A significant focus of toxicological research is the identification of electrophiles that covalently modify DNA to form addition products (adducts). These products can be generated when aryl radical species react at the C8-site of 2'-deoxyguanosine (dG) to form C8-aryl-dG adducts, which are mutagenic lesions. While this form of DNA modification is detrimental, C8-aryl-dG adducts also possess intriguing properties that can be exploited for beneficial purposes. This thesis is an investigation of one mechanism believed to contribute to the mutagenicity of C8-aryl-dG adducts, as well as a study of the photophysical properties of adducts that allow for their application as fluorescent probes. A common property of C8-aryl-dG adduction is accompaniment of abasic site formation. To determine how the C8-aryl moiety contributes to sugar loss, UV-Vis spectroscopy has been employed to determine hydrolysis kinetics, with C8-aryl-dG adducts found to be more prone than dG to acid-catalyzed hydrolysis. Despite adduct reactivity in acidic media, all adducts are relatively stable at pH 7, suggesting they are unlikely intermediates of abasic site formation at physiological pH. These results have allowed for development of a new rationale for depurination observed upon C8-aryl-dG adduction within duplex DNA. The determination of photophysical parameters of C8-heteroaryl-dG adducts reveals that these nucleosides behave as fluorophores with high fluorescence quantum yields (φfl). These adducts also exhibit emission sensitivity to their solvent environment and H-bonding interactions. C8-Heteroaryl-dG adducts were incorporated in the oligonucleotide 5'-CTCG1G2CG3CCATC, at the G1 and G3 sites, that contains the recognition sequence of the NarI Type II restriction enzyme. Hybridization of the modified NarI oligonucleotides to the complementary strand containing either the C or G nucleobase opposite the adduct allowed for characterization of duplex structures by circular dichroism (CD), UV melting temperature analysis and fluorescence spectroscopy. Results suggest that the C8-heteroaryl-dG adduct favours an anti conformation with base-paired with C, while a syn conformation is favoured when base-paired to G. Adduct conformation of bulky C8-dG adducts is believed to be correlated with their known mutagenic activity. C8-Heteroaryl-dG modified nucleosides could therefore be used as fluorescent models of these adducts to aid in elucidation of adduct-induced mutagenesis in biological systems. / NSERC

As espécies reativas são associadas a processos toxicológicos e fisiopatológicos, agindo como importantes mediadores, por exemplo, na sinalização celular. Diversas classes de compostos têm sido utilizadas como possíveis biomarcadores de estresse redox, destacando-se os aldeídos &#945;,&#946;-insaturados, capazes de alquilar biomoléculas como o DNA. Para evitar efeitos deletérios, estes aldeídos são detoxificados por glutationilação e posterior metabolização a derivados mercaptúricos. Contudo, avaliar o estado redox em sistemas biológicos ainda é tarefa bastante complexa, sendo a dificuldade em quantificar de forma prática e acurada os efeitos de sinalização e/ou dano molecular o maior problema dos estudos redox. Assim, o objetivo deste trabalho foi desenvolver métodos acurados e sensíveis de análise de potenciais biomarcadores de estresse redox, isto é: nucleosídeos modificados, aldeídos endógenos e exógenos, glutationa e produtos de glutationilação, e avaliá-los em sistemas modelos, celular e animal, e em humanos. A avaliação dos níveis urinários de três nucleosídeos modificados por metodologia de HPLC-MS/MS desenvolvida pelo grupo em moradores da cidade de São Paulo - região com poluição atmosférica - demonstrou aumento significativo de 1,N2-propanodGuo comparado aos moradores de região não poluída. Ademais, comprova-se pela primeira vez que células deficientes em reparo de ligações cruzadas apresentam níveis basais elevados de 1,N2-propanodGuo, em duas linhagens independentes, colocando este aduto como potencial mediador de carcinogênese em pacientes portadores de Anemia de Fanconi. Utilizando cérebro de ratos SOD1G93A (modelo de Esclerose Lateral Amiotrófica - ELA), verificou-se aumento de 50% nos níveis de 1,N2-propanodGuo e de 100% nos de 1,N6-&#949;dAdo em fase sintomática, sugerindo influência do conteúdo lipídico cerebral, levando a comprometimento do metabolismo neuronal e morte celular. O perfil de aldeídos determinado em cérebro de ratos SOD1G93A demonstrou aumento de trans-hexa-2-enal e trans,trans-hexa-2,4-dienal em fase assintomática e de trans,trans-deca-2,4-dienal em fase sintomática, não sendo observada nenhuma alteração na medula. Conhecer estas variações permite direcionar estudos de modificações em biomoléculas, além de a metodologia per se corroborar com as áreas de análises lipidômicas. Técnicas distintas e o preparo de amostras refletiram nos níveis de glutationa reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) relatados. A técnica de espectrometria de massas mostrou-se mais precisa que a detecção eletroquímica; e a alquilação do grupo tiol minimizou interferências de matriz. Por análise de HPLC-UV/Vis-ESI-MS/MS, a quantificação de trans-4-hidroxi-2-nonenal (HNE) e crotonaldeido conjugados com GSH demonstrou não haver alterações em cérebro e medula de ratos SOD1G93A. Contudo, há formação esteroespecífica dos adutos de HNE in vivo. Ressalta-se que a metodologia desenvolvida é extremamente sensível e específica e permite análise simultânea de GSH, GSSG, cisteína, cistina e dos adutos supracitados, servindo para análise de outros adutos de glutationilação de aldeídos que possam ser importantes em doenças associadas a estresse redox. / Free radicais and oxidant species are associated with toxicological and pathophysiological processes. It has been demonstrated that production of reactive oxygen species may be involved in cell signaling and regulation. Several biomarkers of redox processes have been used, including adducts formed