Associações simbióticas, comensais e parasitárias são amplamente relatadas em insetos. Pelo fato de larvas de culicídeos e amebas de vida livre (AVL) habitarem meios aquáticos similares, objetivou-se verificar a prevalência de Acanthamoeba spp. em populações silvestres de Aedes aegypti. Esta AVL foi investigada em 60 pools contendo 10 larvas de A. aegypti, as quais foram coletadas através de ovitrampas instaladas em diversos bairros da cidade de Porto Alegre (RS, Brasil). Os isolados de Acanthamoeba spp. foram caracterizados morfologicamente e submetidos à técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para confirmação do gênero. Ademais, realizouse análise genotípica e testes presuntivos de patogenicidade para algumas cepas. Entre os pools, 54 (90%) foram positivos para AVL, dos quais 47 (87%) isolados eram pertencentes ao gênero Acanthamoeba. Os grupos genotípicos T4, T3 e T5 foram identificados, correspondendo a 14 (53,8%), 10 (38,5%) e dois (7,7%) isolados, respectivamente. De acordo com testes fisiológicos empregados para 14 cepas, 12 (85,7%) foram consideradas não patogênicas e duas (14,3%) foram consideradas com baixo potencial patogênico. Estes resultados servem como base para um maior conhecimento acerca da interação entre estes protozoários e mosquitos vetores, em seu habitat natural. Além disso, é o primeiro estudo dedicado ao isolamento de Acanthamoeba spp. a partir de culicídeos coletados do ambiente. / Symbiotic, commensal and parasitic associations are widely reported in insects. By the fact of mosquito larvae and free-living amoebae (FLA) occupy the similar aquatic sites, the aim of this study was to determine the prevalence of Acanthamoeba spp. in Aedes aegypti larvae collected in the environment. The amoebae were investigated in 60 pools, each containing 10 larvae of A. aegypti which were collected by using larvitraps installed in various districts of Porto Alegre (RS, Brazil). Acanthamoeba isolates were morphologically characterized and submitted to Polymerase Chain Reaction technique to confirm the genus. In addition, genotype analyses as well as presumptive tests for pathogenicity in some samples were performed. Among the pools, 54 (90%) were positive for FLA. From those isolates, 47 (87%) belong to the genus Acanthamoeba. The genotype groups T4, T3 and T5 have been identified corresponding to 14 (53.8%), 10 (38.5%) and two (7.7%) isolates respectively. The physiological tests performed in 14 strains showed that 12 (85.7%) were non pathogenic, while two (14.3%) were considered with low pathogenic potential. These results provide a basis for a better understanding between these protozoan and mosquitoes interaction in their natural habitat. Moreover, this study is the first to report isolation of Acanthamoeba spp. from mosquitoes collected in the environment.

Made available in DSpace on 2018-09-11T12:24:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_12484_Dissertação_Débora_Melo - Versão Final após defesa.pdf: 2099478 bytes, checksum: 056f8b219d502e85cccda92102cc8427 (MD5) Previous issue date: 2018-03-23 / O gênero Acanthamoeba compreende protozoários que estão amplamente distribuídos nos mais diversos ambientes e por todos os continentes e que são capazes de causar infecções em seres humanos, como a ceratite e a encefalite granulomatosa. A patogênese da Acanthamoeba constitui-se de um processo multifatorial, com fatores que envolvem tanto a ameba quanto o hospedeiro, porém, esse mecanismo de patogenicidade ainda não está totalmente elucidado. O Objetivo desse trabalho foi identificar a virulência de seis isolados de origens clínica e ambiental de Acanthamoeba, com três genótipos diferentes, T3, T4 e T5 representando os 20 tipos atualmente descobertos, e com duas doses de amebas sobre três tipos diferentes de linhagens celulares de mamíferos, MDCK, VERO e CHO, para testes de efeito citotóxico e de efeito citopático. Amostras clínicas provenientes de cultura de raspados de córnea de pacientes com diagnóstico de ceratite amebiana e as amostras ambientais procedentes de saída de torneira, de água de inundação e de poeira, foram coletadas e axenizadas entre os anos de 2014 a 2017. Considerando que o cultivo prolongado de isolados de Acanthamoeba pode provocar a diminuição ou possível perda da virulência, foi realizada a passagem das amebas em linhagem celular