As actinobactérias endofíticas estão presentes nos tecidos das plantas e, por meio da produção de metabólitos ativos, às protegem e auxiliam em condições de estresse. Esses microrganismos tem sido amplamente estudados no controle de doenças fitopatogênicas, como a mancha marrom causada por Bipolaris sorokiniana. Este fungo é o agente causal da podridão comum da raiz, manchas foliares, morte de plântulas e ponto preto das sementes de trigo e cevada, causando redução significativa na produtividade. Neste contexto, os objetivos do presente estudo foram avaliar a virulência de isolados de B. sorokiniana e a atividade antifúngica de actinobactérias contra este fitopatógeno. Os antagonistas com elevada atividade contra o fitopatógeno foram caracterizados quanto à produção enzimática, fisiologia, condições de crescimento e produção de metabólitos, bem como sequenciamento do 16S rRNA para identificação dos antagonistas. A caracterização parcial dos metabólitos foi realizada por meio de sistemas de Cromatografia de Camada delgada (CCD) contendo diferentes solventes. Os resultados mostraram que os isolados de B. sorokiniana apresentaram elevada virulência às plântulas e sementes de trigo, sendo que a maior agressividade foi relatada à semente. Por outro lado, 69,6% das actinobactérias apresentaram elevada atividade antifúngica contra isolados de B. sorokiniana em meio sólido, e 17% a mantiveram em cultura submersa. A maior produção ocorreu a 30°C após 72h de incubação, para a maioria dos isolados. A detecção da produção de catalase, amilase, pectinase, lipase e esterase foi observada para a maioria das actinobactérias (100, 95,6, 91,30, 95,6, 100%, respectivamente). Enquanto que a degradação de caseína, carboximetilcelulose e gelatina foi realizada por 60,8, 34,78 e 47,82% dos isolados, respectivamente. Os isolados 6(2), 6(4), 16(3) e R18(6), selecionados devido à elevada atividade antifúngica e enzimática, apresentaram reação positiva para produção de compostos voláteis, quitinase e glucanase, sideróforos, fixação de nitrogêno, AIA e colonização de raizes. Somente isolado R18(6) não apresentou capacidade de solubilizar fosfatos. A caracterização molecular determinou que estes isolados pertencem ao gênero Streptomyces. Os metabólitos produzidos pelo isolado R18(6) foram mais estáveis a mudanças de temperatura e pH, bem como para a ação das proteases e EDTA, quando comparado aos demais. Os solventes acetato de etila e hexano foram mais eficientes na extração de metabólitos do extrato bruto, porém a melhor separação de metabólitos em CCD foi obtida com misturas de solventes. / Endophitic actinobacterias are present in plant tissues and by means of active metabolites they protect and help them in stress conditions. These microorganisms have been widely used in the control of phytopathogenic diseases, such as the spot blotch caused by Bipolaris sorokiniana. This fungus is a causal agent of common root rot, leaf spots, death of seedlings and black point of the seeds of wheat and barley, causing significant reduction in productivity. In this context, the aim of this study was to evaluate the virulence of the B. sorokiniana isolates and the antifungal activity of actinobacterias against this phytopathogen. The antagonists with the higher activity against the phytopatogen were characterize taking in consideration their physiology, enzyme production, growth conditions and metabolites production and 16S rRNA sequencing for identification of the antagonists. Partial characterization (nós não purificamos) of the metabolites was performed using thin layer chromatography (TLC) systems containing different solvents. The results showed that the isolates of B. sorokiniana have a high virulence on wheat seed and seedlings, however the greater aggressiveness was observed to seed. On the other hand, 69.6% of actinomycetes showed high antifungal activity against of B. sorokiniana isolates on solid medium, and 17% maintained this behavior in submerged culture. The highest yield happened, for most isolates, when grown at 30°C with agitation after 72h of incubation. The detection of catalase, starch, pectin, lipase and esterase production was observed for most of the actinomycetes (100, 95.6, 91.30, 95.6, 100%, respectively). While the hydrolysis of casein, carboxymethylcellulase and gelatin was performed by 60.8, 34.78 and 47.82% of the isolates, respectively. Isolates 6(2), 6(4), 16(3) e R18(6), selected due to the high antifungal and enzyme activity, showed a positive reaction for the production of volatile compounds, chitinase and glucanase, siderophores, nitrogen fixation, AIA and colonization of the roots. Only the isolated R18(6) showed no ability to solubilize phosphates. Molecular characterization of the isolates determined that they belong to the genus Streptomyces. The metabolites produced by isolate R18 (6) were more stable to temperature and pH changes, as well to the action of proteases and EDTA, when compared to the others. The solvents ethyl acetate and hexane were more efficient for the extraction of the metabolites from the crude extract, however a better separation of the metabolites in the TLC was obtained with mixture of solvents.

