhores condições de estocagem da enzima após ressuspensão, o efeito de alguns íons e de alguns compostos na atividade asparaginásica, a afinidade da asparaginase pelos substratos D e L-asparagina e L-glutamina e os seus parâmetros cinéticos. Observou-se que a ressuspensão da asparaginase de levedura em água destilada e mantida a 4 °C reteve em torno de 98% da atividade original após 96 horas, na presença de sorbitol 0,1 M, mostrando ser esta a melhor condição de estocagem. Os valores do Km e da Vmáx foram determinados, obtendo-se 2,461 ± 0,170mM e 0,090 ± 0,0017mM min-1, respectivamente. A asparaginase de P.pastoris recombinante apresentou maior afinidade pela D-asparagina, de forma semelhante à asparaginase nativa de S. cerevisiae; e baixa atividade glutaminásica, o que favorece a sua utilização como medicamento pelo menor risco de efeitos tóxicos. O EDTA não apresentou efeito negativo sobre a asparaginase de levedura, indicando não ser a mesma uma metaloenzima. A influência negativa de agentes redutores sobre a atividade enzimática indica a presença de pontes de enxofre na estrutura proteica. Os resultados obtidos são de extrema importância para a continuidade dos estudos da utilização da asparaginase de Pichia pastoris recombinante como agente antileucêmico. / Bacterial asparaginase is the main medicament for the treatment of acute lymphoblastic leukemia, a cancer that primarily affects children. Although effective, the medicine causes serious immunological reactions due to its prokaryotic origin. Currently, the existing drug in the Brazilian market is imported, which carries a technological dependence, high cost and supply difficulties. The asparaginase II of Saccharomyces cerevisiae encoded by the ASP3 gene, given its characteristics, has potential to be used as an antileukemic drug. In previous work, this gene was cloned and expressed at high levels in the yeast Pichia pastoris. The present work aimed to characterize the physicochemical and biochemical properties of the recombinant periplasmic asparaginase produced by P. pastoris, having been assessed the best enzyme storage conditions after resuspension, the effect of some ions and some compounds in asparaginasic activity, asparaginase affinity for yhe substrates D- and L-asparagine and Lglutamine and its kinetic parameters. It was observed that the yeast asparaginase resuspension in distilled water and kept at 4 °C retained about 98% of the original activity after 96 hours in the presence of 0.1 M sorbitol, showing this to be the best storage condition. The values of Km and Vmax were determined to be 2,461 ± 0,170mM e 0,090 ± 0,0017mM min-1, respectively. The recombinant asparaginase showed higher affinity for D-asparagine, similarly to the native S. cerevisiae asparaginase; and low glutaminasic activity, which favors its use as a medicine due to the lower risk of toxic effects. EDTA showed no negative effect on the yeast asparaginase, indicating that it is not a metalloenzyme. The negative influence of reducing agents on the enzymatic activity indicates the presence of sulfur bridges in the protein structure. These results are extremely important for the further studies on the use of the recombinant Pichia pastoris asparaginase as antileukemic agent.