through the reaction of &#945;,&#946;-unsaturated aldehydes with biomolecules such as DNA. In order to avoid these deleterious effects, aldehydes are detoxified through glutathionylation and further metabolized to mercapturic derivatives. However, assessing the redox status in biological systems is still a very complex task, and the difficulty in practical and accurate quantification of signaling effects and/or molecular damage is a major problem in redox studies. The objective of this work was to develop accurate and sensitive methods for analysis of potential biomarkers of redox stress, i.e., modified nucleosides, endogenous and exogenous aldehydes, glutathione and glutathionylation products, and their evaluation in cell, animal model and humans. Evaluation of urinary levels of 1,N2-propano-2\'-deoxyguanosine (1,N2-propanodGuo), 1,N2-etheno-2\'-deoxyguanosine and 8-oxo-7,8-dihydro-2\'-deoxyguanosine in residents of São Paulo City - polluted region - showed a significant increase (p<0.05) in 1,N2-propanodGuo levels compared to residents of an unpolluted region by a HPLC-MS/MS methodology developed by the group. Moreover, it was proven, for the first time, that repair deficient cells have basal levels of 1,N2-propanodGuo higher than proficient cells in two independent strains, placing 1,N2-propanodGuo as a potential mediator of carcinogenesis in Fanconi Anemia patients. In an Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) animal model (SOD1G93A rat) , a 50% increase in the levels of 1,N2-propanodGuo and 100% in the 1,N6-etheno-2\'-deoxyadenosine in brain tissue in the symptomatic phase was observed, suggesting that the high brain lipid content may play a role, leading to impairment of cell metabolism and neuronal cell death. There is an increase of trans-hex-2-enal and trans,trans-hexa-2,4-dienal in asymptomatic SOD1G93A rats brain and of trans,trans-deca-2,4-dienal in symptomatic ones. However, no alteration was observed in spinal cord. Our approach contributes to a better understanding of the aldehyde status in vivo and allows us to predict biomolecule modifications. The developed methodology can contribute to lipidomic studies. The use of different techniques and sample preparation reflected in the reported levels of reduced (GSH) and oxidized glutathione (GSSG). The mass spectrometry technique proved to be more accurate than the electrochemical one, and the use of thiol alkylating agent minimizes matrix interference. No changes were observed in the levels of the GSH conjugates of trans-4-hydroxy-2-nonenal (HNE) and crotonaldehyde in brain and spinal cord of SOD1G93A rats quantified by HPLC-UV/Vis-ESI-MS/MS compared to controls. However, it was observed stereospecific HNE adducts formation in vivo. Note that this methodology is extremely sensitive and specific and allows simultaneous analysis of GSH, GSSG, Cys, cystine and the aforementioned adducts, serving for analysis of other aldehyde-glutathionylation adducts that may be important in pathologies associated with stress redox.

As espécies reativas são associadas a processos toxicológicos e fisiopatológicos, agindo como importantes mediadores, por exemplo, na sinalização celular. Diversas classes de compostos têm sido utilizadas como possíveis biomarcadores de estresse redox, destacando-se os aldeídos &#945;,&#946;-insaturados, capazes de alquilar biomoléculas como o DNA. Para evitar efeitos deletérios, estes aldeídos são detoxificados por glutationilação e posterior metabolização a derivados mercaptúricos. Contudo, avaliar o estado redox em sistemas biológicos ainda é tarefa bastante complexa, sendo a dificuldade em quantificar de forma prática e acurada os efeitos de sinalização e/ou dano molecular o maior problema dos estudos redox. Assim, o objetivo deste trabalho foi desenvolver métodos acurados e sensíveis de análise de potenciais biomarcadores de estresse redox, isto é: nucleosídeos modificados, aldeídos endógenos e exógenos, glutationa e produtos de glutationilação, e avaliá-los em sistemas modelos, celular e animal, e em humanos. A avaliação dos níveis urinários de três nucleosídeos modificados por metodologia de HPLC-MS/MS desenvolvida pelo grupo em moradores da cidade de São Paulo - região com poluição atmosférica - demonstrou aumento significativo de 1,N2-propanodGuo comparado aos moradores de região não poluída. Ademais, comprova-se pela primeira vez que células deficientes em reparo de ligações cruzadas apresentam níveis basais elevados de 1,N2-propanodGuo, em duas linhagens independentes, colocando este aduto como potencial mediador de carcinogênese em pacientes portadores de Anemia de Fanconi. Utilizando cérebro de ratos SOD1G93A (modelo de Esclerose Lateral Amiotrófica - ELA), verificou-se aumento de 50% nos níveis de 1,N2-propanodGuo e de 100% nos de 1,N6-&#949;dAdo em fase sintomática, sugerindo influência do conteúdo lipídico cerebral, levando a comprometimento do metabolismo neuronal e morte celular. O perfil de aldeídos determinado em cérebro de ratos SOD1G93A demonstrou aumento de trans-hexa-2-enal e trans,trans-hexa-2,4-dienal em fase assintomática e de trans,trans-deca-2,4-dienal em fase sintomática, não sendo observada nenhuma alteração na medula. Conhecer estas variações permite direcionar estudos de modificações em biomoléculas, além de a metodologia per se corroborar com as áreas de análises lipidômicas. Técnicas distintas e o preparo de amostras refletiram nos níveis de glutationa reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) relatados. A técnica de espectrometria de massas mostrou-se mais precisa que a detecção eletroquímica; e a alquilação do grupo tiol minimizou interferências de matriz. Por análise de HPLC-UV/Vis-ESI-MS/MS, a quantificação de trans-4-hidroxi-2-nonenal (HNE) e crotonaldeido conjugados com GSH demonstrou não haver alterações em cérebro e medula de ratos SOD1G93A. Contudo, há formação esteroespecífica dos adutos de HNE in vivo. Ressalta-se que a metodologia desenvolvida é extremamente sensível e específica