Le parasite Echinococcus multilocularis cause l’échinococcose alvéolaire (EA), infection fatale si non prise en charge. Le traitement médical, pour les patients inopérables, est uniquement parasitostatique, et présente des effets secondaires. Néanmoins, chez certains patients, la viabilité du parasite régresserait suffisamment pour envisager un arrêt de ce traitement. Actuellement, les biomarqueurs pour estimer la viabilité parasitaire ne sont qu’indirects, évaluant la réponse immunitaire du patient. Trois études ont été menées, visant à évaluer des biomarqueurs, innovants ou déjà disponibles sur le marché.Nous avons étudié la présence d’ADN libre circulant (ADNlc), au moment du diagnostic, mais aussi quelques mois après la mise en place du traitement. Notre étude valide pour la première fois la présence d’ADNlc dans les cas d’EA, sur modèle animal puis sur des échantillons de patients. Même si la méthode n’est pas encore utilisable en diagnostic ou en suivi, c’est un point de départ vers l’utilisation de l’ADNlc pour la prise en charge de l’EA.De plus, nous avons mené une étude exploratoire sur des lésions parasitaires chez la souris et chez un patient ayant reçu un traitement médicamenteux très court. A partir d’un même échantillon, nous avons analysé l’ADN, afin d’estimer la proportion de cellules parasitaires, et nous avons quantifié différents transcrits parasitaires, afin d’estimer la viabilité du parasite de manière directe. Cet axe a permis de choisir la cible la plus transcrite : elle pourrait être utilisée sur une cohorte plus large, puis corrélée avec les biomarqueurs indirects utilisés aujourd’hui.Enfin, nous avons évalué un test de diagnostic rapide de l’échinococcose kystique, présentant de fortes réactions croisées en cas d’EA.Ces travaux ouvrent de nouvelles perspectives, principalement pour améliorer le suivi des patients atteints d’EA. / The parasite Echinococcus multilocularis is the causative agent of alveolar echinococcosis (AE), a fatal infection if not adequately managed. Medical treatment, for inoperable patients, is only parasitostatic, with many side effects. Nevertheless, in some patients, the viability of the parasite could regress sufficiently for treatment to be stopped. Currently, biomarkers for estimating parasite viability are only indirect, evaluating the immune response of the patient. Three studies were conducted to evaluate biomarkers that are innovative or already available on the market.We investigated the presence of circulating cell-free DNA (ccfDNA) at diagnosis, and after a few months of treatment. For the first time, our study identified the presence of ccfDNA in cases of AE, in an animal model and in human samples. Although the method cannot yet be used for diagnosis or follow-up, it is a starting-point for the use of ccfDNA in the management of AE.In addition, we conducted an exploratory study of parasitic lesions in mice, and in a patient who had only received medical treatment for a very short time. We analyzed DNA to estimate the proportion of parasite cells present in each sample. We then quantified different parasite transcripts from each sample, in order to directly estimate parasite viability. This approach allowed us to identify the most abundantly transcribed gene, which could potentially be used to study a larger cohort, in order to correlate results with the indirect biomarkers used today.Finally, we evaluated a rapid diagnostic test for cystic echinococcosis, which produces strong cross-reactions in the case of AE infection.This work opens new perspectives, mainly to improve the follow-up of patients with AE.

Physiologiquement, l’ADN, séquestré dans les noyaux, n’est pas détecté par les récepteurs de danger du système immunitaire. En revanche, au cours d’inflammations chroniques, une rupture de la tolérance vis-à-vis de l’ADN du soi, consécutivement à sa libération dans le milieu extracellulaire par les cellules mortes, a été démontrée. L’accès de l’ADN extracellulaire aux récepteurs intracellulaires est médié par des molécules cargo capables de s’associer à l’ADN extracellulaire et d’induire sont internalisation.L’IL-26, qui est un membre de la famille de l’IL-10, a été décrite comme une cytokine pro-inflammatoire, dont les mécanismes moléculaires restent mal connus. Nous avons démontré que l’IL-26 se lie à l’ADN, permet son internalisation dans le cytosol des cellules myéloïdes et la sécrétion de cytokines pro inflammatoires via la voie STING et la voie des inflammasomes. La modélisation informatique de l’IL-26, basée sur la structure de l’IL-10,met en évidence des caractéristiques structurales similaires aux molécules cargo : un domaine de liaison à l’ADN, deux hélices amphipathiques et un motif d’ancrage à la membrane. De plus, des complexes circulants d’IL-26-ADN sont retrouvés dans les sérums de patients en poussée aigues de vascularite à ANCA,une pathologie inflammatoire chronique. L’IL-26 est détectée dans les lésions de glomérulonéphrite aigue nécrosante à croissants, ainsi qu’au niveau des cellules musculaires lisses artérielles de ces patients. Ces dernières sécrètent de l’IL-26 en présence de cytokinespro-inflammatoires. En conclusion, l’IL-26 établit d’une boucle d’autoamplification entre une mort cellulaire intense et l’inflammation. / In physiological conditions, self-DNA released by dying cells is not detected by intracellular DNA sensors. Inchronic inflammatory disorders, unabated inflammation has been associated with a break in innate immune tolerance to self-DNA. However, to gain access to intracellular DNA sensors, extracellular DNA has to complex with DNA-binding molecules. IL-26 is a member of the IL-10 cytokine family, overexpressed in numerous chronic inflammatory diseases, which biological activity remains unclear. We demonstrate here that IL-26 binds to DNA and shuttles it in the cytosol of human myeloid cells. As a consequence, IL-26 allows extracellular DNA to trigger proinflammatory cytokine secretion by monocytes, in a STING- and inflammasome-dependent manner. Supporting these biological properties, IL-10-based modelling predicts two DNA-binding domains, two amphipathic helices, and an in-plane membrane anchor in IL-26, structural features of cationic amphipathic cell penetrating peptides. In line with these properties, patients with active autoantibody-associated vasculitis, a chronic relapsing autoimmune inflammatory disease associated with extensive cell death, exhibit high levels of both circulating IL-26 and IL-26-DNA complexes. Moreover, in patients with crescentic glomerulonephritis, IL-26 is expressed by renal arterial smooth muscle cells and deposits in necrotizing lesions. Accordingly, human primary smooth cells secrete IL-26 in response to proinflammatory cytokines. In conclusion, IL-26 expressed in lesions confers proinflammatory properties to DNA released by dying cells, setting up a positive amplification loop between extensive cell death and unabated inflammation.

