Doctor en Bioquímica / Acidithiobacillus ferrooxidans es una bacteria extremófila de gran importancia industrial debido a su participación en la recuperación de metales como cobre, oro y uranio en biominería. Esta bacteria puede resistir altas concentraciones de cobre y otros metales, característica fundamental para sobrevivir a las condiciones de la biolixiviación de minerales. La presencia en A. ferrooxidans ATCC 23270 de determinantes de resistencia a cobre canónicos (bombas de eflujo, chaperonas que unen cobre, etc) no explican completamente cómo esta bacteria resiste concentraciones de cobre extremas, sugiriendo la existencia de otros mecanismos de resistencia al metal. Para identificar nuevos posibles determinantes de resistencia en este microorganismo, se evaluó los niveles de síntesis de proteínas por análisis proteómico por electroforesis bidimensional (IEF-SDS PAGE) y también se determinó los niveles de mRNA de algunos genes que codifican estos determinantes por PCR en tiempo real (qRT-PCR). Además, mediante proteómica cuantitativa por ICPL (isotope-coded protein labeling) se identificó 366 proteínas de las que 47 cambian sus niveles de síntesis en células crecidas en azufre en presencia de cobre, mientras que en hierro se identificó 594 proteínas de las que 120 cambian en presencia del metal. Mediante esta estrategia se identificó la sobreexpresión de proteínas de membrana que forman parte de un sistema Cus y un sistema de eflujo del tipo RND diferente en A. ferrooxidans crecidos en presencia de cobre, sugiriendo un eflujo dinámico de cobre a través de las membranas. Además se observó la sobreexpresión de la mayoría de los genes involucrados en la síntesis de histidina y de varios genes que participan en la síntesis de cisteína, indicando una posible función de estos aminoácidos que unen metales en la destoxificación del cobre intracelular. También se detectó el aumento en la síntesis de una posible disúlfuro isomerasa periplasmática, indicando que esta proteína repararía puentes disúlfuro dañados para permitir la supervivencia celular en condiciones de estrés. Por otro lado, se observó la represión de la porina de membrana externa más abundante de A. ferrooxidans (Omp40) y de otros canales iónicos, lo que sugiere una disminución del influjo del metal hacia el interior de la célula. Finalmente, se identificó en A. ferrooxidans crecidos en azufre y en presencia de cobre un incremento en la síntesis de algunas proteínas relacionadas con la formación de biopelículas. Esto sugiere que el crecimiento de la bacteria adherida a un medio sólido mejoraría la resistencia al cobre del microorganismo. Los resultados obtenidos indican que A. ferrooxidans usaría no sólo estrategias canónicas de resistencia a cobre como sistemas del tipo RND, sino que también mecanismos adicionales en los que varias proteínas de la envoltura celular y citoplasmáticas serían componentes principales. Por medio de este trabajo se identificó nuevas proteínas que participarían en la resistencia a cobre en A. ferrooxidans contribuyendo a mejorar el conocimiento sobre los mecanismos de resistencia a este metal de esta bacteria, lo que podría proporcionar las herramientas para optimar la resistencia a cobre de otros microorganismos biomineros y la eficiencia del proceso de biolixiviación / Acidithiobacillus ferrooxidans is an extremophilic bacterium of great industrial importance due to its participation in the recovery of metals such as copper, gold and uranium through biomining. This bacterium is able to resist high copper and other metal concentrations, an essential property to survive the environmental conditions during industrial ore bioleaching. The presence in A. ferrooxidans ATCC 23270 of canonical copper-resistance determinants (efflux pumps, metal chaperones, etc) do not fully explain how this bacterium is able to resist extreme copper concentrations, suggesting the existence of other mechanisms of resistence. To identify new possible copper resistance determinants in A. ferrooxidans ATCC 23270, levels of protein synthesis were determined by proteomic analysis through two-dimensional electrophoresis (IEF-SDS PAGE). In addition, the RNA levels of some genes encoding these putative resistence determinants was also measured by real-time PCR (qRT-PCR). Furthermore, through quantitative ICPL (isotopecoded protein labeling) proteomics 366 proteins we identified of which 47 changed their levels of synthesis in cells grown in sulfur in the presence of copper while in iron grown cells 594 proteins were identified. One hundred and twenty of then changed their levels in the presence of copper. Using this strategy the up-regulation of membrane proteins that are part of RND-type Cus systems and new different RND-type efflux pumps were identified in A. ferrooxidans grown in the presence of copper, suggesting a dynamic metal efflux through the membranes. Furthermore, the overexpression of most genes involved in histidine biosynthesis and several genes involved in the biosynthesis of cysteine was observed, suggesting a possible role of these metal-binding amino acids in detoxifying of intracellular copper. In addition, the up-regulation of a putative periplasmic disulfide isomerase was also seen in the presence of copper, suggesting that this protein would restore damaged disulfide bonds to allow cell survival in stress conditions. On the other hand, the down-regulation of the major outer membrane porin (Omp40) and some ionic transporters observed in A. ferrooxidans grown in the presence of copper indicated a general decrease in the influx of the metal