No / Bacterial lipoproteins are a diverse and functionally important group of proteins that are amenable to bioinformatic analyses because of their unique signal peptide features. Here we have used a dataset of sequences of experimentally verified lipoproteins of Gram-positive bacteria to refine our previously described lipoprotein recognition pattern (G+LPP). Sequenced bacterial genomes can be screened for putative lipoproteins using the G+LPP pattern. The sequences identified can then be validated using online tools for lipoprotein sequence identification. We have used our protein sequence datasets to evaluate six online tools for efficacy of lipoprotein sequence identification. Our analyses demonstrate that LipoP (http://www.cbs.dtu.dk/services/LipoP/) performs best individually but that a consensus approach, incorporating outputs from predictors of general signal peptide properties, is most informative.

<p> The higher taxonomic groups within Prokaryotes are presently distinguished mainly on the basis of their branching in phylogenetic trees. In most cases, no molecular, biochemical or physiological characteristics are known that are uniquely shared by species from these groups. Comparative genomic analyses are leading to discovery of molecular characteristics that are specific for different groups of Bacteria and Archaea. These markers include conserved inserts and deletions in universal proteins and lineagespecific proteins, which provide novel means for identifying and circumscribing these groups of prokaryotes in clear molecular terms and for understanding their evolution. Because of their taxa specificities, further studies on these newly discovered molecular characteristics should lead to discovery of novel biochemical and physiological characteristics that are unique to different groups of microbes. The focus of my project was phylogenomic studies for two large prokaryotic group: Actinobacteria and Archaea. My goals were to a) identify molecular markers that are specific to Actinobacteria and Archaea at different taxonomic levels, which will help to understand the phylogenetic relationship within these two major groups; b) understand the functional significance of Actinobacteria-specific proteins. By comparative genomics approach, a number of conserved indels in various proteins (viz. Coxl, GluRS, CTPsyn, Gft, GlyRS, TrmD, Gyrase A, SahH and SHMT) have been identified that are specific for all Actinobacteria and additional indels were found to be unique to its major subgroups, such as Corynebacterineae, Bifidobacteriaceae, etc. In parallel, a large number of proteins were discovered to be restricted to Actinobacteria at different phylogenetic depths. These identified conserved indels and proteins for the first time provide useful markers for defining and circumscribing the Actinobacteria phylum or its subgroups in clear molecular terms. Similar comparative genomic studies have been carried out on Archaea and a vast number of proteins have been identified that are unique to Archaea or its various lineages. Lastly, I have performed functional studies on one of the Actinobacteria-specific proteins (ASPl). The structure of ASPl was determined and structural comparison indicates that the function of this protein might be novel since it does not match any known protein with or without known function. </p> / Thesis / Doctor of Philosophy (PhD)

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O filo Actinobacteria é, atualmente, considerado um dos maiores filos pertencentes ao domínio Bacteria. Este filo pode representar até 30% da comunidade microbiana do solo. Os organismos do filo Actinobacteria tem sido caracterizados como produtores de antibiótico e degradadores de substâncias complexas como os alcanos, presente em diversas substâncias encontradas em plantas. Em relação à degradação dos alcanos já tem sido comprovado que o gene alkB (alcano hidroxilase), presente no filo Actinobacteria, está relacionado a sua degradação. Porém, as comunidades de tais organismos podem ser alteradas por mudanças no uso do solo, que no Brasil ocorrem extensivamente devido a implantação de monoculturas. A cultura de cana-de-açúcar, que vem se expandido anualmente, se mostra como uma das culturas que podem alterar a microbiota do solo. Os diferentes sistemas de colheita de cana-de-açúcar, com e sem a queima da palhada, podem alterar a microbiota do solo. Assim, considerando o papel do filo Actinobacteria na ciclagem de matéria orgânica, além da sua importância biotecnológica, este trabalho avaliou como os diferentes sistemas de