Cette thèse a premièrement permis le développement d'une méthode de détection non-enzymatique de l'ADN. Les techniques enzymatiques couramment utilisées, comme la Polymerase Chain Reaction (PCR), échouent souvent dans l'analyse d'échantillons anciens ou transformés. L'ADN subit en effet de nombreuses dégradations post mortem, parmi lesquelles certaines bloquent les enzymes ADN-polymérases. Notre méthode combine hybridation et détection par SERRS (Surface Enhanced Resonant Raman Scattering), permettant la détection et la quantification de séquences d'ADN dégradées réfractaires à l'analyse par PCR. De nouvelles perspectives s'ouvrent donc en paléogénétique. Cette thèse aborde également le rôle des surfaces minérales dans l'origine des acides nucléiques. Les surfaces minérales pourraient avoir piégé et concentré les briques élémentaires de ces biopolymères, contribuant ainsi à leur construction. Les travaux existants se sont concentrés sur des minéraux comme la montmorillonite, qui n'était cependant pas abondante à l'Hadéen/Archéeen. La minéralogie de la Terre primitive aurait plutôt été dominée par les phyllosilicates ferromagnésiens. Nous avons étudié l'adsorption de nucléotides sur des minéraux plus cohérents avec le contexte géologique, en variant les paramètres environnementaux. Ce travail permet de préciser le mécanisme d'adsorption des nucléotides sur les surfaces minérales, ainsi que les conditions de l'origine du matériel génétique.

Durant ma thèse, mes études ont été axées sur le développement de nouvelles sondes et des protocoles chimiques pour l'élucidation des mécanismes d'action et de résistance pour les trois médicaments anticancéreux (cisplatine, le vorinostat, topotécan). L'idée de sondes chimiques qui peuvent être étiquetés post-traitement in cellulo avec des fluorophores par exemple Alexa Fluor 488 ou affinité des fragments par exemple biotine, nous a fasciné pour effectuer petite visualisation de molécule par microscopie confocale, ou pour développer des protocoles tirer vers le bas pour les petites cibles moléculaires d'isolement. Beaucoup d'attention a été accordée à catalysée par du cuivre 1, 3 dipolaire cycloaddition Huisgen, connu sous le nom ''click'' la chimie au cours de la dernière décennie, car il est l'une des premières réactions qui peuvent être considérés comme des bio-orthogonale. Toutes les sondes portent soit un alcyne ou groupement azoture stratégiquement positionnés qui leur permet de participer à la réaction de clic avec des fluorophores ou biotine alcyne ou azoture fonctionnalisés que countrparts, et dans le même temps de conserver le profil pharmacologique du médicament parental. Un certain nombre de défis synthétiques ont été overcomed pour la préparation d'une sonde chimique de base de cisplatine. Les efforts visant à synthétiser des analogues alcynes fonctionnalisés de cisplatine ont été infructueuses, la sonde chimique à base de cisplatine était donc fonctionnalisés azoture. La mise au point d'un protocole d'imagerie pour la visualisation de lésions de l'ADN platiné nous a permis de cribler une banque limitée de petites molécules en même temps que la sonde de cisplatine, afin d'identifier des médicaments qui peuvent moduler le cisplatine ciblage ayant des lésions de l'ADN platiné comme une lecture. Il est frappant, nous avons constaté que le vorinostat a eu un effet dramatique sur motif de coloration de la sonde de cisplatine. D'autres études ont démontré que le prétraitement des cellules avec vorinostat augmente charge de platine sur certains loci génomiques. En outre, une évaluation biologique plus approfondie a montré que la combinaison de vorinostat avec des médicaments de platine atténue les dommages à l'ADN synthèse voie de tolérance de translésionnelles (TLS), ainsi, ce qui conduit à la mort cellulaire. Enfin, je l'ai mis au point un protocole tirer vers le bas pour l'isolement de l'ADN qui est lié à la cisplatine en étiquetant la sonde en platine avec un fragment de biotine. Cartographie des interactions ADN-platine en utilisant le séquençage à haut débit profonde est en cours d'exécution. Vorinostat sonde chimique à base a été