e permite análise simultânea de GSH, GSSG, cisteína, cistina e dos adutos supracitados, servindo para análise de outros adutos de glutationilação de aldeídos que possam ser importantes em doenças associadas a estresse redox. / Free radicais and oxidant species are associated with toxicological and pathophysiological processes. It has been demonstrated that production of reactive oxygen species may be involved in cell signaling and regulation. Several biomarkers of redox processes have been used, including adducts formed through the reaction of &#945;,&#946;-unsaturated aldehydes with biomolecules such as DNA. In order to avoid these deleterious effects, aldehydes are detoxified through glutathionylation and further metabolized to mercapturic derivatives. However, assessing the redox status in biological systems is still a very complex task, and the difficulty in practical and accurate quantification of signaling effects and/or molecular damage is a major problem in redox studies. The objective of this work was to develop accurate and sensitive methods for analysis of potential biomarkers of redox stress, i.e., modified nucleosides, endogenous and exogenous aldehydes, glutathione and glutathionylation products, and their evaluation in cell, animal model and humans. Evaluation of urinary levels of 1,N2-propano-2\'-deoxyguanosine (1,N2-propanodGuo), 1,N2-etheno-2\'-deoxyguanosine and 8-oxo-7,8-dihydro-2\'-deoxyguanosine in residents of São Paulo City - polluted region - showed a significant increase (p<0.05) in 1,N2-propanodGuo levels compared to residents of an unpolluted region by a HPLC-MS/MS methodology developed by the group. Moreover, it was proven, for the first time, that repair deficient cells have basal levels of 1,N2-propanodGuo higher than proficient cells in two independent strains, placing 1,N2-propanodGuo as a potential mediator of carcinogenesis in Fanconi Anemia patients. In an Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) animal model (SOD1G93A rat) , a 50% increase in the levels of 1,N2-propanodGuo and 100% in the 1,N6-etheno-2\'-deoxyadenosine in brain tissue in the symptomatic phase was observed, suggesting that the high brain lipid content may play a role, leading to impairment of cell metabolism and neuronal cell death. There is an increase of trans-hex-2-enal and trans,trans-hexa-2,4-dienal in asymptomatic SOD1G93A rats brain and of trans,trans-deca-2,4-dienal in symptomatic ones. However, no alteration was observed in spinal cord. Our approach contributes to a better understanding of the aldehyde status in vivo and allows us to predict biomolecule modifications. The developed methodology can contribute to lipidomic studies. The use of different techniques and sample preparation reflected in the reported levels of reduced (GSH) and oxidized glutathione (GSSG). The mass spectrometry technique proved to be more accurate than the electrochemical one, and the use of thiol alkylating agent minimizes matrix interference. No changes were observed in the levels of the GSH conjugates of trans-4-hydroxy-2-nonenal (HNE) and crotonaldehyde in brain and spinal cord of SOD1G93A rats quantified by HPLC-UV/Vis-ESI-MS/MS compared to controls. However, it was observed stereospecific HNE adducts formation in vivo. Note that this methodology is extremely sensitive and specific and allows simultaneous analysis of GSH, GSSG, Cys, cystine and the aforementioned adducts, serving for analysis of other aldehyde-glutathionylation adducts that may be important in pathologies associated with stress redox.

Doctor of Philosophy / Department of Chemistry / Stefan Bossmann / Estrogen-derived DNA adducts in human could be the initiating step of breast and prostate cancer, as the scientific literature suggests. Previous studies demonstrated that 4-hydroxy-estrone (estradiol)-1-N3Adenine and 4-hydroxy-estrone (estradiol)-1-N7Guanine were the most abundant adducts found in urine of human subjects. Sensitive detection of these adducts in urine samples could lead to better breast and prostate cancer risk assessment. The standard adducts were synthesized and characterized by NMR and mass spectrometry. Since these adducts are not fluorescent at room temperature an aminomethyl (-CH2NH2) linker was introduced at the C-17 position for derivatization with fluorescence label. This linker allowed to attach highly fluorescent water soluble quantum dots (QDs) for indirect adduct detection. A direct gram-scale synthesis of highly fluorescent, photostable water soluble QDs was executed by developing a new class of 4,4’-bipyridinium salt based twin ligands with 85% and 15% of carboxylic acid and maleimide termini, respectively. These ligands not only stabilized the QDs in water but also provided versatile linkers for two labeling strategies. The twin ligands were afforded by a facile synthesis through SN2 nucleophilic substitution reaction. Labeling of adducts was achieved via a covalent coupling between the (-CH2NH2) linker and the carboxyl (-COOH) terminal ligand on the QDs. However, ELISA experiments utilizing an IgM antibody didn’t reveal any measurable signal from adduct-QD complexes suggesting that one QD is bound to a large number of adducts through –COOH terminal ligands present on QD surface. To explore the binding capabilities of QDs in more detail, a maleimide terminal ligand (a twin partner on the QDs) was synthesized to explore the thiol (-SH) functionality of thiopyrene. Preliminary ELISA showed that these QDs gave detectable fluorescent signal originating from the [pyrene-S-QD] ̶ 8E11 monoclonal antibody (mAb) complex when QD was selectively excited at 470 nm. This clearly indicates that it is necessary to develop a strategy for a distinct 1:1 labeling procedure between QD and the adduct of interest. In addition, IgG (instead of IgM) antibodies should be developed for biosensor application. The latter could afford binding of mAb in upright position, leading to an increase in surface density of mAb and better detection limit.