and other cations into the cell. Finally, in A. ferrooxidans grown in sulfur and in the presence of copper, an increase in the synthesis of some proteins related to biofilm formation was found. This suggests that growth of bacteria adhered to a solid medium may enhance copper resistance of this microorganism. The results indicate that A. ferrooxidans would use not only canonical strategies of resistance to copper such as RND-type systems, but also additional mechanisms where several proteins of the cell envelope and cytoplasm would be main components. Through this work we identified novel proteins that participate in copper resistance in A. ferrooxidans contributing to a better understanding of the mechanisms of copper resistance of this bacterium, which could provide the tools to improve copper resistance to other biomining microorganisms and bioleaching process efficiency / Conicyt Fondecyt

El presente trabajo experimental tuvo dos partes: La primera, fue la biolixiviación de tres minerales sulfurados utilizando como agente de biol ixivi ación microorganismos pertenecientes al género de los Acidithiobacil/us. El objetivo primordial es mostrar la capacidad lixiviadora de la bacteria y su aplicación comercial. En la segunda parte se utilizó un mineral refractario de oro para realizar un estudio de liberación del oro de su matriz / Biometallurgical applicationsThe present work had two parts: First, it was the bioleaching of three sulfide minerals using Acidithiobacillus microorganism as a bioleaching agent. The main goal is to show the leaching capacity of the bacteria and its commercial application. In the second part, a refractory gold sulfide ore was used to study the release of gold from its matrix

La presente investigación tuvo como objetivo el aislamiento y determinación de las bacterias del género Acidithiobacillus y Leptospirillum presentes en las aguas residuales de las unidades mineras de Recuay – Huaraz. Con este fin se recolectaron 3 muestras del efluente y se llevaron al laboratorio donde fueron sometidas al enriquecimiento en medios de cultivo 9K y TK líquidos, con un pH de 1.5 y se realizó un conteo poblacional cada 24 horas haciendo uso de la cámara de Newbauber. Se obtuvó la mayor concentración bacteriana en el tratamiento 1 con 9.33E+06 cel/ml durante la etapa de enriquecimiento. Por otro lado, para el aislamiento del cultivo se utilizó medio 9K líquido y sólido; el primero fue incubado a temperatura ambiente por 8 días. Transcurrido este tiempo se sembró en placas Petri, por estría y por extensión. En medio sólido 9K con agar-agar se observó crecimiento bacteriano después de 14 a 25 días, en el 50% de placas sembradas por extensión y el 10% por estría. Mientras que en el medio cultivo 9K con agarosa se observó crecimiento después de 7 a 8 días en el 80% y 60% de placas por extensión y estría, respectivamente. Los resultados de la observación microscópica mostraron presencia de bacterias con morfología bacilar, carácter acidófilo por su desarrollo en medios con pH 1.5 y metabolismo quimiolitiotrofo por su crecimiento y mantenimiento durante el tiempo del ensayo a expensas de compuestos inorgánicos presentes en el medio. En el medio sólido con crecimiento bacteriano después de 45 días de incubación se logró diferenciar 3 tipos de colonias que coinciden con el género de Acidithiobacillus . Además se obtuvieron indicios de las biotransformaciones realizadas por las bacterias lixiviadoras, oxidando el sulfato ferroso a sulfato férrico durante la determinación de bioxidación, lo cual se evidenció mediante el cambio de color de verde traslúcido a naranja brillante.The present investigation had as objective the isolation and determination of the species of the genus Acidithiobacillus and Leptospirillum present in the waste water of the mining units of Recuay - Huaraz. To this end, 3 samples of the effluent were collected and taken to the laboratory where they were submitted to enrichment in 9K and T & K liquid culture media, with a pH of 1.5 and a population count was done every 24 hours using the Newbauber chamber. The results showed that the best enrichment was carried out with the medium 9k in agitation 150 rpm, extra aeration and heat 40 ° C, as the bacterial growth curve occurred in ascending and sustained form, being at 432 hours where Observed the highest bacterial concentration, 9.33E + 06 cells / ml. On the other hand, liquid and solid 9K medium were used for the isolation of the culture; The first was incubated at room temperature for 8 days. After this time was planted in Petri plates, by stria and by extension. In solid 9K medium with agar-agar bacterial growth was observed after 14 to 25 days, in 50% of plates seeded by extension and 10% by streak. While in the 9K medium agarose culture growth was observed after 7 to 8 days in 80% and 60% plates by extension and stria, respectively. The results of the microscopic observation showed the presence of bacteria with bacillary morphology, acidophilic character due to their development in media with pH 1.5 and chemiolithotroph metabolism due to their growth and maintenance during the time of the test at the expense of inorganic compounds present in the medium. In solid medium with bacterial growth after 45 days of incubation it was possible to differentiate 3 types of colonies. In addition, indications were obtained of the biotransformations performed by the leaching bacteria, oxidizing the ferrous sulfate to ferric sulfate during the determination of biooxidation. Which was evidenced by the change of color from translucent green to bright orange.