préparé dans une voie de synthèse en quatre étapes. Bien que le vorinostat est un médicament connu pour inhiber des histone désacétylases (HDAC), petite visualisation de molécule a indiqué d'abord un profil de coloration cytoplasmique. Les futures études dans notre laboratoire se concentrera sur le développement d'un protocole déroulant, afin de caractériser complètement le vorinostat interactome. Quoique, trois sondes chimiques à base de topotécan différents ont été préparés de la personne a été visualisé les succès par microscopie confocale. L'échec a été attribué à l'échec de la réaction "click" pour marquer la sonde avec le fluorophore. Le topotécan est une petite molécule qui agit comme un inhibiteur d'interface, formant ainsi un complexe ternaire avec l'ADN et la topoisomérase 1. L'encombrement stérique généré par le complexe ternaire autour de la sonde, dicte l'inaccessibilité de l'alcyne de la sonde de "click" réactifs. / During my PhD, my studies have been focused on the development of novel chemical probes and protocols for the elucidation of the mechanisms of action and resistance for three anticancer drugs (cisplatin, vorinostat, topotecan). The idea of chemical probes that can be tagged post treatment in cellulo with fluorophores e.g. ALEXA FLUOR 488 or affinity moieties e.g. biotin, has fascinated us to perform small molecule visualization via confocal microscopy, or to develop pull down protocols for isolation small molecule targets. Much attention has been given to copper catalyzed 1, 3 dipolar Huisgen cycloaddition, known as ‘’click’’ chemistry over the past decade, since it is one of the first reactions that can be considered as bio-orthogonal. All the probes bear either an alkyne or azide moiety strategically positioned that allows them to participate in the click reaction with alkyne or azide functionalized fluorophores or biotin as countrparts, and at the same time to retain the pharmacological profile of the parental drug.A number of synthetic challenges have been overcomed for the preparation of a cisplatin based chemical probe. Efforts to synthesize alkyne functionalized analogues of cisplatin were unsuccessful, thus cisplatin based chemical probe was azide functionalized. The development of an imaging protocol for the visualization of platinated DNA lesions has enabled us to screen a limited library of small molecules along with the cisplatin probe, in order to identify drugs that can modulate cisplatin targeting having platinated DNA lesions as a readout. Strikingly, we found that vorinostat had a dramatic effect on cisplatin probe staining pattern. Further studies have demonstrated that pre-treatment of cells with vorinostat increases platinum loading on certain genomic loci. Furthermore, a more in depth biological evaluation has demonstrated that the combination of vorinostat with platinum drugs attenuates the DNA damage tolerance pathway translesion synthesis (TLS), thus, leading to cell death. Finally, I have developed a pull down protocol for the isolation of DNA that is bound to cisplatin by tagging the platinum probe with a biotin moiety. Mapping of DNA-platinum interactions using deep high throughput sequencing is currently running.Vorinostat based chemical probe has been prepared in a four step synthetic route. Although, vorinostat is a drug known to inhibit histone deacetylases (HDACs), small molecule visualization has indicated primarily a cytoplasmic staining pattern. Future studies in our laboratory will focus on the development of a pull down protocol, in order to fully characterize vorinostat interactome.Albeit, three different topotecan based chemical probes have been prepared none of the them has been successfully visualized by confocal microscopy. The failure has been attributed to the failure of the “click” reaction to tag the probe with the fluorophore. Topotecan is a small molecule that acts as an interfacial inhibitor, thus forming a ternary complex with DNA and topoisomerase 1. The steric hindrance generated by the ternary complex around the probe, dictates the inaccessibility of the alkyne moiety of the probe to “click” reagents.