Globalmente, os problemas de poluição são mais severos em regiões densamente povoadas ou industrializadas. A Região Metropolitana de São Paulo (RMSP) é um exemplo de megalópole com um conjunto único de emissões, insolação e condições meteorológicas que determinam sua elevada poluição atmosférica. Entre os compostos mais tóxicos presentes nesta atmosfera estão os aldeídos, moléculas de grande potencial mutagênico e carcinogênico que podem ser originados da oxidação de combustíveis fósseis e etanol, além de possuir fontes endógenas. Sua adição covalente em biomoléculas como DNA e proteínas é estudada como mecanismo de sua ação mutagênica e carcinogênica. Desenvolvemos um método ultrassensível de HPLC acoplado à espectrometria de massas para análise simultânea de vários adutos de DNA com aldeídos presentes na atmosfera urbana como formaldeído, acetaldeído, crotonaldeído e acroleína, além de modificações oxidativas. Foram utilizados para validação da metodologia células modelo de Anemia Fanconi e tecido de músculo de ratos modelo para ELA (Esclerose Lateral Amiotrófica), os quais apresentaram níveis basais dos adutos de formaldeído, acetaldeído, acroleína e crotonaldeído. Outros modelos de exposição aos aldeídos foram utilizados na validação desta metodologia, como a fumaça de cigarro de tabaco e de cannabis sendo que a formação desses adutos também foi verificada em DNA de timo de bezerro. Pela primeira vez, foi mostrada a formação inequívoca do aduto de acetaldeído (1,N2-propanodGuo) em pulmões e cérebros de ratos Wistar expostos à 10 ppb de acetaldeído isotopicamente marcado e sua estrutura confirmada por espectrometria de massas de alta resolução. Esse resultado comprova o mecanismo de formação do aduto por meio da adição de duas moléculas de acetaldeído in vivo por inalação e em baixa concentração, sendo crucial para formulação de políticas públicas por agências ambientais. / Globally, air pollution problems are more severe in densely populated or industrialized regions. The Metropolitan Region of São Paulo (RMSP) is an example of a megalopolis with a unique set of emissions, insolation and meteorological conditions that determinates its high atmospheric pollution. Among the most toxic compounds present in this atmosphere are aldehydes, molecules of great mutagenic and carcinogenic potential that can be originated from the oxidation of fossil fuels and ethanol, besides having endogenous sources. Its covalent addition in biomolecules like DNA and proteins is studied as a mechanism of its mutagenic and carcinogenic action. We developed an ultra-sensitive HPLC method coupled with mass spectrometry for the simultaneous analysis of several DNA adducts with aldehydes present in the urban atmosphere as formaldehyde, acetaldehyde, crotonaldehyde and acrolein and oxidative lesions as well. To validate the method, we used a cell model of Fanconi Anemia and muscle tissue from a rat model for ALS (Amyotrophic Lateral Sclerosis) which presented basal levels of the adducts of formaldehyde, acetaldehyde, acrolein and crotonaldehyde. Other models of exposure to aldehydes were used to validate the method, such as tobacco and cannabis smoke and the formation of these adducts was also verified in Calf Thymus DNA. For the first time, the unequivocal formation of the acetaldehyde (1, N2-propanodGuo) adduct was shown in lungs and brains of Wistar rats exposed to 10 ppb of isotopically labeled acetaldehyde and its structure was confirmed by high resolution mass spectrometry. This result confirms the mechanism of adduct formation by the addition of two molecules of acetaldehyde in vivo by inhalation of a low concentration of acetaldehyde, being crucial for the formulation of public policies by environmental agencies.

É grande a preocupação na identificação de compostos envolvidos no desenvolvimento de processos deletérios, como o câncer. O tetraidrofurano (THF) é um solvente amplamente utilizado em indústria e pesquisa e estudos recentes indicaram uma atividade carcinogênica em animais experimentais, incentivando a investigação da sua possível interação com biomoléculas. Adutos de DNA servem como marcadores para a identificação da atividade genotóxica de substâncias e para o monitoramento da exposição humana aos agentes genotóxicos. Estudos realizados in vitro, em células em cultura, bem como em animais experimentais, permitem que mecanismos sejam desvendados e metodologias sejam desenvolvidas para uma posterior avaliação da exposição humana. O contínuo desenvolvimento de técnicas de análise de adutos em DNA para monitoramento biológico constitui importante preocupação para pesquisadores envolvidos com a saúde ocupacional e a medicina preventiva. No presente trabalho foi investigada a reação de produtos de oxidação do THF com os nucleosídeos 2\'-desoxiadenosina (dAdo) e 2\'-desoxicitidina (dCyd). As estruturas dos adutos formados foram elucidadas por análises de espectros de massas (ESI/MS-MS) e ressonância magnética nuclear (RMN) após purificação de quantidade suficiente dos produtos por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Com isso, foi aberta a possibilidade de validação de novos marcadores de exposição a THF. Tais lesões foram detectadas em DNA incubado com THF oxidado in vitro, após o desenvolvimento de uma metodologia sensível e seletiva baseada em HPLC/ESI/MS-MS. Além disso, camundongos foram expostos a vapor de THF e foi feita análise de dano oxidativo (8-oxo-2-desoxiguanosina) no DNA de fígado e rim. Um aumento de aproximadamente oito vezes no nível de 8-oxo-2-desoxiguanosina foi observado no DNA dos órgãos dos camundongos expostos ao THF. Nossos estudos in vitro apontam para a possibilidade de ação genotóxica do THF oxidado (formação de adutos com o DNA). A ocorrência dessa via in vivo será investigada em estudos posteriores. Adicionalmente, há aumento de dano oxidativo em órgãos alvos de carcinogênese induzida por esse solvente. / There is a huge concern to identify compounds involved in the development of harmful processes, like cancer. Tetrahydrofuran (THF) is a solvent widely used in industries and recent researches and studies indicated a carcinogenic activity in experimental animals, instigating the investigation of its possible interaction with biomolecules. DNA adducts are used as markers for the identification of genotoxic activity of substances and monitoring the human exposition to genotoxic agents. Studies carried out in vitro, in culture cells and in experimental animals allow to disclose mechanisms and develop methodologies for a posterior evaluation of the human exposition. The continuous development of techniques for the analysis of DNA adducts for biological monitoring constitutes a remarkable concern for the researchers involved with occupational health and preventive medicine. In the present paper, the reaction of THF oxidation products with the nucleosides 2\'-deoxyadenosine (dAdo) and 2\'-deoxycitidine (dCyd) were investigated. The structures of the formed adducts were elucidated by mass spectra analysis (ESI/MS-MS) and nuclear magnetic resonance (RMN) after purification of sufficient quantities of the products by high-performance liquid chromatography (HPLC). Thus, the validation of new markers of exposition to THF was made possible. Such damages were detected in DNA incubated with oxidized THF in vitro, after the development of a sensible and selective methodology based on HPLC/ESI/MS-MS. Moreover, mice were exposed to THF vapors and an oxidative damage analysis (8-oxo-2\'-deoxyguanosine) was carried out on DNA from liver and kidney. An approximate 8-fold increase in the level of 8-oxo-2\'-deoxyguanosine was observed on DNA from the mices organs exposed to THF. Our in vitro studies indicate the possibility of oxidized THF genotoxic action (formation of adducts with DNA). The occurrence of this path in vivo will be investigated in future studies. In addition, the oxidative damage in target organs of carcinogenesis induced by this solvent was increased.