do tipo MDCK para reativar a virulência dos isolados em cultivo prolongado. O efeito citotóxico demonstrou que existe diferença de resultados a depender da linhagem celular utilizada, mas não dos isolados. A passagem em linhagem celular MDCK foi capaz de provocar o aumento da virulência dos isolados Mnus4 (T3-ambiental), Krt15.DFNL (T3-clínico), Krt12.ROS (T4-clínico) e Krt16.PEN (T5-clínico) nos testes de citotoxicidade. Nossos resultados demonstraram que a linhagem celular mais susceptível ao meio condicionado (efeito citotóxico) foi a MDCK, seguida de VERO e CHO. Entretanto, para o ensaio de citopatogenicidade, CHO foi a mais susceptível a exposição aos trofozoítos de Acanthamoeba, seguida de VERO e MDCK. No efeito citopático, os resultados variaram de acordo com o isolado utilizado, com a dose utilizada de trofozoítos e com a passagem em linhagem celular. O aumento do número de trofozoítos de ameba em incubação com as linhagens celulares foi capaz de provocar um aumento na virulência dos isolados dos três genótipos no teste de efeito citopático, sobre, principalmente, as linhagens VERO e CHO. No teste de efeito citopático, o genótipo mais virulento foi o T5, seguido de T4 e T3, sendo o isolado mais virulento o A3P4 (T5) de origem ambiental. Dessa forma, conclui-se que os resultados obtidos com os testes de efeito citopático e citotóxico com as diferentes linhagens de células de mamífero têm variações relacionadas ao tipo de linhagem celular de mamífero utilizada, bem como com as características inerentes de cada isolado. Assim, os resultados aqui obtidos poderão ser auxiliares para o planejamento de futuras pesquisas relacionadas aos estudos da patogenicidade da Acanthamoeba.

Made available in DSpace on 2018-08-01T21:35:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_11464_Dissertação Final Guilherme.pdf: 10896079 bytes, checksum: edbcec6d32e63a6cb320b5fc5d9ca7ae (MD5) Previous issue date: 2017-07-21 / As Amebas de Vida Livre (AVL) do gênero Acanthamoeba são protozoários encontrados em todos os ambientes do mundo, e podem causar doenças como Ceratite e Encefalite Granulomatosa. Os avanços no conhecimento dessas amebas e de seu processo invasivo, da sua variabilidade fenotípica e genotípica, bem como o desenvolvimento de metodologias diagnósticas e terapêuticas, só têm sido possíveis devido a ferramenta de cultivo desses microrganismos. No entanto, seu cultivo prolongado e sua passagem em hospedeiros (ou células) podem alterar a maquinaria celular e modificar mecanismos relacionados a patogenicidade, tornando-os amebas mais ou menos virulentas. No presente trabalho, procurouse investigar características in vitro associadas à patogenicidade de Acanthamoeba castetellanii (Genótipo T4), utilizando quatro amostras de um mesmo isolado clínico, originado de raspado de córnea, a fim de investigar sua virulência. Células epiteliais da linhagem MDCK foram utilizadas para verificar o efeito citopático. Também foi avaliado o meio onde as amebas foram cultivadas (meio condicionado) visando verificar a atividade de proteases em gel e o efeito citotóxico gerado em culturas de MDCK. Foram verificadas as porcentagens de encistamento e a resposta da cultura de amebas a partir da exposição à clorexidina. Os dados obtidos nesse trabalho confirmaram o potencial patogênico das amostras, especialmente aquelas que sofreram passagem em MDCK. O meio condicionado não produziu efeito citotóxico significativo sobre a monocamada de células. O perfil zimográfico evidenciou um padrão muito parecido em todas as amostras testadas, diferenciando apenas a amostra de longo período de axenização, havendo o aumento de uma banda de aproximadamente 133 kDa. Foi verificado que a porcentagem de encistamento das amostras recém axenizadas foi maior que as de longo período de axenização, sendo que esta última amostra obteve taxas maiores de encistamento após interação com MDCK. O teste com a clorexidina demonstrou que, apesar da amostra ser oriunda de uma mesma fonte, as condições de manutenção das amostras levaram a comportamentos distintos. Neste trabalho foi observado que após nove anos de cultivo axênico, a ameba perde virulência, contudo a recupera após passagem em células, como a MDCK. Colaborando para que os estudos em Acanthamoeba avancem demonstrando a potencialidade plástica da ameba em gerir seu perfil patogênico.