Le ribosome est un macro complexe moléculaire en charge de la synthèse de toutes lesprotéines de la cellule. Depuis les premiers essais de reconstruction in vitro d’un ribosome procaryote,des générations de chercheurs se sont succédées durant plusieurs décennies pour tenter d’éluciderles voies par lesquelles les ribosomes sont assemblés par la cellule. Un regain d’intérêt pour l’étude dela biogenèse du ribosome est advenu récemment suite à la mise en évidence de maladies liées à desmutations dans des acteurs de la biogenèse du ribosome mais également, et surtout, suite à la miseen évidence du rôle fondamental du ribosome dans les processus de transformation oncogénique.Le ribosome est composé de deux sous-unités, une petite et une grande, formées, ellesmêmes,d’un assemblage intriqué d’ARN ribosomique et de protéines ribosomiques. La formation d’unribosome, appelée biogenèse du ribosome, est un processus complexe, intégré et extrêmementhiérarchisé impliquant, chez la levure, plus 200 facteurs accessoires. Bien que les principes sousjacentsà la biogenèse du ribosome eucaryote établis à partir d’études réalisées chez la levure semblentconservés chez l’Homme, de nombreux éléments suggèrent qu’elle y soit plus complexe. Ainsi, latransposition directe chez l’Homme des connaissances acquises chez la levure quant à la biogenèse duribosome serait, tout du moins partiellement, inexacte.Au cours de ma thèse, j’ai poursuivi différents objectifs s’intégrant tous dans le cadre de labiogenèse du ribosome eucaryote. D’une part, chez la levure, j’ai poursuivi la caractérisation du rôlede la protéine Las1 dans la biogenèse de la grande sous-unité ribosomique. D’autre part, chezl’Homme, mon objectif premier a été de participer à l’identification de nouveaux facteurs accessoiresimpliqués dans la biogenèse du ribosome et à la caractérisation fonctionnelle de certains d’entre eux.Dans un second temps, je me suis concentré sur l’implication de deux particules ribonucléoprotéiquesnucléolaires, appelées snoRNP, dans la biogenèse du ribosome mais également dans le développementtumoral. Finalement, le dernier objectif de ma thèse a été de participer, dans le cadre d’un projettransverse réalisé chez la levure et chez l’Homme, à l’étude d’une protéine en charge d’une desmodifications que portent les ARN ribosomiques.Pris ensemble, les différents objectifs que j’ai poursuivis au cours de ma thèse, permettent desavancées fondamentales dans la connaissance du processus de la biogenèse du ribosome chez leseucaryotes mais aussi dans la caractérisation de l’impact clinique de certains acteurs de cette voie. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Pathogenic nucleic acid detection, in aiming to diagnose infectious diseases and thus better provide a better treatment for them is a very important goal for human health. Moreover, as more and more links are discovered between hereditary diseases and DNA mutations, their diagnostic based on DNA mutation detection is increasingly important. Throughout this Ph. D. project, we developed a fluorometric method for nucleic acid detection based on a water-soluble cationic polymer able to transduce DNA hybridization. We demonstrated the applicability of this method to detect DNA oligonucleotides of different lengths as well as single stranded RNA extracted from the flu virus. With the use of optimized experimental conditions and a custom-built fluorimeter, we demonstrated the ability to detect as little as 220 target DNA copies in the probed volume. Since DNA is present in its double stranded form in most organisms, we also developed an experimental method allowing double stranded DNA detection with the polymeric transducer. Furthermore, we modified our DNA detection process by using fluorescence resonance energy transfer. This process, named fluorescence chain reaction and discovered by Dr. Hoang-Anh Ho, is based on a fluorescence signal amplification mechanism and allows the detection of as few as 20 copies of target DNA. With this method, it was possible to detect a single base mutation responsible for type 1 hereditary tyrosinemia in unpurified genomic DNA extracted from patient blood. Subsequently, we concentrated our efforts on the characterization of this fluorescence signal amplification mechanism. Thus, we established that the fluorescence chain reaction happens in rod-like micellar aggregates of 400 nm in length containing between 4000 and 5000 polymer-tagged DNA probe complexes. This aggregated structure maintains the fluorescent donors near the acceptors, thus greatly helping the fluorescence resonance energy transfer mechanism. Moreover, the conjugated structure of the polymeric transducer allows efficient energy transportation along its chain, accelerating the energy transfer mechanism. / Pathogenic nucleic acid detection, in aiming to diagnose infectious diseases and thus better provide a better treatment for them is a very important goal for human health. Moreover, as more and more links are discovered between hereditary diseases and DNA mutations, their diagnostic based on DNA mutation detection is increasingly important. Throughout this Ph. D. project, we developed a fluorometric method for nucleic acid detection based on a water-soluble cationic polymer able to transduce DNA hybridization. We demonstrated the applicability of this method to detect DNA oligonucleotides of different lengths as well as single stranded RNA extracted from the flu virus. With the use of optimized experimental conditions and a custom-built fluorimeter, we demonstrated the ability to detect as little as 220 target DNA copies in the probed volume. Since DNA is present in its double stranded form in most organisms, we also developed an experimental method allowing double stranded DNA detection with the polymeric transducer. Furthermore, we modified our DNA detection process by using fluorescence resonance energy transfer. This process, named fluorescence chain reaction and discovered by Dr. Hoang-Anh Ho, is based on a fluorescence signal amplification mechanism and allows the detection