Memoria para optar al título profesional de Bioquímico / En el presente trabajo se analizaron seis muestras de residuos mineros provenientes de tranques de relave de la minera Los Pelambres, con el objeto de estudiar el efecto de los microorganismos en los test de predicción de drenaje ácido de minas. El drenaje ácido que afecta una proporción importante de residuos mineros es uno de los principales problemas ambientales que debe enfrentar la actividad minera. Las bacterias ferro y thiooxidantes juegan un rol importante en la generación del drenaje ácido, por su efecto catalítico en la oxidación de los sulfuros. Este efecto es ampliamente reconocido en una etapa avanzada del proceso, a pH ácido, pero no existe consenso sobre su importancia en la etapa inicial cuando el pH todavía se mantiene por sobre 4,0. Los programas de predicción de drenaje ácido involucran generalmente pruebas estáticas y pruebas cinéticas que buscan simular las condiciones de meteorización de los materiales, pero que generalmente se realizan sin la participación efectiva de los microorganismos. El test confirmativo, con inoculación de microorganismos, busca determinar su efecto en la generación de drenaje ácido; sin embargo, esta prueba confirmativa considera un pH muy ácido (pH 2,8), que se aleja de las condiciones de una etapa de transición entre la oxidación química y biológica de los sulfuros. En el presente estudio se estudió el efecto de la inoculación de un cultivo de microorganismos a pH superior a 4,0. Los tests estáticos realizados permitieron una primera clasificación de las muestras de acuerdo a su potencial de generar ácido. Distintas clasificaciones fueron obtenidas a partir de los resultados de cada test, resultando en la clasificación dispar de las muestras. En cuanto al test confirmativo, de tres muestras descritas como potencialmente generadoras de drenaje ácido por el test realizado a pH 2,8, se llegó a sólo una muestra con este potencial al utilizar un pH inicial 4,5. Con el objeto de estimar las especies microbianas que se encontraban presentes en una muestra de relave (M2), se realizó un análisis mediante CARD-FISH a una mezcla de las soluciones provenientes del test confirmativo 3. Los resultados indicaron la presencia de Acidithiobacillus ferrooxidans y Acidithiobacillus thiooxidans en alta proporción, seguida de las otras especies; Leptospirillum y Sulfobacillus, lo que está de acuerdo con la literatura.Las diferencias entre las clasificaciones obtenidas a través de los test estáticos y confirmativos, corroboran que la actividad bacteriana a pH superior a 4,0, debiese ser considerada como complemento para una apropiada predicción del potencial de generación de drenaje ácido de minas. / In the present work, six samples of mining waste from Los Pelambres mining´s tailings were analysed with the purpose of studying the effect of microbial inoculation in the acid mine drainage prediction test. Acid drainage, which affects a significant proportion of mining waste, is one of the major environmental problems that the mining activity has to face. The ferrous and sulphur oxidizing bacteria play an important role in the acid drainage because of its catalytic effect on the oxidation of the sulphides. This process is widely recognized in its advanced stage, acid pH; however there is no consensus on its importance in the initial stage of the process, whenever the pH still remains over 4.0. Acid mine drainage prediction programs, generally involve static and kinetic tests, which seek to simulate weathering conditions of the materials but they are usually carried out without the effective participation of microorganisms. The confirmative test with inoculation of microorganisms, seeks to determine its effect on the generation of acid drainage. Nevertheless, the confirmative test takes into account a very acidic pH level (pH 2,8) which moves away from the conditions in a transitional stage, between the chemical and biological oxidation of sulphides. In the present work, we observed the inoculation effect at a pH above 4.0. Static tests that were previously performed, allowed a first classification of samples in relation to their acid generation potential. Moreover, different classifications were obtained from the results of each test, with dissimilar conclusions. In relation to the confirmative test, of three samples initially described as potentially acid forming by the test at pH 2.8, only one sample had the potential to generate acid when the test was carried out at a higher pH 4.5. With the purpose of estimation of the microbial species that were present in a tailing sample (M2), a CARD-FISH analysis was performed to a mix of solutions coming from the confirmative test. The results showed the presence of Acidithiobacillus ferroxidans, Acidithiobacillus thiooxidans and Leptospirillum ferrooxidans at a similar proportion, followed by Sulfobacillsu sp, which is according to the consulted literature. The classification differences obtained through the static and confirmative tests, corroborates the idea that bacterial activity at pH higher than 4.0, should be considered as a complement to an appropriate classification of the samples regarding to acid rock drainage generation.