Os efeitos de ribonucleosídeos de guanina substituídos na posição C-8 na proliferação de linfócitos B estão bem documentados na literatura. Esses compostos são análogos de adutos formados pela adição de radicais livres a ribonucleosídeos e a RNA. Neste trabalho, verificamos as propriedades proliferativas de dois desses adutos, 8-metilguanosina (8-MeGuo) e 8-oxo-7 ,8-di-hidroguanosina (8-OxoGuo) e comparamos com 8-bromoguanosina (8-BrGuo), o composto mais estudado como indutor da proliferação de linfócitos B. 8-MeGuo e 8-OxoGuo foram sintetisados em rendimentos de 28 e 55%, respectivamente, e foram caracterizados por UV, NMR e CG-massa. Seus efeitos sobre a incorporação de timidina radioativa ([3H] TdR) no DNA de células de baço, fibroblasto 3T3(A31) e melanoma B16F10 foram examinados. Os dois adutos foram mitogênicos para células de baço mas foram seletivos quanto as células imortalizadas. 8-MeGuo atuou sobre células 3T3(A31) e 8-OxoGuo sobre as células de melanoma B16F10. O análogo não fisiológico 8-BrGuo foi efetivo em todas as células testadas. Experimentos de contagem de células, citotoxicidade e citometria de fluxo, indicaram que a síntese de DNA induzida pelas guanosinas substituídas na posição C-8 refletia crescimento celular. Foi proposto que os compostos agem de dentro da célula uma vez que seus efeitos são bloqueados em presença de um inibidor de transporte de nucleosídeo, mas não foram inibidos por um antagonista de receptor purinérgico. Os resultados obtidos, junto com os descritos na literatura, sugerem que no caso dos fibroblastos 3T3(A31) e células de baço de camundongo os efeitos proliferativos dos compostos não são dependentes do metabolismo desses compostos via salvação das purinas. No caso das células de melanoma, entretanto, os compostos parecem fazer parte do \"pool\" de nucleosídeos. A demonstração de que adutos produzidos por ataques radicalares em ribonucleosídeos e RNA são capazes de induzir proliferação celular, abre novas perspectivas para a compreensão do papel de radicais livres em processos carcinogênicos. / The ability of CS-substituted guanine ribonucleosides to induce B cell proliferation has been well documented in the literature. These compounds are analogues of adducts formed from free radical attack on ribonucleosides and RNA. Here we examined the proliferative properties of two of these radical adducts, 8-methylguanosine (8-MeGuo) and 8-oxo-7 ,8-dihydroguanosine (8-OxoGuo) and compared them with those of the well studied B cell mitogen, 8-bromoguanosine (8-BrGuo). 8-MeGuo and 8-OxoGuo were synthesized in yields of 28 and 55 %, respectively, and were characterized by UV, NMR and CG-MS. Their effects upon [3H] thymidine uptake by Swiss mice splenocytes, mouse embryo 3T3 (A31) fibroblasts and mouse B16F10 melanocytes were examined. Both guanosine radical adducts were shown to increase [3H] thymidine uptake by mice splenocytes but displayed selectivity in regard to continuous cell lines. 8-MeGuo acted upon 3T3(A31) fibroblasts whereas 8-OxoGuo acted upon B16F10 melanocytes. The non physiological analogue 8-BrGuo acted upon all tested cells. Parallel experiments of cell counting, cytotoxicity, and cell sorting indicated that DNA synthesis induced by the C8-substituted guanosines reflected cell growth. It is proposed that the compounds act intracellularly because their proliferative effects were blocked in the presence of a nucleoside transport inhibitor but were not inhibited by an antagonist of the A2 purine receptor. The obtained results, taken together with data from the literature suggest that in the case of 3T3 (A31) fibroblasts and mice splenocytes the proliferative effects of the compounds are not dependent on metabolism through purine salvage pathways. In the case of melanocytes, however, the compounds are likely to become part of the purine nucleoside pool. The demonstration that adducts produced by free radical attack on ribonucleosides and RNA are able to induce cell proliferation opens new perspectives for the understanding of free radical mediated carcinogenesis.