Made available in DSpace on 2018-09-11T12:24:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_12484_Dissertação_Débora_Melo - Versão Final após defesa.pdf: 2099478 bytes, checksum: 056f8b219d502e85cccda92102cc8427 (MD5) Previous issue date: 2018-03-23 / O gênero Acanthamoeba compreende protozoários que estão amplamente distribuídos nos mais diversos ambientes e por todos os continentes e que são capazes de causar infecções em seres humanos, como a ceratite e a encefalite granulomatosa. A patogênese da Acanthamoeba constitui-se de um processo multifatorial, com fatores que envolvem tanto a ameba quanto o hospedeiro, porém, esse mecanismo de patogenicidade ainda não está totalmente elucidado. O Objetivo desse trabalho foi identificar a virulência de seis isolados de origens clínica e ambiental de Acanthamoeba, com três genótipos diferentes, T3, T4 e T5 representando os 20 tipos atualmente descobertos, e com duas doses de amebas sobre três tipos diferentes de linhagens celulares de mamíferos, MDCK, VERO e CHO, para testes de efeito citotóxico e de efeito citopático. Amostras clínicas provenientes de cultura de raspados de córnea de pacientes com diagnóstico de ceratite amebiana e as amostras ambientais procedentes de saída de torneira, de água de inundação e de poeira, foram coletadas e axenizadas entre os anos de 2014 a 2017. Considerando que o cultivo prolongado de isolados de Acanthamoeba pode provocar a diminuição ou possível perda da virulência, foi realizada a passagem das amebas em linhagem celular do tipo MDCK para reativar a virulência dos isolados em cultivo prolongado. O efeito citotóxico demonstrou que existe diferença de resultados a depender da linhagem celular utilizada, mas não dos isolados. A passagem em linhagem celular MDCK foi capaz de provocar o aumento da virulência dos isolados Mnus4 (T3-ambiental), Krt15.DFNL (T3-clínico), Krt12.ROS (T4-clínico) e Krt16.PEN (T5-clínico) nos testes de citotoxicidade. Nossos resultados demonstraram que a linhagem celular mais susceptível ao meio condicionado (efeito citotóxico) foi a MDCK, seguida de VERO e CHO. Entretanto, para o ensaio de citopatogenicidade, CHO foi a mais susceptível a exposição aos trofozoítos de Acanthamoeba, seguida de VERO e MDCK. No efeito citopático, os resultados variaram de acordo com o isolado utilizado, com a dose utilizada de trofozoítos e com a passagem em linhagem celular. O aumento do número de trofozoítos de ameba em incubação com as linhagens celulares foi capaz de provocar um aumento na virulência dos isolados dos três genótipos no teste de efeito citopático, sobre, principalmente, as linhagens VERO e CHO. No teste de efeito citopático, o genótipo mais virulento foi o T5, seguido de T4 e T3, sendo o isolado mais virulento o A3P4 (T5) de origem ambiental. Dessa forma, conclui-se que os resultados obtidos com os testes de efeito citopático e citotóxico com as diferentes linhagens de células de mamífero têm variações relacionadas ao tipo de linhagem celular de mamífero utilizada, bem como com as características inerentes de cada isolado. Assim, os resultados aqui obtidos poderão ser auxiliares para o planejamento de futuras pesquisas relacionadas aos estudos da patogenicidade da Acanthamoeba.