Ingeniero en Biotecnología Molecular. / La chaperona bacteriana periplasmática CusF es parte del sistema de resistencia a cobre CusCFBA. CusF une cobre (I) en el periplasma bacteriano mediante una histidina y dos metioninas muy conservadas en las bacterias. En Acidithiobacillus ferrooxidans, la histidina del sitio de unión a cobre de CusFAf se encuentra sustituída por metionina. Se ha determinado que a pesar que la afinidad de la histidina por cobre es mayor que la de la metionina a pH neutro, esta última presenta una mayor afinidad por cobre a pH ácido. Siendo A. ferrooxidans una bacteria que vive en ambientes ácidos, esta sustitución podría estar relacionada con la adaptación al periplasma ácido de la bacteria. Se analizó bioinformáticamente el sitio de unión a cobre de CusF para determinar las especies en las que se encuentra esta sustitución. Se encontró que sólo el género Acidithiobacillus presenta esta sustitución. Adicionalmente se midió la unión de cobre a la CusF de A. ferrooxidans y el efecto que tiene esta sustitución. Para ello se clonó el gen cusF3Af en E. coli y se realizó una mutación sitio dirigida de su metionina 66 cambiándola por histidina. Luego de expresar y purificar ambas proteínas (silvestre y mutada) se midió in vitro su capacidad de unir cobre tanto a pH ácido como neutro. A pH 7, la CusF3 de A. ferrooxidans presentó unión a cobre con un valor experimental de 0.7 átomos de cobre por proteína mientras que la mutante M66H unió 0.3 átomos de cobre por proteína (la misma cantidad de cobre que el control). A pH ácido no fue posible medir la unión de cobre con el método utilizado. Se concluye que la sustitución de histidina por metionina en la CusF3Af es exclusiva del género Acidithiobacillus y que esta chaperona tiene capacidad de unir cobre a pH neutro. / The periplasmatic metallochaperone CusF is part of the CusCFBA copper resistance system. CusF binds Cu(I) through a conserved site consisting of 1 histidine and 2 methionines. In Acidithiobacillus ferrooxidans, this histidine present in the position 66 of CusFAf is found substitued by a methionine. It has been determined that while the affinity of copper for histidine is higher than that for methionine at neutral pH, the latter has higher affinity for the metal at low pH. Since A. ferrooxidans lives in acidic environments, it is proposed that this subsitution could be an adaptation to the acid periplasm of this bacterium. The copper binding site of CusF was analyzed bioinformatically to determine the species in which this subsitution is found. This substitution was only present in the CusF of species from the genus Acidithiobacillus. Additionally, copper binding capacity of the A. ferrooxidans CusF was measured, and the effect of this substitution was investigated. To fulfill that purpose, the cusF3Af gene was cloned into E. coli and a site directed mutation was performed to replace methionine 66 with histidine. Both wild type and mutated proteins were expressed and purified to measure in vitro their copper binding capacity at both neutral and acid pH. A copper binding capacity of 0,7 copper atoms per protein was found for the wild type CusF3Af, while the M66H mutant was able to bind 0,3 copper atoms per protein (the same amount of copper present in the negative control). It was not possible to perform this measurement under acidic conditions. It was concluded that the subsitution of histidine for methionine in CusF3Af is exclusive of the Acidithiobacillus genus, and that this copper chaperone has the capacity to bind copper at neutral pH. / Enero 2018

Memoria para optar el título de Bioquímico / Acidiothiobacillus ferrooxidans es una bacteria quimiolitoautotrófica acidófila, que obtiene su energía a partir de la oxidación del ion ferroso, azufre elemental y otros compuestos de azufre reducidos. La habilidad de este microorganismo para solubilizar los sulfuros metálicos es aprovechada en operaciones de biominería. Se ha propuesto al tiosulfato como el intermediario principal en la oxidación de los sulfuros metálicos. En el ciclo biológico de este compuesto están involucrados diversos tipos de enzima, tales como la tiosulfato deshidrogenasa, tiosulfato reductasas y las rodanasas (tiosulfato azufretransferasas). Estas últimas son una familia de enzimas ampliamente distribuidas que catalizan la transferencia de un átomo de azufre sulfano desde el tiosulfato al cianuro como aceptor. La actividad rodanasa ha sido descrita en A. ferrooxidans, lo que sugiere la existencia de una o varias proteínas pertenecientes a esta familia. Mediante análisis bioinformáticos se encontraron ocho secuencias nucleotídicas que contenían un dominio rodanasa simple en el genoma de Acidiothiobacillus ferrooxidans ATCC 23270: p11, p14, p14.3, p15, p16, p16.2, p21, y p28. De estos ocho genes, se