Tetraidrofurano (THF) é um solvente muito utilizado industrialmente, com demonstrada ação carcinogênica em animais experimentais, mas pouco se sabe sobre sua toxicidade celular, danos a biomoléculas e genotoxicidade. Em trabalho anterior realizado no laboratório, foi verificado que adutos de DNA são formados a partir da reação de THF oxidado com 2\'-desoxiguanosina (dGuo), 2\'-desoxiadenosina (dAdo) e 2\'-desoxicitidina (dCyd) in vitro. A ocorrência dessas lesões em sistemas biológicos expostos a THF nunca foi demonstrada e pode indicar uma via de ação genotóxica desse solvente, até o momento não considerada nos estudos de carcinogênese e toxicidade. Neste trabalho foi investigada a indução de lesões em DNA e RNA de sistemas biológicos expostos ao THF, assim como alterações epigenéticas. Como sistemas biológicos foram utilizados homogenato de fígado de camundongos, cultura de células HepG2 e fígado e rim de camundongos que foram, em trabalho anterior, expostos a vapores do solvente. Métodos de HPLC-ESI-MS/MS foram validados para quantificação de todas as lesões em DNA. Foi verificado que THF é um solvente de baixa citoxicidade para células HepG2, sendo necessárias concentrações acima de 50 mM por período de incubação superior a 24 h para ser observada perda de viabilidade. Houve indução de dano oxidativo em DNA de células HepG2 e de fígado de camundongos expostos. Uma vez que o solvente esteja oxidado, a espécie reativa THF-OH presente no meio de cultura é capaz de reagir com RNA e DNA das células e DNA de homogenato de fígado de camundongos, gerando adutos com dAdo, dGuo e Ado. A espécie reativa possui maior afinidade por dGuo que por dAdo no DNA. Entretanto, as células HepG2 não biotransformaram THF para o intermediário reativo. Além disso, THF induziu hipermetilação no DNA das células HepG2 expostas a 50 e 100 mM do solvente e em DNA de fígado de camundongos fêmeas C57BL/6J expostos a vapores de THF (vapor de 1 mL/h, 6h/dia, 5 dias). Este estudo mostra pela primeira vez a reatividade do solvente THF oxidado (contendo THF-OH) com DNA e RNA em sistemas biológicos, assim como alteração epigenética induzida pelo solvente, e servirá para uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos na indução de câncer por THF. / Tetrahydrofuran (THF) is a widely used industrial solvent with demonstrated carcinogenic action in experimental animals, but little is known about its cellular toxicity and genotoxic damage to biomolecules. Previous work of this group showed that DNA adducts are formed from the reaction of oxidized THF with 2\'-deoxyguanosine (dGuo), 2\'-deoxyadenosine (dAdo), and 2\'-deoxycytidine (dCyd) in vitro. The occurrence of these lesions in biological systems exposed to THF has never been demonstrated and may indicate a genotoxic pathway of this solvent, so far not considered in carcinogenesis and toxicity studies. It was investigated here the induction of DNA and RNA lesions in biological systems exposed to THF, as well as epigenetic changes. The biological systems used were mice liver homogenate, HepG2 cell culture, and liver and kidney of mice that were exposed to solvent vapors in a previous work. HPLC-ESI-MS/MS methods were validated for quantitation of all lesions in DNA. It was found that THF is of low cytotoxicity to HepG2 cells, requiring concentrations above 50 mM for incubation period over 24 h to induce loss of viability. DNA oxidative damage was induced in HepG2 cells and liver of exposed mice. Once the solvent is oxidized, the reactive species THF-OH present in the culture medium is able to react with DNA and RNA of HepG2 cells and DNA from mice liver homogenate, generating adducts with dAdo, dGuo and Ado. The reactive species has higher affinity for dGuo than for dAdo in DNA. However, HepG2 cells were not able to activate THF to the reactive intermediate. In addition, THF induced DNA hypermethylation in HepG2 cells exposed to 50 and 100 mM of the solvent and in liver of C57BL/6J female mice exposed to THF vapors (1 mL vapor / h 6h/dia, 5 days). This study shows for the first time the reactivity of oxidized THF (containing THF-OH) with DNA and RNA in biological systems, as well as epigenetic change induced by the solvent, and may contribute for a better understanding of the mechanisms involved in the induction of cancer by THF.

Bisfenol A (BPA) é um insumo largamente utilizado na produção de plástico policarbonato e amplamente difundido no meio ambiente, levando o ser humano à exposição crônica desde o período intrauterino. A literatura aponta a possibilidade de BPA aumentar o risco de diversos tipos de câncer, mas são necessários estudos que possibilitem o entendimento de mecanismos pelos quais isso pode ocorrer. Neste trabalho foram investigados os efeitos do BPA ou nitro-BPA em células HL-60, MCF-7 e tecidos de ratos. Células HL-60 foram expostas ao BPA ou nitro-BPA nas concentrações de 25, 100 e 250 &#181;M (0,1 % DMSO v/v) por 2, 24 ou 48 horas na presença ou ausência de H2O2 (40 nmol/5 x 104 células). Células MCF-7 foram expostas da mesma forma, sem o uso de H2O2, mas na presença e ausência de agonista (PCB) de receptor Ah. Ratos Sprague-Dawley machos receberam BPA diariamente ao longo de 4 semanas (50 mg/kg de peso corpóreo) por gavagem, na vigência e ausência de diabetes, com subsequente coleta de urina, fígado, rins, medula óssea e sangue. Nos experimentos com as células, a viabilidade, ciclo celular, fragmentação do DNA e a produção intracelular de espécies reativas de oxigênio (ROs) foram avaliadas por citometria de fluxo, a atividade da cadeia respiratória mitocondrial pelo ensaio do XTT, e a atividade de MPO de células HL-60 por ensaio de fluorescência, bem como a produção de &#8226;NO. A metilação e hidroximetilação global do DNA e os adutos 8-oxodG, CEdG, 1,N6-&#949;dA, 1,N2-&#949;dG e BPA-Gua no DNA das células, tecidos, meio de cultura e urina foram analisados por HPLC-ESI-MS/MS. O hemograma e mielograma dos animais foram obtidos no Laboratório de Hematologia Experimental da FCF USP. Observou-se que tanto BPA quanto nitro-BPA induziram a geração de ROS em células HL-60 logo após 2h de incubação. BPA levou subsequentemente à perda de atividade da cadeia respiratória mitocondrial, aumento da permeabilidade da membrana plasmática, fragmentação do DNA, parada na fase G2/M do ciclo celular e hipermetilação acompanhada de hipohidroximetilação global do DNA. A citotoxicidade induzida pelas mesmas concentrações de nitro-BPA em células HL-60 foi menos pronunciada, sem perda de atividade da cadeia respiratória mitocondrial, com pouca fragmentação do DNA, mas com parada na fase G0/G1 do ciclo celular e indução de hipohidroximetilação global do DNA na presença de H2O2. Não foi observada a indução de adutos de DNA nas células HL-60 incubadas com BPA, mas sim de CEdG nas células incubadas com nitro-BPA. Os dados obtidos a partir da exposição das células HL-60 a BPA e nitro-BPA nos indicam que as duas moléculas provocam alterações metabólicas distintas nesse tipo celular, independentes da via estrogênica, que levam a alterações predominantemente epigenéticas (BPA) ou genéticas e epigenéticas (nitro-BPA), que podem ter consequências fenotípicas, como progressão maligna, que precisam ser investigadas. Foi observado que as células MCF-7 são mais resistentes que as células HL-60 à citotoxicidade induzida por BPA e nitro-BPA. Como resultado da exposição das células MCF-7 a BPA, houve pequeno aumento da permeabilidade da membrana plasmática (250 &#181;M), indução dos níveis de ROS após 24 h (25 &#181;M) e aumento da população de células em sub G1, ou seja, com DNA fragmentado (100 &#181;M e 250 &#181;M), mas sem alteração do ciclo celular. No caso de nitro-BPA, foi observada parada do ciclo celular em G2/M (25 &#181;M, 100 &#181;M e 250 &#181;M), assim como aumento de permeabilidade da membrana plasmática após 24 h de incubação (25 &#181;M, 250 &#181;M), sem indução de ROS ou aumento de células em sub G1. Entretanto, observou-se aumento dos níveis de CEdG e 8-oxodG no DNA das células incubadas com BPA (100 &#181;M, 250 &#181;M) sem a ativação prévia de receptores Ah. A ativação dos receptores Ah com PCB levou a menor aumento do nível das lesões após as incubações com BPA. A maior resistência das células MCF-7 aos efeitos citotóxicos do BPA está provavelmente relacionada à ação estrogênica desse xenobiótico. A sinalização estrogênica juntamente com o aumento dos níveis de lesões no DNA aumenta a chance de mutações e de transformação maligna. Nas células com ativação do receptor Ah, BPA levou ainda ao aumento da hidroximetilação global, sem alteração da metilação global do DNA. Os animais não diabéticos expostos ao BPA apresentaram quantidades diminuídas de promielócitos, blastos e bastonetes na medula óssea (aplasia medular), sem alteração no hemograma. Houve aumento dos níveis de CEdG no fígado, da metilação e hidroximetilação global do DNA hepático, e não foi observada alteração das marcas epigenéticas e adutos de DNA no rim ou na urina. Os animais diabéticos expostos ao BPA apresentaram aumento do número de eosinófilos e linfócitos na medula óssea, podendo-se sugerir a indução de um estado inflamatório alérgico, e aumento do número total de hemácias circulantes e do hematócrito. Houve aumento dos níveis de CEdG, da metilação e hidroximetilação global do DNA hepático, aumento dos níveis de 8-oxodG no DNA renal, sem alteração das marcas epigenéticas no rim, e não foi observada alteração dos adutos de DNA na urina. Os dados obtidos apontam para a geração de ROS como uma importante via de cito- e genotoxicidade induzidas por BPA. Sua biotransformação para BPA-3,4- quinona nos modelos utilizados parece ter menor importância para os efeitos, uma vez que não foi detectada a lesão BPA-Gua em nenhuma amostra de DNA, meio de cultura das células ou urina dos animais. Alterações metabólicas induzidas por BPA e ROS podem favorecer as alterações das marcas epigenéticas observadas no DNA das células HL-60, MCF-7 e fígado dos animais. Todas essas alterações podem contribuir para a transformação maligna de células expostas ao BPA. / Bisphenol A (BPA) is a compound widely used in polycarbonate plastic production and widespread in the environment, humans are chronic exposed to BPA in intrauterine period and entire life. The literature suggests the possibility of BPA increase the risk of developing cancers, but studies are required to enable the understanding of mechanisms by which this can occur. HL -60 cells were exposed to BPA or nitro-BPA at concentrations of 25, 100 and 250 uM (0.1% DMSO v/v) for 2, 24 or 48 hours in presence or absence of H2O2 (40 nmol/5x104 cells), MCF-7 cells followed a similar profile of exposure without the use of H2O2, but in presence or absence of Ah agonist receptor (PCB126). Male Sprague-Dawley rats received BPA daily over 4 weeks (50 mg/kg body weight) by gavage in presence and absence of diabetes, with subsequent collection of urine, liver, kidney, bone marrow and circulating blood. The viability, cell cycle, DNA fragmentation and the intracellular production of reactive oxygen species (ROS) was evaluated by flow cytometry, MPO activity and NO production was evaluated by fluorescence assay for HL- 60 cells, mitochondrial activity by XTT assay, and the global DNA methylation was checked by HPLC-PDA. DNA adducts 8-oxodG, CEdG, 1,N6-&#949;dA, 1,N6-&#949;dG and BPA-Gua were quantified by HPLC- ESI-MS/MS in DNA of cells, culture medium, urine and tissue collected from Sprague-Dawley rats. Blood count and bone marrow examination were obtained in collaboration with Experimental Hematology Laboratory of University of Sao Paulo We observed that both BPA and BPANO2 induced ROS generation in HL- 60 cells after 2 hours of incubation. BPA subsequently led to failure of mitochondrial respiratory chain activity, increased permeability of the plasma membrane, DNA fragmentation, arrest in G2/M phase of cell cycle, DNA hypermethylation with global hipohydroxymethylation. We saw low cytotoxicity in HL-60 cells induced by nitro-bpa n the same concentration, without loss of mitochondrial respiratory chain activity, discrete DNA fragmentation, but leading cell cycle to stopping at G0/G1 phase, and induction of DNA global hypermethylation. No