of as few as 20 copies of target DNA. With this method, it was possible to detect a single base mutation responsible for type 1 hereditary tyrosinemia in unpurified genomic DNA extracted from patient blood. Subsequently, we concentrated our efforts on the characterization of this fluorescence signal amplification mechanism. Thus, we established that the fluorescence chain reaction happens in rod-like micellar aggregates of 400 nm in length containing between 4000 and 5000 polymer-tagged DNA probe complexes. This aggregated structure maintains the fluorescent donors near the acceptors, thus greatly helping the fluorescence resonance energy transfer mechanism. Moreover, the conjugated structure of the polymeric transducer allows efficient energy transportation along its chain, accelerating the energy transfer mechanism. / La détection d'acides nucléiques pathogènes afin de faire le diagnostic de maladies infectieuses et ainsi mieux diriger leur traitement est un enjeu très important pour la santé humaine. Aussi, comme les mutations responsables des maladies génétiques sont de mieux en mieux connues, leur détection est maintenant possible. Au cours de ce projet de doctorat, nous avons élaboré une méthode de détection d'acides nucléiques basée sur un polymère cationique soluble dans l'eau capable de traduire la réaction d'hybridation de l'ADN en un signal optique. Nous avons démontré l'applicabilité de cette méthode pour faire la détection par fluorescence d'oligonucléotides d'ADN de différentes longueurs ainsi que d'ARN viral. Avec l'utilisation de conditions expérimentales optimisées et d'un fluorimètre conçu spécialement pour cette application, nous avons pu détecter aussi peu que 220 copies d'ADN. Par la suite, comme l'ADN est présent chez la majorité des organismes vivants sous la forme de double hélice, nous avons élaboré une méthode expérimentale originale permettant la détection directe de cette forme d'ADN. Par la suite, nous avons modifié notre méthode pour augmenter sa sensibilité en utilisant le transfert énergétique résonnant de fluorescence. Un mécanisme d'amplification du signal de fluorescence a ainsi été découvert par le Dr. Hoang-Anh Ho. Cette méthode que nous avons nommée superallumage, nous a permis de faire la détection d'aussi peu que 5 copies d'ADN cible. Avec cette méthode il a été possible de faire la détection d'une seule mutation génétique responsable de la tyrosinémie héréditaire de type 1 dans des échantillons d'ADN génomique non purifiés. Finalement, nous avons concentré nos efforts sur l'étude du phénomène d'amplification de la fluorescence menant au superallumage. Ainsi, nous avons établi que le superallumage se produit dans des agrégats micellaires ayant la forme d'un bâtonnet mesurant 400 nm de long et contenant entre 4000 et 5000 complexes polymère-sonde d'ADN marquée. Cette structure agrégée maintient les fluorophores donneurs très près des accepteurs de fluorescence, ce qui favorise grandement le processus de transfert énergétique résonnant. De plus, la structure conjuguée du polymère transducteur permet un transport efficace de l'énergie le long de sa chaîne, ce qui accélère le transfert énergétique résonnant.

La technologie des biopuces permettrait une détection rapide et multiparamétrique des microorganismes infectieux et des gènes de résistance aux antibiotiques qui leur sont associés. Deux aspects des biopuces ont été étudiés durant ce projet. Premièrement, dans le but de faciliter la conception des sondes de capture, nous avons évalué l’influence de la position de la cible hybridée par une sonde. Nous avons observé que la longueur des chaînes non-hybridées dépassant de la sonde de capture avait une influence sur le signal d’hybridation obtenu et pouvait être responsable de faux-négatifs. Deuxièmement, afin de contribuer à éliminer la nécessité de l’amplification et du marquage des acides nucléiques cibles, nous avons développé une biopuce composée de sondes APN immobilisées sur une lame de verre. Cette biopuce permettra l’utilisation d’un polymère cationique senseur d’acides nucléiques comme transducteur de l’hybridation. / Biochip technology could allow rapid multiparametric diagnosis of infectious diseases and related antimicrobial resistance genes. Two aspects of biochips were studied during this project. First, to facilitate DNA or PNA capture probes design, we studied the impact on hybridisation signal of the position targeted by the probe. We observed that the length of the target’s non-hybridised overhangs had an influence on obtained hybridisation signal and that it could be responsible for false-negatives. Second, in order to contribute to the elimination of sample nucleic acids amplification and labelling before hybridisation, we developed a biochip made of PNA probes immobilised on a glass slides. This biochip allows detection using a soluble fluorescent cationic polythiophene that acts as hybridisation transducer.

Pour aider à la protection de l’environnement et au diagnostic de maladies, il est nécessaire de disposer de méthodes d’analyse performantes. Ces méthodes doivent être rapides et peu coûteuses afin d’analyser un grand nombre d’échantillons et détecter la présence éventuelle de la molécule recherchée. C’est dans ce cadre qu’un bio-essai à double reconnaissance dédié aux petites molécules a été développé. Il repose sur l’utilisation d’aptamères comme élément de reconnaissance moléculaire et sur la formation de « kissing complex ». Les aptamères sont des oligonucléotides qui possèdent une grande spécificité et une grande affinité pour leur cible. Les « kissing complexes » désignent, quant à eux, l’interaction de deux séquences au niveau de leur boucle apicale. L’objectif de la thèse est de continuer l’étude et l’optimisation de ce schéma d’analyse, puis montrer sa potentialité et sa versatilité. Dans un 1er temps, la détection en multiplexe de plusieurs petites molécules a été mise en place. L’optimisation du système de détection a ensuite été effectuée pour la détection de l’adénosine avec le développement d’une nouvelle