Campylobacter jejuni is an avian commensal bacterium and causes gastrointestinal diarrhea in humans called campylobacteriosis. Campylobacteriosis is acquired by consumption of undercooked poultry contamined with C. jejuni. Poultry can become colonized from contaminated drinking water. The chicken flock and drinking water of 4 poultry farms in Ontario were sampled and the prevalence of C. jejuni in these flocks was determined to be 16.7% over a 1 year sampling period. We determined that contamined- water was a significant risk factor for Campylobacter-positive flocks from flaA typing, PFGE analysis, and genomotyping several isolated strains. Free living amoebae, such as Acanthamoeba species, live in the drinking water of poultry farms. It is hypothesized that Acanthamoeba in the drinking water of poultry farms can take up and act as environmental reservoirs of C. jejuni. Acanthamoeba species were isolated from the drinking water. Acanthamoeba strains were found to act as a vehicle for protection, persistence and growth of C. jejuni isolated from the farm water. The transcriptome of both C. jejuni and A. castellanii during the initial stages of C. jejuni internalization were described by RNA-seq. C. jejuni oxidative defence genes (such as katA, sodB, fdxA) and some other unknown genes (Cj0170, Cj1325, Cj1725) were found to be essential in the interaction with A. castellanii. Our findings suggest that Acanthamoebae act as a C. jejuni reservoir and could be a contributing source of C. jejuni in the environment. Through transcriptomics studies, we have begun to uncover some genetic clues involved in this interaction.

Burkholderia pseudomallei, the etiological agent of melioidosis, is a saprophytic bacterium existing endemically in the water and soil of SE Asia and Northern Australia. This organism has shown the ability to remain dormant in its host for decades. B. thailandensis is a closely related non-pathogenic near neighbor that is also found in these soils. It has been suggested that free-living amoeba could be natural reservoirs for these organisms. The interactions of Burkholderia species and Acanthamoeba castellanii, a species of free-living amoeba, were studied to better understand the natural ecology of these organisms and to determine the effects amoeba interactions might have on pathogenesis. In this study, the adherence and persistence of several B. pseudomallei clinical isolates were compared to that of B. thailandensis within both amoeba and a human monocyte cell line. Results showed that B. pseudomallei isolates can enter amoeba and survive therein at varying levels of efficiency. Some isolates were able to persist inside the amoeba for up to three weeks. Optimal entry time into an amoeba trophozoite was found to be about three hours for all ten B. pseudomallei isolates. Interestingly, it was found that after internalization by amoeba, B. pseudomallei have a significantly increased ability to both attach to, and grow within human monocytes, suggesting that such interactions increase the virulence capabilities of soil isolates.

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L’objectif de cette thèse était d’isoler de nouveaux Mimiviridae dans l’environnement marin à l’aide d’amibes, hôtes potentiels de ces derniers et surtout organismes ubiquistes phagocytaires et connus pour être parasités par des microorganismes pathogènes. Après la mise en place et la validation de protocoles d’échantillonnages et de mise en culture de prélèvements environnementaux, plusieurs échantillons ont été analysés. Un nouveau membre de la famille des Mimiviridae a été isolé à partir d’un échantillon marin côtier provenant du Chili, stocké dans un milieu enrichi en amidon (milieu riz, propice à la conservation voire à la production de virus) puis mis en coculture dans une souche d’amibe Acanthamoeba griffini. Le séquençage de son génome révèle 1260 kb, codant pour 1120 protéines putatives, ce qui en fait le plus grand génome viral connu. Nommé megavirus chiliensis, sa capside est icosaédrique et possède également des fibrilles comme Acanthamoeba polyphaga mimivirus tout en étant plus grande (diamètre apparent 520 nm vs 450 nm). Bien que les morphologies des deux virus soient similaires et que de nombreuses particularités de mimivirus soient conservées chez megavirus (stargate), 23 % des protéines de megavirus n’ont pas d’homologues chez mimivirus, et les 594 gènes orthologues partagés présentent une identité résiduelle moyenne de 50 %. De plus, megavirus présente 3 amino-acyl-ARNt-synthètases supplémentaires (IleRS, TrpRS et AsnRS) à celles de mimivirus. Ces résultats suggèrent que ces deux virus sont issus d’un génome cellulaire ancestral qui a évolué par réduction génomique. Un parasite intracellulaire obligatoire a également été isolé à partir d’échantillons de sédiments marins de la côte chilienne. Des observations au microscope électronique à transmission indiquent une forme ressemblant à une endospore, de taille très variable (de 400 nm jusqu’à 1 μm), avec une paroi multicouche épaisse (~60 nm) et un pore apical. Cependant, aucune évidence de division n’a encore été observée, laissant penser que cette entité capable de multiplication pourrait être un virus, sans ressembler aux morphologies connues à ce jour. / In order to isolate new Mimiviridae from the marine environment, we used amoeba -ubiquitous phagotrophic protozoa - as potential host for these viruses. Different sampling protocols were tested and validated before carrying out co-cultures with amoeba and environmentals samples. A new Mimiviridae giant virus was isolated from Chilean coastal seawater completed with rice media (enriched incubation). Produced in Acanthamoeba griffini, its genome sequence has 1,260 Mbp and encodes for 1120 putative proteins, making it the largest known viral genome and thus named Megavirus chiliensis. Its icosaedral capsid is covered with fibrils and its size is bigger than that of Acanthamoeba polyphaga mimivirus (520 nm vs 450 nm). Although both virions are very similar and most of the mimivirus idiosyncrasies are conserved in megavirus (stargate), 23 % of megavirus putative proteins have no mimivirus homologs. Both viruses share 594 orthologous proteins exhibiting an average identity of 50 %. Moreover, megavirus contains 3 additional amino-acyl tRNA synthetases (IleRS, TrpRS and AsnRS) compare to mimivirus. These results suggest that these viruses have evolved from an ancestral cellular genome by reductive evolution. In addition, an amoeba obligatory intracellular parasite was isolated from marine sediments from Chilean coast. Transmission electron microscopic images show a particule like endospore with variable size (from 400 nm to 1 µm), a multilayered outer wall (~60 nm) and an apical pore. No evidence of division was observed, suggesting that the multiplication of this endoparasite occurs without division, suggesting that it could be a virus without any similarity to those described today.

Amebas de vida livre (AVL) são distribuídas mundialmente no solo e na água. Um número pequeno delas é considerado importante para a saúde dos seres humanos: Acanthamoeba spp., Naegleria fowleri, Balamuthia mandrillaris e Sappinia diploidea. Algumas das infecções são oportunistas, ocorrendo em indivíduos imunocomprometidos, enquanto outras são não oportunistas. Amostras de água foram coletadas de banheira de hidromassagens e piscinas térmicas na cidade de Porto Alegre, RS, Brasil, com o objetivo de determinar a presença de Acanthamoeba, bem como realizar a caracterização fenotípica e genotípica dos isolados. Amebas foram isoladas em cultivo monoxênico com Escherichia coli. A identificação dos isolados foi baseada na morfologia dos cistos e na amplificação por PCR com oligonucleotídeos gênero-específico. De 72 amostras analisadas, 20 (27,77%) foram positivas para amebas de vida livre, e identificadas morfologicamente como pertencentes ao gênero Acanthamoeba. Destas, 11 possuíam características compatíveis com o grupo morfológico II e 9 com o grupo III. Entre os isolados, 11(55%) foram considerados potencialmente patogênicos a partir de testes de osmotolerância e termotolerância. Somente 9 isolados quando submetidos à Reação da PCR, confirmaram pertencer ao gênero Acanthamoeba. A análise do sequenciamento através da comparação das sequências dispostas no GenBank, demonstrou a distribuição nos grupos genotípicos T3 (11,1%), T5 (11,1%), T4 (33,3%) e T15 (44,4%).Os resultados obtidos com este confirmam a presença de isolados potencialmente patogênicos que podem representar um risco à saúde humana nos ambientes de banheiras de hidromassagem e piscinas térmicas. / Free-living amoebae (FLA) are widely distributed in soil and water. A few number of them are implicated in human disease: Acanthamoeba spp., Naegleria fowleri, Balamuthia mandrillaris and Sappinia diploidea. Some of the infections were opportunistic, occurring mainly in immunocompromised hosts, while others are non opportunistic. Water samples were collecyed from both hot tubs and thermal swimming pools in the city of Porto Alegre, RS, Brazil, to determine the presence of Acanthamoeba in the water as well as perform the phenotypic and genotypic characterization of the isolates. Amoebae were isolated in monoxenic culture with Eschererichia coli. The identification of the isolates was based on the cysts morphology and PCR amplification using genus-specific oligonucleotides. From 72 samples analyzed, 20 (27,77%) were positive for free-living amoebae, and the isolates were morphologically identified as belonging to the genus Acanthamoeba. Out of these, 11 presented morphological characteristics compatible with group II, and 9 with group III. Among the isolates, 11 (55%) were considered potentially pathogenic according to osmotolerance and temperature assays. The isolates when submitted to PCR reaction only 9 were confirmed as belonging to the genus Acanthamoeba. The sequences analysis when compare to the sequences in the GenBank, showed that genotype distribution in group T3 (11,1%), T5 (11,1%), T4 (33,3%) and T15 (44,4%). The results of this study confirmed the presence of potentially pathogenic isolates of free living amoebae in hot swimming pool and spas which can present risks to human health.

A incidência de ceratite infecciosa relacionada a lentes de contato ocasionada por espécies de Acanthamoeba e Fusarium tem aumentado nos últimos anos. Esses organimos compartilham vários ambientes e casos de coinfecção foram relatados. Interações entre amebas e outros micro-organismos podem resultar em mudanças significativas para ambos, como o aumento da virulência em hospedeiros mamíferos. Neste estudo, foi avaliada a interação das cepas Neff, T4 e T4 pulmão de Acanthamoeba castellanii com Fusarium solani, bem como as possíveis implicações no desenvolvimento de ceratite. A. castellanii foi capaz de fagocitar F. solani e os conídios foram capazes de germinar dentro da ameba. A cocultura com ameba viva, bem como o sobrenadante da cultura e o lisado amebiano aumentaram significativamente o crescimento do fungo. Além disso, F. solani vivo e o seu sobrenadante de cultura aumentaram a sobrevivência da ameba, mas de forma diferente em cada cepa amebiana. A presença do fungo resultou em aumento de encistamento das cepas amebianas T4 pulmão e T4, bem como aumentou a resistência da cepa Neff à clorexidina. Curiosamente, a passagem pela ameba aumentou o efeito citopático de F. solani em células de mamíferos. Esses resultados mostram que A. castellanii e F. solani têm uma relação de protocooperação, com benefícios para ambos, e especialmente, indicam um possível efeito sobre as características de virulência de ambos os organismos. Assim a interação entre A. castellanii e F. solani pode resultar em impactos graves nos casos de ceratite. / The incidence of Acanthamoeba and Fusarium species has increased in contact lens-related infectious keratitis. They share several environments and cases of co-infection have been reported. The interaction between the amoeba and other microorganisms may result in significant changes for both, like increased virulence in mammalian hosts. In this study, we evaluated the interaction of Neff, T4 and T4 lung strains of Acanthamoeba castellanii with Fusarium solani and the implications in keratitis. A. castellanii phagocyted the fungi, and conidia were able to germinate inside the amoeba. The co-culture with live amoeba as well as the amebic culture supernatant and lysate significantly increased fungal growth. Moreover, live F. solani and the its culture supernatant enhanced the survival of amoeba, but differently in each A. castellanii strain. The presence of fungi resulted in increased amoebal encystment of T4 and T4 lung strains, end increased the resistence of Neff strain to chlorhexidine. The encystment of T4 and T4 lung strains was increased by the fungi. Interestingly, the passage by Neff amoeba increased the cytophatic effect of F. solani on mammalian cells linage. These results show that A. castellanii and F. solani have a protocooperation relationship, with benefits for both, and especially indicate a possible effect on virulence characteristics of both organisms. These data suggest that the A. castellanii-F. solani interaction may cause severe impacts in keratitis.