colheita da cana-de-açúcar influenciam as comunidades rizosféricas de Actinobacteria e de bactérias oxidadoras de alcano, sob condições controladas em casa de vegetação, utilizando técnicas moleculares para quantificar (qPCR), análisar a estrutura (T-RFLP) e a diversidade da comunidade (sequenciamento de metagenoma). Para isso o solos coletado de áreas de plantação de cana-de-açúcar com os manejos de colheita com e sem queima da palhada, foram utilizados em experimento de mesocosmos composto por vasos com planta, de onde foi coletado solo rizosférico, e vaso sem planta, de onde foi coletado solo controle. A quantificação dos gene 16S rRNA de Actinobacteria e do gene alkB não mostraram diferenças estatística nas comparações dos solos controles de cana-de-açúcar com e sem queima, e na comparação entre os solos rizosférico e controle de cada tipo de manejo de colheita. A análise dos Fragmentos Terminais de Restrição (TRFs) dos solos controle dos diferentes sistemas de colheita, mostraram uma separação da comunidade bacteriana presente no solo, o mesmo ocorreu nas comparações entre os solos rizosférico e controle de diferentes manejos de colheita. Porém, quando se observa a estrutura taxonômica da comunidade bacteriana nota-se que os filos Proteobacteria, Actinobacteria, Firmicutes e Acidobacteria são predominantes nos diferentes solos amostrados, as diferenças estatísticas entre os solos controle e rizosférico de cada tratamento se apresentam a partir da análises das famílias bacterianas presentes nos solos. Para o gene alkB, as sequências encontratas nos diferentes solos pertencem aos dois filos mais abundantes nos solos, os filo Proteobacteria e Actinobacteria, porém algumas sequências pertencem a bacterias não identificadas. Assim, conclui-se que as mudanças na estrutura da comunidade bacteriana presente em solo com monocultura da cana-de-açúcar são perceptíveis a partr da análises de grupos filogenéticos mais baixo e que a comunidade de bactéria degradadoras de alcanos são pertencentes, principalmente, os filos Actinobacteria e Proteobacteria, porém ainda é necessário mais estudos para a classificação das bactérias não identificadas / The phylum Actinobacteria is currently considered one of the major phyla belonging to the domain Bacteria. This phylum can represent up to 30% of the soil microbial community. The organisms of the phylum Actinobacteria has been characterized as antibiotic producers and degraders of complex substances such as alkanes, present in several substances found in plants. Regarding the degradation of alkanes it has already been proven that alkB gene (alkane hydroxylase), present in the phylum Actinobacteria, is related to its degradation. But the communities of such organisms can be altered by changes in land use, which in Brazil occur extensively due to implementation of monocultures. The cultivation of sugarcane, which has been expanded annually, appears as one of the crops that can alter the soil microbiota. The different sugarcane harvest systems, with and without straw burning, can alter the soil microbiota.Thus, considering the role of the phylum Actinobacteria in the cycling of organic matter, in addition to their biotechnological importance, this study evaluated how different harvest systems of sugarcane influence rhizospheric communities of Actinobacteria and alkane-oxidizing bacteria under controlled conditions in a greenhouse, using molecular techniques to quantify (qPCR), analyse the structure (T-RFLP) and diversity of the community (metagenomic sequencing). For this, the soil collected from sugarcane fields with harvest managements with and without burning the straw, was used in a mesocosms experiment composed of pots with a sugarcane plant, from where rhizosphere soil was collected, and without plant, from where control soil was collected. The quantification of Actinobacteria 16S rRNA gene and alkB gene showed no statistical differences in the comparison of sugarcane controls soil with and without burning, and in the comparison between rhizosphere and control soil of each type of crop management. Terminal Restriction Fragments (TRF) analysis of control soils of different harvesting systems showed a separation of the bacterial community present in the soil, the same occurred in the comparison between rhizosphere and control soils of different harvesting systems. However, when observing the taxonomic structure of the bacterial community it is noted that that the phyla Proteobacteria, Actinobacteria, Firmicutes and Acidobacteria are predominant in different sampled soils, the statistical