stratégie de détection. Enfin, un test colorimétrique basé sur l’utilisation de nanoparticules d’or a été décrit. / Bioanalytical tools based on molecular recognition elements constitute one of the most important strategies used to routinely quantify low molecular weight analytes in biological fluids or environmental matrices as disease-related biomarkers, drugs or toxins/contaminants. Recently, a novel aptamer-based sensing design has been reported. It is based on a dual recognition mechanism that involves the formation of functional nucleic acid architectures, named “kissing complex”. Aptamers are single stranded oligonucleotides that possess high affinity and high selectivity for their target. The aim of this thesis is to pursue the study and the optimization of this sandwich like scheme and to prove its potential. Firstly, the simultaneous detection of multiple small analytes by fluorescence anisotropy using the sandwich like scheme has been reported. Then, this novel bioassay has been optimized through the development of a new strategy. Finally, a gold nanoparticle colorimetric

Depuis plusieurs années, les quadruplexes de guanine ou G4, structures particulières de l’ADN, suscitent un intérêt grandissant. Ces structures, largement étudiées in vitro, sont encore peu connues in vivo mais semblent jouer un rôle important dans la régulation de l’expression génétique. Elles ont rapidement été considérées comme des cibles thérapeutiques potentielles pour certaines maladies telles que le cancer. Le premier indice de leur existence dans les cellules n’a été obtenu qu’en 2013 par immunodétection sur des cellules fixées. Les recherches sont actuellement tournées vers le développement de nouveaux outils moléculaires qui permettraient la visualisation des G4 dans des cellules vivantes.C’est dans ce cadre que nous avons conçu et développé une série de complexes polyazaaromatiques de ruthéniumII à base de ligands plans étendus (heptacycle dpqp et octacycle dppqp). La combinaison des propriétés photophysiques des complexes de RuII associée à la présence d’un large plan étendu devant permettre l’interaction avec les G4, positionne ces molécules comme outils potentiels pour l’étude des G4 in vivo.La première partie de ce projet porte sur la synthèse de ces nouveaux complexes de ruthénium. Une méthode originale de "chimie sur complexe" a permis d'obtenir, entre autres, un complexe possédant le ligand dpqp, fonctionnalisé par une triple liaison. Il a également été possible, « par chimie sur complexe », de construire un cycle supplémentaire sur le ligand heptacyclique (dpqp) chélaté pour obtenir les complexes [Ru(L)2dppqp]2+. Les propriétés photophysiques des différents complexes ont été étudiées. Seuls deux complexes, [Ru(phen)2dpqp-Cl]2+ et [Ru(TAP)2dpqp-Cl]2+, présentent un comportement s’approchant de celui des complexes de référence; c’est à dire des rendements quantiques comparables à [Ru(bpy)3]2+ et des durées de vie de l’état excité de l’ordre de la centaine de nanosecondes. Les autres complexes sont non luminescents et l’hypothèse d’un quenching par transfert de proton à l’état excité a été avancée pour expliquer ce comportement.Les complexes ont aussi été évalués vis à vis de différentes structures oligonucléotidiques G4 et duplexes. Tous les complexes possèdent une affinité correcte envers les G4. Comme nous l'espérions, le complexe porteur du ligand octacyclique semble être particulièrement sélectif envers les G4 par rapport à l'ADN double brin. Il a aussi été montré que deux des complexes testés peuvent être utilisés comme sondes moléculaires "light-switch ON" pour les structures G4 en milieu cellulaire. Certains des complexes synthétisés sont donc d’excellents candidats en tant qu’outils moléculaires pour l’étude des G4 in vivo. / The interest for some unusual structures of DNA, the G4 quadruplexes was growing these past few years. Those structures were extensively studied in vitro, but a lot remains unkwown about their existence in vivo. Intererstingly, G4 structures seem to play key regulatory roles in gene expression and are therefore potential therapeutic targets for diseases such as cancer. Consequently, visualisation of those structures in cells is the present challenge today, and the use of small molecules with luminescent properties is promising in this context.In this framework, we designed a series of new rutheniumII complexes chelating a large planar aromatic ligand, (heptacycle dpqp or octacycle dppqp). The combination of the photophysical properties of RuII complexes with proposed favorable stacking properties of the ligand with G4, would make these complexes promising molecular tools for G4 visualization.The first part of this project focusses on the synthesis of ruthenium complexes and their specific ligands. One particular ligand is formed by the condensation between acridine and phenanthroline moieties. A chemistry on the complex approach enabled us 1) to functionnalize the chelated ligand by a triple bond that will be used for the formation of an heterodimer by click chemistry, and 2) to build an additional cycle on the chelated ligand. Photophysical properties were evaluated and only two complexes, [Ru(phen)2dpqp-Cl]2+ and [Ru(TAP)2dpqp-Cl]2+, exhibit the same photophysical behaviour than the reference complexes. Indeed, the quantum yields are in the same order of magnitude than for [Ru(bpy)3]2+ and the excited state lifetime are of a few hundred nanosecondes. The other complexes are non-luminescent and a quenching by excited state proton transfer was hypothesised to explain this unusual behaviour. Interaction properties with G4 DNA were evaluated. All complexes display good affinity towards G4 and as expected, the complexe bearing the octacyclic ligand shows a strong selectivity towards G4 compared to dsDNA. Two of the complexes were proven to be potential luminescent light-switch ON probes for G4 detection in cells. In conclusion, this work highlights the possibility to use some of the newly synthetized complexes as efficient molecular tools for G4 visualization in cells.