lesions were observed in the DNA of HL-60 cells.The results obtained from the exposure of HL-60 cells to BPA and nitro-BPA indicate that these two molecules induce different metabolic abnormalities in this cell line, independent of estrogen pathway, leading to changes in epigenetic (BPA) or genetic and epigenetic (nitro-BPA) profile, that can induce phenotypic consequences such as malignant progression. It was observed along the study that MCF-7 cells are more resistant than HL-60 cells to cell damage induced by BPA and nitro-BPA. As a result of MCF-7 cells exposure to BPA, we saw a slight increase in membrane permeability (250 mM), ROS generation after 24h (25 mM) and increase in cell population in sub G1, so we had DNA fragmentation (100 uM and 250 uM), but with no effect on cell cycle. However, we observed increased levels of CEdG and 8-oxodG on DNA of cells incubated with BPA (100 uM, 250 mM) without prior activation of Ah receptors. The activation of Ah receptors with PCB took a small increase in the level of DNA lesions after incubations with BPA. MCF-7 cells resistance to the cytotoxic effects of BPA is probably related to estrogen action of this compound. Estrogen signaling in addition with the increased levels of DNA damage increases the chance of mutations and malignant transformation. In cells with Ah receptor activation, BPA also led to increased DNA global hydroxymethylation, without changing the global DNA methylation. Nondiabetic animals exposed to BPA had decreased amounts of promyelocytes, blasts and rods in the bone marrow, with any change in blood count. There were an increase of CEdG levels in liver, methylation and global hydroxymethylation on hepatic DNA, and was observed any alteration on epigenetic markers and DNA adducts in kidney or urine. On the other hand diabetic animals exposed to BPA showed increased numbers of eosinophils and lymphocytes in bone marrow, suggesting the induction of an allergic inflammatory state. There were increased levels of CEdG, methylation and global hydroxymethylation on hepatic DNA, increased 8-oxodG levels on kidney DNA without changing epigenetic markers, was not observed DNA adducts in urine. The data obtained indicate that the generation of ROS could be the major route of cytotoxic and genotoxic induced by BPA exposure. BPA biotransformation to BPA-3,4-quinone used in the models seem to have poor effects, since we was not detected BPA-Gua lesion in any DNA sample, culture medium of cells or urine of the animals. Metabolic changes induced by BPA and ROS can enable changes in epigenetic markers observed in the DNA of HL-60 cells, MCF-7 and liver tissue. All these changes may contribute to malignant transformation of cells that were exposed to BPA.

L'ypérite est une arme chimique de guerre de la famille des vésicants. Sa facilité de synthèse et l'existence de stocks importants dans le monde en font une menace à la fois pour les populations civiles et les militaires. Cette menace est renforcée par le fait qu'à l'heure actuelle il n'existe pas d'antidote efficace contre ce toxique de guerre. L'alkylation de l'ADN par l'ypérite aboutit à la formation d'adduits. L'objectif de cette thèse a consisté à mettre au point une méthode de détection quantificative de ces adduits par chromatographie liquide haute performance couplée à la spectrométrie de masse en tandem (HPLC-MS/MS) et d'appliquer cette méthode à l'étude de leur formation et de leur persistance après une exposition cutanée chez la souris SKH-1. Les résultats ont montré dans la peau exposée que la fréquence des adduits était maximale dès 6h post-exposition. Toutefois, leur persistance était relativement longue puisqu'ils étaient toujours détectables 3 semaines après exposition. Une diffusion radiale de l'ypérite a été mise en évidence par la détection des adduits qu'elle forme dans des échantillons de peau non directement exposés. Les adduits ont été également détectés dans plusieurs organes internes. La fréquence maximale des adduits a été mesurée 6h ou J1 post-exposition. Ils ont été décelés jusque J21 post-exposition. Les résultats ont montré qu'il se formait plus d'adduits dans le cerveau et les poumons que dans les reins, la rate et le foie. La persistance des adduits dans le cerveau et les poumons était moindre après la détersion de la peau exposée, illustrant ainsi la constitution dans cette dernière d'un réservoir d'ypérite. La mesure des activités de réparation de l'ADN a montré que l'ypérite exerçait une double action génotoxique, à savoir formation de dommages à l'ADN et inhibition des activités de réparation. / Sulphur mustard is a chemical warfare which belongs to the vesicants family. Its easy synthesis and the existence of important stocks in the world make it a threat for both the general population and militaries. This threat is reinforced by the fact that currently there is not efficient antidote against this war toxic. DNA alkylation by sulphur mustard leads to adducts formation. The objective of this thesis consisted in developing a method of quantification of these adducts by high performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) and to apply this method to the study of the formation and persistence of the adducts after cutaneous exposure in SKH-1 mouse. Results have shown in exposed skin that adducts frequency was maximal as soon as 6h post-exposure. A radial diffusion of sulphur mustard was highlighted by the detection of adducts it forms in skin samples non-directly exposed. Adducts were also detected in several internal organs. Maximal frequency was measured at 6h or d1 post-exposure. They were detected until d21 post-exposure. Results have shown that adducts were produced in larger amount in brain and lungs than in kidneys, spleen and liver. The persistence of adducts was lower in brain and lungs after the detersion of exposed skin, thus illustrating the constitution of a reservoir of sulphur mustard in this tissue. Measurement of DNA repair activities showed that suilphur mustard behave as a two-edge sword genotoxic, namely formation of DNA damages and inhibition of repair activities.