differences between the control and rhizosphere soil of each treatment are presented from the analysis of bacterial families present in the soil. For alkB gene, the sequences found in different soils belong to the two most abundant phyla in the soil, the phylum Proteobacteria and Actinobacteria, but some sequences belong to unidentified bacteria.Thus, it is concluded that the changes in the structure of the bacterial community present in soil with monoculture of sugarcane are apparent from the analysis of lower phylogenetic groups and the alkane-degrading bacterial communities belong mainly to the phyla Actinobacteria and Proteobacteria, however it is still needed further studies for the classification of unidentified bacteria

O filo Actinobacteria é, atualmente, considerado um dos maiores filos pertencentes ao domínio Bacteria. Este filo pode representar até 30% da comunidade microbiana do solo. Os organismos do filo Actinobacteria tem sido caracterizados como produtores de antibiótico e degradadores de substâncias complexas como os alcanos, presente em diversas substâncias encontradas em plantas. Em relação à degradação dos alcanos já tem sido comprovado que o gene alkB (alcano hidroxilase), presente no filo Actinobacteria, está relacionado a sua degradação. Porém, as comunidades de tais organismos podem ser alteradas por mudanças no uso do solo, que no Brasil ocorrem extensivamente devido a implantação de monoculturas. A cultura de cana-de-açúcar, que vem se expandido anualmente, se mostra como uma das culturas que podem alterar a microbiota do solo. Os diferentes sistemas de colheita de cana-de-açúcar, com e sem a queima da palhada, podem alterar a microbiota do solo. Assim, considerando o papel do filo Actinobacteria na ciclagem de matéria orgânica, além da sua importância biotecnológica, este trabalho avaliou como os diferentes sistemas de colheita da cana-de-açúcar influenciam as comunidades rizosféricas de Actinobacteria e de bactérias oxidadoras de alcano, sob condições controladas em casa de vegetação, utilizando técnicas moleculares para quantificar (qPCR), análisar a estrutura (T-RFLP) e a diversidade da comunidade (sequenciamento de metagenoma). Para isso o solos coletado de áreas de plantação de cana-de-açúcar com os manejos de colheita com e sem queima da palhada, foram utilizados em experimento de mesocosmos composto por vasos com planta, de onde foi coletado solo rizosférico, e vaso sem planta, de onde foi coletado solo controle. A quantificação dos gene 16S rRNA de Actinobacteria e do gene alkB não mostraram diferenças estatística nas comparações dos solos controles de cana-de-açúcar com e sem queima, e na comparação entre os solos rizosférico e controle de cada tipo de manejo de colheita. A análise dos Fragmentos Terminais de Restrição (TRFs) dos solos controle dos diferentes sistemas de colheita, mostraram uma separação da comunidade bacteriana presente no solo, o mesmo ocorreu nas comparações entre os solos rizosférico e controle de diferentes manejos de colheita. Porém, quando se observa a estrutura taxonômica da comunidade bacteriana nota-se que os filos Proteobacteria, Actinobacteria, Firmicutes e Acidobacteria são predominantes nos diferentes solos amostrados, as diferenças estatísticas entre os solos controle e rizosférico de cada tratamento se apresentam a partir da análises das famílias bacterianas presentes nos solos. Para o gene alkB, as sequências encontratas nos diferentes solos pertencem aos dois filos mais abundantes nos solos, os filo Proteobacteria e Actinobacteria, porém algumas sequências pertencem a bacterias não identificadas. Assim, conclui-se que as mudanças na estrutura da comunidade bacteriana presente em solo com monocultura da cana-de-açúcar são perceptíveis a partr da análises de grupos filogenéticos mais baixo e que a comunidade de bactéria degradadoras de alcanos são pertencentes, principalmente, os filos Actinobacteria e Proteobacteria, porém ainda é necessário mais estudos para a classificação das bactérias não identificadas / The phylum Actinobacteria is currently considered one of the major phyla belonging to the domain Bacteria. This phylum can represent up to 30% of the soil microbial community. The organisms of the phylum Actinobacteria has been characterized as antibiotic producers and degraders of complex substances such as alkanes, present in several substances found in plants. Regarding the degradation of alkanes it has already been proven that alkB gene (alkane hydroxylase), present in the phylum Actinobacteria, is related to its degradation. But the communities of such organisms can be altered by changes in land use, which in Brazil occur extensively due to implementation of monocultures. The cultivation of sugarcane, which has been expanded annually, appears as one of the crops that can alter the soil microbiota. The different sugarcane harvest systems, with and without straw burning, can alter the soil microbiota.Thus, considering the role of the phylum Actinobacteria in the cycling of organic matter, in addition to their biotechnological importance, this study evaluated how different harvest systems of sugarcane influence rhizospheric communities of Actinobacteria and alkane-oxidizing bacteria under controlled conditions in a greenhouse, using molecular techniques to quantify (qPCR), analyse the structure (T-RFLP) and diversity of the community (metagenomic sequencing). For this, the soil collected from sugarcane fields with harvest managements with and without burning the straw, was used in a mesocosms experiment composed of pots with a sugarcane plant, from where rhizosphere soil was collected, and without plant, from where control soil was collected. The quantification of Actinobacteria 16S rRNA gene and alkB gene showed no statistical differences in the comparison of sugarcane controls soil with and without burning, and in the comparison between rhizosphere and control soil of each type of crop management. Terminal Restriction Fragments (TRF) analysis of control soils of different harvesting systems showed a separation of the bacterial community present in the soil, the same occurred in the comparison between rhizosphere and control soils of different harvesting systems. However, when observing the taxonomic structure of the bacterial community it is noted that that the phyla Proteobacteria, Actinobacteria, Firmicutes and Acidobacteria are predominant in different sampled soils, the statistical differences between the control and rhizosphere soil of each treatment are presented from the analysis of bacterial families present in the soil. For alkB gene, the sequences found in different soils belong to the two most abundant phyla in the soil, the phylum Proteobacteria and Actinobacteria, but some sequences belong to unidentified bacteria.Thus, it is concluded that the changes in the structure of the bacterial community present in soil with monoculture of sugarcane are apparent from the analysis of lower phylogenetic groups and the alkane-degrading bacterial communities belong mainly to the phyla Actinobacteria and Proteobacteria, however it is still needed further studies for the classification of unidentified bacteria

Orientador: Patricia de Oliveira Prada / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Aplicadas / Made available in DSpace on 2018-08-26T02:10:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Souza_AlessandraZaninZambomde_M.pdf: 4234168 bytes, checksum: b7f596f6fcaa8a1d60980a17c3aeb76d (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Introdução: Inúmeros fatores contribuem para o aumento da obesidade em todo o mundo. Recentemente, a microbiota intestinal ganhou destaque devido ao seu poder de predispor ou inibir o ganho de peso. Alguns nutrientes são capazes de alterar a composição da microbiota intestinal, o que pode trazer efeitos benéficos ou maléficos, como a obesidade. O aminoácido L-glutamina, além de suas inúmeras funções orgânicas e imunológicas, é conhecido por desempenhar importante papel no trofismo intestinal. O objetivo do presente estudo foi investigar alterações na composição da microbiota intestinal de indivíduos com sobrepeso ou obesidade após suplementação oral com L-glutamina. Métodos: Voluntários com sobrepeso ou obesidade foram selecionados para ingerir 30g de L-glutamina (GLN) por via oral ao dia, por um período de quatorze dias. O grupo controle recebeu L-alanina (ALA) no mesmo tempo e proporção. Amostras de sangue e fezes foram coletadas para análises. Para classificação taxonômica das bactérias intestinais, foi realizado sequenciamento do gene 16S RNA ribossomal. Análises de bioinformática foram conduzidas com base no banco de dados RDP (Ribosomal Database Project). Para análise dos dados, estratégias estatísticas variadas foram utilizadas. Resultados: Após quatorze dias de suplementação, os participantes do grupo GLN exibiram diferenças significativas nos filos Actinobacteria e Firmicutes e nos gêneros Dialister, Dorea, Pseudobutyrivibrio e Veillonella, comparados com o grupo ALA. A razão F / B (Firmicutes / Bacteroidetes), um bom biomarcador para a obesidade, reduziu de 0,85 para 0,57 no grupo GLN e ao contrário, aumentou de 0,91 para 1,12 no grupo ALA. Conclusão: A suplementação oral do aminoácido L-glutamina, em humanos com sobrepeso e obesidade, por um período de quatorze dias, promove alterações na composição da microbiota intestinal similares às promovidas pela perda de peso / Abstract: Introduction: Several factors contribute to the increase of obesity worldwide. Recently, the gut microbiota gained prominence due to its power to predispose or inhibit weight gain. Some nutrients are able to change the composition of the gut microbiota, what can bring beneficial or harmful effects, such as obesity. The amino acid L-glutamine, in addition to its numerous organic and immune functions, is known to play an important role in intestinal tropism. The aim of this study was to investigate changes in the composition of the gut microbiota of overweight or obese adults after oral supplementation with L-glutamine. Methods: Overweight or obese subjects were selected to orally ingest 30g of L-glutamine (GLN) daily for a period of fourteen days. The control group received L-alanine (ALA) in the same period and proportion. Blood and feces were collected for analysis. The 16S rRNA gene sequence was performed for taxonomic classification of intestinal bacteria. Bioinformatics analysis was conducted based on RDP (Ribosomal Database Project). For data analysis, varied statistical strategies were used. Results: After fourteen days of supplementation, participants in the GLN group showed significant differences in the Firmicutes and Actinobacteria phyla and Dialister, Dorea, Pseudobutyrivibrio and Veillonella genera, compared with the ALA group. The F / B (Firmicutes / Bacteroidetes) ratio, a good biomarker for obesity, decreased from 0.85 to 0.57 in GLN group and, as opposed, increased from 0.91 to 1.12 in the ALA group. Conclusion: Oral supplementation with the amino acid L-glutamine in overweight and obese humans, for a period of fourteen days, alters the composition of the gut microbiota in a similar way to weight loss / Mestrado / Nutrição / Mestra em Ciências da Nutrição e do Esporte e Metabolismo

Manguezais são ecossistemas costeiros que ocorrem na transição entre os ambientes terrestres e marinhos, ao longo das regiões tropicais e subtropicais, sofrendo influência direta do regime das marés. A comunidade microbiana diversificada é fundamental para a ocorrência da ciclagem de nutrientes e, portanto, manutenção da biodiversidade faunística e florística nestes ambientes. As actinobactérias correspondem um grupo heterogêneo de bactérias filamentosas, que naturalmente habitam o solo, adaptam-se às diversas condições do ambiente, produzem antibióticos e são capazes de colonizar a rizosfera e tecidos internos das plantas. Neste trabalho foi possível observar a diversidade de actinobactérias rizosféricas isoladas nos manguezais de Cananéia e Bertioga SP; avaliar a produção de metabólitos secundários antifúngicos desses microrganismos; analisar o perfil químico dos extratos orgânicos das actinobactérias por espectrômetro de massas, seguidos de avaliação dos constituintes químicos desses extratos por cromatografia em camada delgada e coluna preparativa para separação dos mesmos, onde após os bioensaios com as frações ativas, foi determinado a concentração inibitória mínima dessas frações. / Mangroves are coastal ecosystems which occur in the areas of transition between marine and terrestrial environments throughout the tropical and subtropical regions, suffering direct tide influence. The diverse microbial communities are important to the nutrient cycling occurrence and consequently to the maintenance of these environments fauna and flora biodiversity. The Actinobacteria are a heterogeneous group of filamentous bacteria that naturally inhabit the soil. They can easily adapt to different environmental conditions, producing antibiotics and colonizing the rhizosphere and plants internal tissues. This study aims were: to allow the assessment of the diversity of the diversity of rhizosphere Actinobacteria isolated from mangroves located in Cananeia and Bertioga, cities under the jurisdiction of Sao Paulo State; to evaluate the production of antifungal secondary metabolites of these microorganisms; to analyze the chemical profile of organic extracts of Actionobacteria by mass spectrometry, followed by the evaluation of the chemical components of theses extracts through thin-layer chromatography and preparative column for their separation. After this process minimum inhibitory concentration of the active fractions of the bioassays were determined.

O filo Actinobacteria é um importante grupo de bactérias Gram positivas amplamente distribuídas nos ambientes aquáticos e terrestres, são grandes produtores de compostos biologicamente ativos e, portanto, de grande interesse biotecnológico. O gênero Streptomyces destaca-se como maior produtor destes compostos, sendo responsável por cerca de 70% dos antibióticos que hoje utilizamos. A identificação dos organismos deste gênero ainda é um desafio. Durante muitos anos a identificação foi realizada somente com base em características morfológicas e fisiológicas. Atualmente, com o avanço das técnicas moleculares, há um grande número de espécies relatadas em bancos de dados genômicos. Este trabalho tem por objetivo identificar isolados de actinobactérias presentes no Laboratório de Microbiologia Ambiental ICBS/UFRGS com auxílio das técnicas de BOX-PCR, amplamente utilizado em estudos de diversidade dentro deste filo, e URP-PCR. E, além disso, realizar purificação parcial de um composto antimicrobiano efetivo contra bactérias produzido pelo isolado Streptomyces 8S. Os primers URP e BOX1AR produziram distintos padrões de amplificação nos isolados estudados, porém não foi possível investigar as relações de similaridade entre eles. Ainda o sequenciamento da região 16S rDNA não foi eficiente para identificar as espécies. Para a purificação do composto antimicrobiano foi realizada extração líquido-líquido com o solvente acetato de etila, posteriormente cromatografia de gel-filtração (Sephadex G-75) e troca iônica (SP-Sepharose e DEAE-celulose). A atividade antimicrobiana do composto foi recuperada após cada etapa. O composto manteve-se ativo após os ensaios de estabilidade frente à adição de EDTA, enzimas proteolíticas e altas temperaturas. Isto sugere que o composto antimicrobiano não é de origem protéica. Este trabalho sugere novos estudos a partir dos resultados preliminares obtidos, como a amplificação de todo o fragmento 16S rDNA dos isolados de actinobactérias e a investigação do composto antimicrobiano através de cromatografias de alta resolução. / The Actinobacteria phylum is an important group of Gram positive bacteria widely distributed in terrestrial and aquatic environments. They are major producers of biologically active compounds and therefore of great biotechnological interest. The genus Streptomyces stands out as the largest producer of these compounds, accounting for about 70% of the antibiotics that we use today. The identification of these organisms is still a challenge. For many years the identification was carried out only based on morphological and physiology characteristics. Today, with the advance of molecular techniques, there are a large number of species reported in genomics database. This work aims to identify isolates of actinobacterias present in the Laboratório de Microbiologia Ambiental ICBS / UFRGS with the help of BOX-PCR techniques, widely used in diversity studies within this phylum, and URP-PCR. And besides that, performing partial purification of an antimicrobial compound effective against bacteria produced by Streptomyces 8S isolated. The URP and BOX1AR primers produced different amplification patterns in the isolates, but it was not possible to investigate the relationship of similarity between them. Also the sequencing of 16S rDNA was not efficient to identify the species. To purify the antimicrobial compound was carried out liquid-liquid extraction with the solvent ethyl acetate, subsequently chromatography: gel-filtration (Sephadex G-75) and ion exchange (SP-Sepharose and DEAE-cellulose). The antimicrobial in question did not adhere to the SP-Sepharose column, showing that it has negative charge. The antimicrobial activity of the compound was recovered after each step. The compound remained active after the stability tests like the addition of EDTA, proteolytic enzymes and high temperatures. This suggests that the antimicrobial compound is not a protein. This work suggests further studies based on the obtained preliminary results such as the amplification of the entire 16S rDNA of actinobacterias isolated fragment and the investigation of the antimicrobial compound using high resolution chromatography.