Les tumeurs sont, au moins en partie, des maladies de la régulation du cycle cellulaire. Le point de restriction (R) est un point fondamental du cycle cellulaire où les cascades de signalisation mitogéniques (y compris leurs perversions oncogènes) et l'état métabolique des cellules sont intégrés pour engager le cycle de division cellulaire. Les CDK4 et CDK6 sont les premières CDKs à être activées en réponse aux signaux de prolifération cellulaire.En initiant la phosphorylation inactivatrice de l'oncosuppresseur central pRb, les CDK4 / 6 liées aux cyclines D jouent un rôle essentiel dans le passage du point R et donc dans la décision de multiplication cellulaire, en particulier dans la plupart des cellules cancéreuses dans lesquelles l'activité de CDK4 est fortement dérégulée. Les médicaments inhibiteurs de CDK4 / 6 sont maintenant évalués dans la plupart des cancers dans de nombreux essais cliniques. Le plus avancé (Palbociclib-PD0332991) a été approuvé en 2015 par la FDA pour le traitement des cancers métastatiques du sein. Notre groupe a identifié la phosphorylation activatrice sur la Thr172 comme l'étape hautement régulée qui détermine l'activation de CDK4. La question de savoir si les phosphorylations de CDK4 et de CDK6 sont catalysées par la seule « CDK-activating kinase » (CAK, cycline H-CDK4-Mat1) reste incertaine. En utilisant des cellules de cancer colorectal (HCT116) exprimant une version de CDK7 spécifiquement inhibable (dite « analog sensitive »), nous avons participé à une étude qui démontre, d’une part, une implication cruciale de la CDK7 dans la phosphorylation / activation de CDK4 et CDK6 et, d’autre part, l'existence de kinase(s) activatrice(s) de la CDK4 différente(s) de la CDK7. De plus, cette étude a démontré que l'activité de la CDK7 était conditionnée, au moins en partie, par la liaison de p21 à la CDK4, laquelle augmentait en réponse à l'inhibition de CDK7. L’augmentation de cette liaison coïncidait avec la disparition de la phosphorylation la plus abondante de p21, que nous avons localisée (par des analyses d'électrophorèse bidimensionnelle) sur la Ser130 et que nous avons montré être catalysée par la CDK4 et la CDK2. De manière surprenante, la phosphorylation sur Ser130 de p21 était inhibée non seulement par l'inhibition de CDK7, mais également par la Roscovitine et le CR8 (inhibiteurs de CDK2) et le Palbociclib. Ensemble, ces observations suggèraient que l'inactivation de pRb et le passage de R sont contrôlés par des mécanismes de rétroaction positive dépendants de la CDK7 médiés par la phosphorylation de la p21 par la CDK4 et la CDK2 pour faciliter et maintenir l'activation de la CDK4. De plus, nos résultats confirmaient l’hypothèse de l'existence kinase(s) activatrice(s) de la CDK4 autre(s) que la CDK7. Notre groupe avait démontré précédemment que la régulation de la phosphorylation de la CDK4 ne s'applique pas à son homologue CDK6, ce qui s'expliquait par l'absence d'une proline critique dans le domaine phosphoaccepteur (QMALTPVVVT dans CDK4 vs QMALTSVVVT dans CDK6). Ces données iniquaient que la ou les kinase (s) responsable(s) de la phosphorylation sur Thr172 de CDK4 devrai(en)t être dirigée(s) par la proline 173 uniquement présente dans la CDK4 (« proline-directed kinase(s) »).L'objectif principal de cette thèse est l'identification de kinase(s) impliquée(s) dans cette phosphorylation. Nous avons donc sélectionné une liste restreinte de « proline-directed kinases » (PDK) requises pour la prolifération cellulaire. Parmi celles-ci, les JNK, qui sont des PDKs, sont des interacteurs de p21 et CDK4 et peuvent avoir un rôle oncogène. De manière importante, nous avons observé que les JNKs, mais pas la CAK / CDK7, phosphorylaient in vitro la p21 et la CDK4 liée aux cyclines D. Les JNKs phosphorylaient également p21 sur ses trois sites P-T/S (Thr57, Ser130, Ser98). En mutant ces sites (T57A, S130A, S98A, T57A / S130A), nous avons montré que la phosphorylation de p21 par les JNKs n'est pas nécessaire pour la phosphorylation et l'activation de la CDK4 liée à p21. Par conséquent, in vitro les JNKs peuvent activer les complexes CDK4 liés à la p21, en agissant d’une part comme des kinases phosphorylant directement la CDK4 dans les complexes de cycline D-CDK4 stabilisés par la liaison de p21 et d’autre part en phosphorylant indépendamment des résidus de p21 impliqués dans l'activation de CDK4 dépendante de la CAK. Pour démontrer la relevance in vivo du rôle des JNKs comme kinases activatrices de la CDK4, nous avons analysé l'effet de leur inhibition dans les lignées de cellules tumorales T98G et MCF-7, les cellules MEF et des cellules CHO transfectées: dans tous ces cas, l'inhibition des JNKs, y compris l'inhibition spécifique de l'activité de JNK2 par une approche de génétique chimique en collaboration avec le groupe de Roger Davis, a réduit l'entrée du cycle cellulaire, et la phosphorylation et l'activation des complexes de cycline D1-CDK4. De manière intéressante, l’activation des complexes de cycline D3-CDK4 n’était pas affectée par l’inhibition des JNKs, apparemment parce que ces complexes étaient principalement associés à la p27 plutôt qu’à la p21. Mis ensemble, ces différents