aislaron seis desde el ADN total de A.ferrooxidans, se clonaron y sobreexpresaron en Escherichia coli. Posteriormente se determinó que las proteínas P15 y P16.2 presentaban claramente actividad rodanasa, medida en extractos crudos de E. coli recombinantes. De estas dos rodanasas, se purificó la proteína P15 a través de cromatografía de afinidad en columnas de níquel-NTA. Una vez purificada esta proteína se procedió a caracterizarla preliminarmente, midiéndo el pH óptimo, la Km y la Vmax para dos de sus sustratos, tiosulfato y cianuro. Los resultados obtenidos en esta tesis ayudarán a entender el posible papel de las rodanasas en el metabolismo u oxidación de los compuestos azufrados, lo que puede ser importante para el funcionamiento óptimo de las operaciones de biominería.

Doctora en bioquímica / El Quorum Sensing (QS) es un sistema de comunicación bacteriana capaz de regular varios procesos celulares dependientes de la densidad de la población microbiana. En bacterias Gram-negativas esto ocurre mediante la producción, por parte de las bacterias, de moléculas señal autoinductoras (AI) de tipo acil homoserina lactonas (AHLs). La liberación de AHLs hacia el exterior de la célula provoca un aumento de su concentración, lo que es detectado por la población bacteriana generando como respuesta una regulación de la expresión de ciertos genes (regulón QS). Nuestro laboratorio ha estudiado e identificado un sistema QS funcional en la cepa ATCC 23270T de Acidithiobacillus (At.) ferrooxidans. Este sistema QS está compuesto principalmente por dos elementos: AfeI, una proteína AHL sintasa codificada por el gen afeI y AfeR, un regulador transcripcional de la familia LuxR codificado por el gen afeR. Además, mediante el uso de análogos sintéticos de AHLs revelamos que las moléculas de QS de tipo AHLs (OH-C14-AHL, OH-C12-AHL y tetrazol) modulan la adherencia a mineral, como pirita y cupones de azufre, de At. ferrooxidansT. En esta investigación nos planteamos identificar los genes que son regulados por QS en At. ferrooxidansT, y en particular definir aquellos que están relacionados con la formación de biopelículas. Nuestra hipótesis postula que los análogos sintéticos de AHL inducen el sistema QS. Así, nosotros proponemos modular la adherencia sobre el sustrato mineral de At. ferrooxidansT a través del uso de estas moléculas. La utilización de ellas permitirá caracterizar el regulón QS en esta cepa bacteriana mediante análisis transcriptómicos. La identificación de análogos sintéticos de AHLs que favorecen la adherencia a cupones de azufre de At. ferrooxidansT nos permitió estudiar el transcriptoma de este microorganismo en condiciones donde el regulón QS se encuentra estimulado. El análisis del transcriptoma de At. ferrooxidansT mediante la técnica de microarreglos de ADN en presencia o ausencia de un análogo sintético de AHLs nos permitió identificar el regulón QS y determinar aquellos genes relacionados con la formación de biopelículas. Este es el primer estudio de la expresión global de los genes de At. ferrooxidansT utilizando análogos sintéticos de AHLs como activadores del sistema QS. Esto permitió generar valiosa información respecto de la respuesta de estos microorganismos a estas señales de comunicación. Por consiguiente, la presente tesis respecto al estudio y caracterización del regulón QS, y en particular aquellos genes relacionados con la formación de biopelículas es el inicio de una serie de líneas de investigación, las cuales podrían ayudar a contribuir en la comprensión de cuáles y cómo son las condiciones fisiológicas de este microorganismo que favorecen el proceso de biolixiviación / Quorum sensing (QS) is a bacterial communication system capable of controlling several cellular processes dependent on the density of the microbial population. In Gramnegative bacteria, it occurs mainly through the production by bacteria of small diffusible signaling molecules, termed autoinducers (AI), of the acyl homoserine lactones type (AHLs). The release of AHLs outside the cell causes an increase in their concentration, which is detected by the bacterial population generating the regulation of the expression of several genes (regulon QS). Our laboratory has studied and identified a functional QS system in the Acidithiobacillus (At.) ferrooxidans ATCC 23270T type strain. The QS system is mainly composed of two elements: AfeI, an AHL synthase encoded by the afeI gene and AfeR, a transcriptional regulator of the LuxR family encoded by the afeR gene. Besides, by using synthetic analogs of AHLs (OH-C14-AHL, OH-C12-AHL and tetrazol), we have shown that AHL-type QS molecule analogs modulate adhesion of At. ferrooxidansT to minerals, such as pyrite, and sulfur coupons. In this research, we propose to identify the genes that are regulated by QS in At..ferrooxidansT, particularly those that are associated with biofilm formation. For this, we propose to modulate the adhesion of At. ferrooxidansT to mineral substrate through the use of a synthetic AHL analog. Our working hypothesis postulates that AHLs molecules induce the QS system, and that their use will allow the characterization of the QS regulon of this bacterial strain by transcriptomic analysis. The identification of synthetic AHLs improving adherence of At. ferrooxidansT on sulfur coupons allowed us to study the transcriptome of this organism in conditions in which QS regulon is stimulated. Transcriptome analysis of At. ferrooxidansT by the technique of DNA microarrays in the presence or absence of one of these AHLs synthetic analogues allowed us to identify the QS regulon and to determine genes involved in biofilm formation. This is the first study of global gene expression of At. ferrooxidansT using AHLs synthetic analogues as activators of the QS system. This allowed us to obtain valuable informations regarding the response of this organism to this communication signal. Therefore, this thesis on the study and characterization of the QS regulon, in particular those genes related to biofilm formation, is the beginning of a series of research lines, which could help to understand the At. ferrooxidans physiological conditions that improve bioleaching processes / Conicyt

Memoria para optar al título profesional de Bioquímico / El sostenido progreso de la tecnología computacional y el acelerado aumento del volumen de datos de interés científico en línea, han permitido el posicionamiento de la bioinformática como una disciplina de gran utilidad para las ciencias de la vida. En la presente memoria de título, se utilizaron herramientas bioinformáticas para dilucidar la relación existente entre diversas proteínas con un rasgo en común: su parecido a la rusticianina, una proteína indispensable para el proceso vital de oxidación de hierro de la bacteria Acidithiobacillus ferrooxidans. Su secuencia de aminoácidos y pliegues estructurales fueron sometidos a análisis filogenético. Se dio especial atención a los aminoácidos críticos y estructura proteica rodeando su sitio de unión a cobre. Los resultados sugieren un enlace evolutivo entre la rusticianina y otras proteínas coordinadoras de cobre involucradas en variados procesos, pero desarrollando básicamente la misma función, transportar electrones. Finalmente, usando la subunidad II de citocromo c oxidasa de Thermus thermophilus como modelo, se muestra que esta familia de proteínas exhibe características ancestrales compartidas con rusticianina, que sugieren cómo las proteínas evolucionaron a partir de sus funciones en un metabolismo anaeróbico a las de metabolismo aeróbico cuando los niveles de oxígeno aumentaron hace alrededor de 2.400 millones de años. / The continuing progress of computer technology and the rapid increase in the volume of online data of scientific interest have allowed the positioning of bioinformatics as a discipline of great use to the life sciences. In this thesis, various bioinformatics tools were used for the analysis of rusticyanin, an essential protein for the vital process of oxidation of iron, from the bacterium Acidithiobacillus ferrooxidans. Rusticyanin belongs to the family of blue copper proteins. Its amino acid sequence and structural folds were subjected to phylogenetic analysis. Special attention was given to critical amino acids and protein structure surrounding its copper binding site. The results suggest an evolutionary link between rusticyanin and other copper-containing proteins involved in various processes but basically fulfilling the same function, namely electron transport. Finally, using the cytochrome c oxidase of Thermus thermophilus as a model, it is shown that this family of proteins exhibits ancestral characteristics shared with rusticyanin that suggest how proteins could evolve from functions in anaerobic metabolism to those of aerobic metabolism as atmospheric oxygen levels rose about 2.4 billion years ago. / Fondecyt

Seminario de Título entregado a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al Título de Ingeniero en Biotecnología Molecular. / Acidithiobacillus ferrooxidans es una bacteria quimiolitoautótrofa, acidófila, involucrada en un consorcio bacteriano capaz de biolixiviar metales como el cobre. Este microorganismo posee la capacidad de vivir en ambientes con altas concentraciones de metales. Por ello que esta bacteria es importante en procesos industriales de biolixiviación y por ende, su estudio resulta de utilidad en relación con esta biotecnología. Uno de los componentes más abundantes e importantes de la membrana externa de las bacterias Gram-negativas como A. ferrooxidans es el lipopolisacárido (LPS). Esta molécula consta de una parte integral hidrofóbica conocida como lípido A, y una parte hidrofílica dividida en dos, el “core” y el antígeno O. La síntesis de las distintas partes del LPS es catalizada por varias proteínas. Dentro de éstas, se encuentra la proteína RfaE, involucrada en la síntesis del “core” del LPS, la enzima Wzy, que polimeriza al antígeno O y la proteína Wzz, que determina el largo de cadena del antígeno O. Al ser la molécula más expuesta de la bacteria, el LPS está en contacto directo con el medio donde vive el microorganismo. Por lo tanto, interactúa directamente con eventuales metales presentes en el ambiente como el cobre, el oro, etc. Diversos estudios han revelado que modificaciones del LPS pueden afectar la adherencia de las bacterias a distintas superficies e incluso afectar la viabilidad de la célula. En base a estos antecedentes, para analizar si el LPS modifica su estructura y/o cantidad, se midieron mediante qRT-PCR los cambios transcripcionales de los genes wzy, wzz y rfaE de las cepas ATCC 23270 y ATCC 53993 de A. ferrooxidans, que codifican para las proteínas nombradas previamente, cuando la bacteria creció a distintas concentraciones de cobre. También se cuantificó y analizó la estructura del LPS de A. ferrooxidans. 2 Los resultados mostraron que la presencia de cobre provoca cambios transcripcionales significativos para los tres genes analizados en la cepa ATCC 23270 y sólo para el gen wzz en la cepa ATCC 53993. Tanto la estructura del LPS analizado, como el número de unidades repetidas del antígeno O, no presentaron cambios significativos en ambas cepas. La cantidad de LPS presente en la cepa ATCC 23270 es menor que en la cepa ATCC 53993, sin embargo, se observó un aumento parcial del LPS en la cepa ATCC 23270 cuando la bacteria crece a mayores concentraciones de cobre, mientras que la cepa ATCC 53993 no presentó cambios significativos en esta condición, sugiriendo que la cepa ATCC 23270 utilizaría el LPS como una forma de resistencia contra el cobre y que la cepa ATCC 53993 no aumentaría su cantidad de LPS, ya que de manera basal posee mayores cantidades de esta molécula. Estos resultados son una primera aproximación al posible rol que tendría el LPS en esta bacteria acidófila en la interacción con metales. / Acidithiobacillus ferrooxidans is a chemolithoautotrophic and acidophilic bacterium, involved in the microbial consortium capable of bioleaching metals such as copper. This microorganism has the ability to live at very high metal concentrations and therefore, plays a pivotal rol in bioleaching of minerals. One of the most abundant and important components of the outer membrane of Gram-negative bacteria such as A. ferrooxidans is the lipopolysaccharide (LPS). This molecule consists of an integral hydrophobic part known as lipid A, and a hydrophilic portion divided in to the “core” and the O-polysaccharide or O-antigen. The synthesis of the different parts of LPS is catalyzed by several proteins. Among these, RfaE protein is involved in the “core” synthesis of LPS. Wzy enzyme polymerizes the O antigen and Wzz protein is the O antigen chain lenght determinant. Being the most exposed molecule of the bacterium, LPS is in direct contact with the environment. Therefore, it can directly interact with the metals present in the environment. Some reports indicate that modifications of LPS can affect the attachment of bacteria to different surfaces and even their viability. Based on this background, to analyze whether the LPS structure and/or its quantity are modified in the presence of copper, transcriptional changes of wzy, wzz and rfaE genes from A. ferrooxidans ATCC 23270 and ATCC 53993, were measured in bacteria grown at different copper concentrations. The levels of LPS present in both strains of A. ferrooxidans were also quantified and their structure analyzed by electrophoresis in poliacrilamide gels. 4 The results showed significant transcriptional changes for the three genes analyzed in strain ATCC 23270 and only for the wzz gene in strain ATCC 53993. The LPS structure was analyzed by determining the number of repeated units of O antigen. No significant changes in the electrophoretic banding patterns were seen in both strains. The amounts of LPS present in strain ATCC 23270 was lower than that of strain ATCC 53993. However, the amounts of LPS were partially increased when strain ATCC 23270 was grown in high copper concentrations. On the contrary, strain ATCC 53993 did not show significant changes in the presence of the metal, suggesting that strain ATCC 23270 would use LPS as a way of copper resistance. Strain ATCC 53993 on the other hand, already has a higher basal amount of LPS. These preliminary results are a first approximation to study the posible role of LPS in its interaction with metals in this acidophilic bacteria.

Submitted by Laíze Fernanda Pereira null (laize_fernandapereira@yahoo.com.br) on 2016-10-03T11:51:03Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Laize Fernanda Pereira_versão final.pdf: 1765685 bytes, checksum: c480da42091df39cbc80f15e56710bec (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-10-05T17:05:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 pereira_lf_me_araiq.pdf: 1765685 bytes, checksum: c480da42091df39cbc80f15e56710bec (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-05T17:05:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 pereira_lf_me_araiq.pdf: 1765685 bytes, checksum: c480da42091df39cbc80f15e56710bec (MD5) Previous issue date: 2016-09-22 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O carvão é a mais importante fonte de energia não renovável de origem fóssil do planeta. Um dos maiores problemas em sua utilização como fonte energética se deve à presença de enxofre na forma orgânica e inorgânica (pirita FeS2). Durante a combustão do carvão, são lançados na atmosfera vários gases, entre eles o SO2 que causam problemas ambientais como a formação de chuva ácida além da corrosão de “boilers”, oleodutos subterrâneos, instalações metálicas e maquinários de minas. Há vários processos físicos e químicos para redução do enxofre antes da combustão do carvão, no entanto, tais métodos são dispendiosos, pois necessitam de condições extremas de temperatura e pressão. Os métodos biológicos de dessulfurização deste combustível fóssil têm demonstrado serem mais eficazes para tal fim. Neste contexto o presente trabalho utilizou bactérias oxidantes de ferro e/ou enxofre, Acidithiobacillus ferrooxidans e Acidithiobacillus thiooxidans a fim de obter uma redução no conteúdo de enxofre pirítico do carvão fornecido pela Carbonífera do Cambuí. Ensaios de biolixiviação em frascos sob agitação foram conduzidos em diferentes condições com a finalidade de acompanhar a cinética de dissolução do enxofre pirítico na amostra mineral. Na fase líquida a evolução dos seguintes parâmetros foi monitorada: pH, Eh e íons ferrosos. A fase sólida foi caracterizada posteriormente através de medidas de difração de raio-X (DRX) e espectroscopia de infravermelho (FTIR). A quantificação parcial do enxofre total foi avaliada utilizando Analisador Preiser Mineco de acordo com as normas ABNT NBR 8295 e suas formas (pirítica, sulfática e orgânica) foram analisadas por normas ASTM. Os ensaios utilizando tais microrganismos obtiveram redução de 44% no teor de enxofre total e de 90% no teor de enxofre pirítico. Como resultado das análises de raio-X observou-se a redução de picos característicos da pirita e o surgimento de uma nova fase cristalina durante o tratamento biológico. Os espectros de infravermelho indicaram que os microrganismos utilizados neste estudo foram capazes de interagir apenas com a fase inorgânica do carvão. Estes ensaios de bancada forneceram parâmetros para um posterior trabalho em escala de bancada utilizando colunas de biolixiviação. / Coal is the most important non-renewable energy source of fossil origin in the world. One of the major problem in using coal as an energy source is the presence of sulfur in the organic and inorganic form (pyritic FeS2). During combustion of coal, SO2 is released in the atmosphere, causing many environmental problems such as the formation of acid rain, beside this sulfur also causes the corrosion of boilers and installations of underground metal pipelines. There are several physical and chemical processes to reduce sulfur in the coal before combustion, however, such methods are very costly, with the use of extreme temperatures and pressures. The biological method for desulfurization of the fossil fuel has proved to be more effective for such purpose. In this context, the present work evaluated the use iron and/or sulfur oxidizing bacteria, Acidithiobacillus ferrooxidans and Acidithiobacillus thiooxidans in order to obtain a maximum reduction in the pyritic sulfur content of the coal supplied by the Carbonífera Cambuí. For this purpose, the bioleaching tests were performed in shake flasks and conducted under different conditions in order to follow the pyritic sulfur kinetics of dissolution of the mineral sample. In the liquid phase, the following parameters such as pH, Eh and ferrous ions were monitored. The solid phase was characterized subsequently by means of measurements of X-ray diffraction (XRD) and infrared spectroscopy (FTIR). The partial quantification of total sulfur was evaluated using Preiser Mineco analyzer according to ABNT NBR 8295 standards and other forms such as pyritic, sulfatic and organic were analyzed by ASTM. The tests using such microorganisms obtained 44% reduction in total sulfur and 90% pyritic sulfur. The result of ray-X analyzes showed the reduction of characteristic peaks of pyrite and the emergence of a new crystalline phase during biological treatment. Infrared spectra indicated that the microorganisms used in this study were able to interact only with the inorganic phase coal. These bench tests provided parameters for further laboratory scale using bioleaching column.