Os actinomicetos são bactérias Gram positivas caracterizadas por sua habilidade em formar hifas, são amplamente distribuídos no ambiente e conhecidos pela diversidade na produção de moléculas biologicamente ativas. O presente trabalho teve por objetivo avaliar a atividade de compostos produzidos por quarenta isolados de actinomicetos contra isolados clínicos de Enterococcus sp, Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis. O perfil de suscetibilidade das amostras clínicas foi avaliado empregando a técnica de disco difusão em ágar. A atividade antimicrobiana dos actinomicetos foi avaliada pela técnica da dupla camada. Os isolados que apresentaram atividade foram cultivados em caldo amido caseína à temperatura de 30ºC por sete dias, com agitação constante. Após o crescimento, a cultura foi filtrada para obtenção do extrato bruto. A atividade antibiótica do extrato foi avaliada através da técnica de difusão em poço. O isolado que apresentou maior espectro de ação foi selecionado para otimização dos compostos. A otimização da produção dos compostos com atividade antibiótica foi realizada através da avaliação de curva de produção, variação da fonte de carbono, tempo de incubação, pH tamponado e pH não tamponado. No ensaio de sobrecamada os isolados 50 e 8S apresentaram atividade contra a 90% das amostras de microrganismos clínicos de Staphylococcus sp. e Enterococcus sp. No ensaio de difusão em poço o isolado 50 apresentou maior atividade antibiótica que o isolado 8S. Na otimização do extrato as melhores condições de produção foram: 72 h de crescimento, fonte de carbono amido e sem tamponamento de pH. Não foi observada influência de biomassa na produção dos compostos. A cromatografia em camada delgada revelou a presença de duas bandas com fator de retenção de 0,28 (Rf1) e 0,57 (Rf2). / Actinomycetes are Gram positive bacteria, characterized by their ability to form hyphae. They are widely distributed in the environment and known for their diversity in producing biological active molecules. This study aimed to evaluate the activity of compounds produced by forty isolates of Actinomycetes against clinical isolates of Enterococcus sp, Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis. The susceptibility profile of the samples was evaluated using the disk diffusion technique in agar. The antimicrobial activity of actinomycetes was assessed by means of the double layer. Isolates that showed activity were grown in starch casein broth at a temperature of 30 ºC for seven days, with constant agitation. After growth the culture was filtered to obtain a crude extract. The antimicrobial activity of the extract was evaluated by the well diffusion technique. The actinomycete that showed activity against most of the test samples was selected for optimization(s) of the compound(s) production. The optimization of the production was performed by evaluating: growth curve, the use of different carbon source, changes in the incubation time, and culture media with buffered and unbuffered pH. In the overlay assay isolates 50 and 8S presented activity against most of Staphylococcus sp. and Enterococcus sp samples. In diffusion assay isolate 50 showed higher antibiotic activity than the isolated 8S. Compiling the results the best production conditions were: 72 h of growth, carbon source starch without pH buffering at 30°C. There was no effect of biomass (s) compound (s) activity. The thin layer chromatography revealed the presence of two bands with a retention factor of 0.28 (Rf1) and 0.57 (Rf2).