résultats nous amènent à proposer un nouveau modèle dans lequel différentes kinases activatrices de la CDK4, y compris les JNKs (indépendamment des phosphorylations de p21) et la CAK/CDK7 (de manière dépendante des phosphorylations de p21), coopèrent pour initier et maintenir l'activation de la CDK4 et générer la décision du cycle cellulaire. Cette nouvelle compréhension pourrait révéler de nouveaux mécanismes ciblables dans une perspective thérapeutique anti-cancéreuse. / Tumors are, at least in part, diseases of cell cycle regulation. The restriction (R) point is a fundamental point of the cell cycle in which mitogenic signaling cascades (including their oncogenic perversions) and cell metabolic status are integrated to commit the cell division cycle. CDK4 and CDK6 are the first CDKs to be activated in response to cell proliferation signals. By initiating the inactivating phosphorylation of the central oncosuppressor pRb, cyclin D-bound CDK4/6 play an essential role at the passage through R and thus in the cell multiplication decision, especially in most cancer cells in which CDK4 activity is highly deregulated. CDK4/6 inhibitory drugs are now evaluated in many clinical trials against most cancers, and the most advanced (Palbociclib-PD0332991) was approved in 2015 by FDA for treatment of metastatic breast cancers. Our group has identified the activating Thr172 phosphorylation as the highly regulated step that determines CDK4 activation. Whether CDK4 and CDK6 phosphorylations are catalyzed by the sole CAK (cyclin H-CDK7-Mat1) remains unclear. In analogue-sensitive CDK7 (as/as) mutant HCT116 cells in which CDK7 can be specifically inhibited, we participated to a study demonstrating a crucial CDK7 involvement in phosphorylation/activation of CDK4 and CDK6 and existence of non-CDK7 CDK4 activating kinase(s). Moreover, this study demonstrated that CDK7 activity was conditioned, at least in part, by p21 binding to CDK4, which increased in response to CDK7 inhibition. This coincided with disappearance of the most abundant phosphorylation of p21, which was localized (by 2D-gel electrophoresis analyses) at Ser130 and found to be catalyzed by both CDK4 and CDK2. Surprisingly, Ser130 p21 phosphorylation was not inhibited only by CDK7 inhibition, but also by Roscovitine and CR8 (CDK2 inhibitors) and Palbociclib. All together, these observations suggested that pRb inactivation and R passage are controlled by CDK7-dependent positive feedbacks mediated by p21 phosphorylation by CDK4 and CDK2 to sustain CDK4 activation. Importantly, these results confirm the hypothesis of a non-CDK7 CDK4 activating kinase(s). Our group has previously demonstrated that the regulation of CDK4 phosphorylation does not apply to its homologue CDK6, which was explained by the lack of a critical proline in the phospho-acceptor domain (QMALTPVVVT in CDK4 vs QMALTSVVVT in CDK6). These data have indicated that the activity of kinase(s) responsible for Thr172 phosphorylation of CDK4 should be directed by the unique proline 173 of CDK4 (proline-directed kinase(s)). The primary objective of this thesis is the identification of kinase(s) involved in this phosphorylation. We thus selected a shortlist of proline-directed kinases (PDKs) required for cell proliferation. Among them JNKs, which are PDKs, are interactors of p21 and CDK4 and can have an oncogenic role. Importantly, we observed that JNKs, but not CAK/CDK7, did phosphorylate CDK4 in vitro in their complexes with cyclins D stabilized by p21 binding. JNKs also phosphorylated p21 in the three P-T/S phosphorylation sites (Thr57, Ser130, Ser98). Mutating p21 phosphorylation sites (T57A,S130A,S98A,T57A/S130A) we also demonstrated that in vitro, the phosphorylation of p21 by JNKs is not required for the phosphorylation and activation of p21-bound CDK4. Therefore, in vitro JNKs might activate p21-bound CDK4 complexes by acting as a direct CDK4-activating kinases for cyclin D-CDK4 complexes stabilized by p21 binding and also by independently phosphorylating p21 residues involved in CAK-dependent activation of CDK4. To demonstrate the relevance of the role of JNKs as possible CDK4-activating kinases in vivo we analyzed the effect of their inhibition in T98G and MCF-7 tumor cell lines, MEFs and transfected CHO cells: in all these cases, inhibition of JNKs, including specific inhibition of JNK2 activity by a chemical genetic approach in collaboration with Roger Davis group, reduced the cell cycle entry and phosphorylation and activation of cyclin D1-CDK4 complexes. Interestingly, the activation of cyclin D3-CDK4 complexes was not affected by the JNK inhibition, apparently because these complexes were mainly associated with p27 instead of p21. Putting together all these results, we propose a new model in which different CDK4-activating kinases, including JNKs (independently of p21 phosphorylation) and CAK/CDK7 (dependently on p21 phosphorylation), cooperate to initiate and maintain the activation of CDK4 and generate the cell cycle decision. This new understanding may reveal new druggable mechanisms and anti-cancer therapeutic targets. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished