Os adenomas hipofisários podem ser tratados clinicamente com agonistas dopaminérgicos (AD) e/ou ligantes dos receptores de somatostatina (LRS). Alguns estudos apontam para o papel de polimorfismos dos genes DRD2, SSTR2 e SSTR5 na eficácia desses tratamentos clínicos. O objetivo do estudo foi avaliar o papel dos polimorfismos no gene DRD2 em pacientes com prolactinomas (n=118), corticotrofinomas (n=15), adenomas clinicamente não funcionantes (ACNF) (n=35) e somatotrofinomas (n=40), bem como de polimorfismos nos genes SSTR2 e SSTR5 em pacientes com somatotrofinomas (n=88), na resposta ao tratamento clínico com AD e LRS. Adicionalmente, comparar a frequência desses polimorfismos em pacientes portadores de adenomas hipofisários, de diferentes naturezas, a indivíduos saudáveis. Os polimorfismos foram genotipados por PCR em tempo real (sistema TaqMan) e seqüenciamento automático (método Sanger). Todos os genótipos estavam em equilíbrio de Hardy-Weinberg. Em nosso estudo, não houve correlação entre os polimorfismos de DRD2, SSTR2 e SSTR5 e a resposta ao tratamento clínico, com cabergolina (CAB) e/ou octreotida-LAR (OCT-LAR) respectivamente, em pacientes com prolactinomas, somatotrofinomas e corticotrofinomas. Nossos dados estão de acordo com estudos prévios em acromegálicos, no entanto não confirmaram associação de polimorfismo de DRD2 (rs6275) com resistência à CAB, anteriormente descrita em prolactinomas. Adicionalmente, os polimorfismos rs1800497 (alelo T) e rs1076560 (alelo A) de DRD2 foram correlacionados a macroadenomas, este último fator preditivo de resistência à CAB em prolactinomas. Quanto aos ACNF, nossos dados são inéditos e o polimorfismo rs6275 (alelo T) de DRD2 se correlacionou à progressão tumoral nos casos tratados com CAB. Comparando os adenomas hipofisários com indivíduos saudáveis, a presença do alelo raro A de rs1079597 de DRD2 foi inversamente associada à frequência de ACNF, enquanto que nos outros tipos tumorais não houve diferença. Em conclusão, os polimorfismos rs1079597 e rs6275 de DRD2 podem estar associados à tumorigênese e à resposta a CAB, no grupo ACNF respectivamente. Outros estudos ainda são necessários para definir o papel das variantes genéticas desses genes como um mecanismo envolvido na resistência aos AD e LRS e na tumorigênese hipofisária / Medical treatment of pituitary adenomas is mainly performed with dopamine agonist (DA) and/or somatostatin ligant receptor (SLR) drugs. In addition to dopamine receptor 2 (DRD2) and somatostatin receptors 2 and 5 (SSTR2 and SSTR5) tumor density, results of some studies pointed to the role of polymorphisms in the efficacy of clinical treatment. One of the goals of this study was to evaluate the association between DRD2 polymorphisms in patients with prolactinomas (n=118), corticotrophinomas (n=15), clinically nonfunctioning pituitary adenomas (CNFPA) (n=35) and somatotrophinoma (n=101) and polymorphisms in STTR2 and SSTR5, only in the last group; and response to treatment with DA and/or SLR. Another objective was to evaluate the frequency of polymorphisms in patients with different types of pituitary adenomas and compare them to healthy subjects. Polymorphisms were genotyped by real-time PCR (TaqMan system) and Sanger sequencing. All genotypes were in Hardy-Weinberg equilibrium. In patients with prolactinomas, somatotrophinomas and corticotrophinomas there was no association between genetic variants in DRD2 and response to treatment, like data in literature. However, an association between rs6275 (allele T) in DRD2 and CAB resistance in prolactinomas has been proposed. In addition, there was an association betweenrs1800497 (allele T) and rs1076560 (alelle A) in DRD2 and macroprolactinomas, this one predictive factor related to CAB resistance. The presence of rs6275 (allele T) in DRD2 was correlated with tumoral progression in CNFPA treated with CAB, never published previously. Comparing pituitary adenomas and health subjects, the presence of rs1079597 (allele A) was inversely associated with the frequency of CNFPA, otherwise there was no association for others pituitary adenomas. In conclusion, rs1079597 and rs6275 DRD2 polymorphisms might have an influence in tumorigenesis and CAB efficacy in patients with CNFPA, respectively. However, the results in the literature are conflicting and more studies are necessary to determine the role of these genetic variants like a mechanism involving in dopamine and somatostatin resistance and pituitary tumorigenesis

Adenomas hipofisários são tumores benignos, de crescimento lento, originados no interior da sela túrcica e constituem de 10% a 15% dos tumores intracranianos, Os adenomas clinicamente não funcionantes (ACNF), correspondem aproximadamente um terço dos adenomas em geral. Por não apresentarem síndrome clínica hormonal são geralmente diagnosticados devido a sintomas neurológicos ou oftalmológicos, como macroadenomas, com grandes dimensões, invasão de estruturas circunvizinhas e hipopituitarismo. A cirurgia é o tratamento de escolha para estes tumores e apesar de ser eficaz na resolução do quadro compressivo, a possibilidade de cura cirúrgica é reduzida principalmente em tumores invasivos. Seu acompanhamento pós-operatório é efetuado por exame de imagem, preferencialmente ressonância magnética, devido à indisponibilidade de marcadores séricos. Nesta pesquisa avaliou-se a relação da expressão dos genes relacionados à apoptose, Bcl-2, Bax e Caspase-3 e sua relação com o comportamento dos ACNF. Na Divisão de Neurocirurgia Funcional do Instituto de Psiquiatria do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo foram operados 119 doentes com tumores hipofisários, de 28/05/08 à 07/04/09, 50 deles com ACNF, 30 deles foram estudados. A ressonância magnética da região selar pré-operatória possibilitou a medida dos três maiores diâmetros do tumor, ou seja, antero-posterior (AP), crânio-caudal (CC), látero-lateral (LL) e avaliar a invasão do seios cavernoso e esfenoidal. O tamanho dos tumores foi avaliado pela soma dos três diâmetros, pelo maior diâmetro e pelo cálculo do volume, efetuado pela fórmula AP x CC x LL x 0,5. No intraoperatório foram avaliados, a consistência e invasão tumoral. A análise histológica por hematoxilina-eosina, foi efetuada em todos os tumores, assim como a análise imuno-histoquímica (IHQ) dos hormônios hipofisários, Ki-67, p53 e Bcl-2. Foi realizada a análise molecular dos genes Bcl-2, Bax e Caspase-3 por RT-PCR. Dados demográficos: 17 do sexo masculino, 13 do sexo feminino, mediana da idade foi de 54,5 anos e mediana da duração dos sintomas de 31 meses. Todos apresentavam macroadenoma, 87% deles com perda visual, 53% com cefaléia, 17% com outras alterações neurológicas e um assintomático diagnosticado incidentalmente. Avaliação hormonal, disponível em 26 doentes, confirmou deficiência em 92% deles, com mais de dois eixos acometidos em 50% dos casos. A mediana do volume dos tumores foi de 11,6 cm3, do maior diâmetro de 3,8cm e da soma dos três diâmetros de 8,6cm, observou estreita correlação significativa estatisticamente entre as três medidas. Quarenta porcento dos tumores eram gigantes (diâmetro maior ou igual a 4 cm). Consistência amolecida e invasão tumoral foram observadas em 87% e 67% dos tumores, respectivamente. Todos doentes foram operados pela via transesfenoidal, exceto um operado por craniotomia pterional. Complicações cirúrgicas ocorreram em cinco pacientes, três com fistula liquórica, dois com meningite e dois óbitos. A análise histológica confirmou o diagnóstico de adenoma hipofisário em todos os casos. A IHQ foi negativa para todos hormônios em 18 e positiva em 12 tumores (TSH, FSH, LH, GH ou ACTH). A IHQ para proteína P-53 foi negativa em todos os casos. A IHQ para KI-67 revelou ausência da proteína em 11, positividade em menos de 3% das células em 15 e em mais de 3% em 4 tumores. A IHQ para Bcl-2 foi positiva em apenas três pacientes. A análise molecular dos genes Bcl-2, Bax e Caspase-3 revelou expressão muito inferior nos tumores em relação à observada para um pool de hipófise normal. Observou-se correlação positiva estatisticamente significante entre os três genes porém não foi observada correlação entre os níveis destes três genes e nenhum fator de prognóstico tumoral estudado, quais sejam, idade, positividade para hormônios na IHQ, tamanho ou invasão tumoral / Pituitary adenomas are benign, slow-growing tumors that arise in the sella turcica and account for 10% to 15% of all intracranial tumors. Non-functioning pituitary adenomas (NFPA) account for around one third of all pituitary adenomas. NFPA do not clinically present as hormonal syndromes and are generally diagnosed as macroadenomas due to marked neurological and ophthalmologic symptoms and invasion of surrounding structures, beside hypopituitarism. Surgery is the gold standard to treat these tumors. It effectively relieves compressive symptoms but cure is uncommon. Despite benign in nature, NFPA usually show aggressive behavior. There are no hormonal markers and the follow-up usually is made only by magnetic resonance imaging. Apoptosis-related genes, Bcl-2, Bax, and caspase-3, were here studied in NFPA to assess their role as potential markers of tumor behavior. Out of 119 patients with pituitary adenomas treated by surgery, 30 patients (17 men, 13 women, median age 54.5 years old) harboring NFPA who underwent surgery in the Department of Functional Neurosurgery at Hospital das Clínicas Psychiatric Institute, University of S. Paulo Medical School, from August 2008 to July 2009, were studied. Information on gender, age, pituitary function, symptoms and their length was collected. Tumor dimensions were measured using magnetic resonance imaging of the sella turcica. The tumor volume was calculated by the following equation: anterior-posterior diameter x cranial-caudal diameter x lateral-lateral diameter x 0.5. Intra-operative information such as tumor invasion and consistence was recorded. Histological examination by hematoxylin-eosin staining and immunohistochemistry analysis of pituitary hormones, Ki-67, p53, and Bcl-2 were performed. The molecular analysis of Bcl-2, Bax, and caspase-3 genes was performed by real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) in all tumor specimens collected during surgery and compared to a poll of normal pituitary gland. All patients had macroadenomas diagnosed due to visual loss (87%), headache (53%) and other neurological symptoms (17%) and one case was incidentally found. Hormonal deficits were seen in 92% of 26 cases; more than two axes were involved in half of these patients. There was found good correlation between tumor volume, largest diameter and the sum of the 3 diameters, and tumor volume was used to assess the correlations with other parameters. The median volume was 11.6 cm3. Giant tumors (4 cm) were diagnosed in 40% of the patients. Soft tumors and tumor invasion were observed in 87% and 67% of cases, respectively. A transsphenoidal approach was used in all patients, except one who had pterional craniotomy. Five patients presented post-operative complications: three had CSF leakage, two meningitis and two died. The histological examination confirmed pituitary adenoma in all cases, 18 of them were null cell and 12 showed a positive immunohistochemistry analysis for one or more hormones, mainly TSH. Immunohistochemistry analysis results for p-53 was negative in all cases; for Ki-67 was negative in 11, positive in less than 3% of the cells in 15 and positive in more than 3% of the cells in 4 cases; and for Bcl-2 was positive only in three patients. Bcl-2, Bax and caspase-3 molecular analysis revealed very low expression compared to normal pituitary values. There was found a positive correlation between these three genes but no correlation between them and age, tumor volume or invasion. The Bcl-2, Bax, and caspase-3 gene analysis by RT-PCR in NFPA did not evidence their potential as markers of tumor behavior

INTRODUÇÃO: Os adenomas hipofisários são neoplasias benignas que representam cerca de 15% das neoplasias intracranianas. Em sua maioria ocorre de forma esporádica. Estudos moleculares desses adenomas identificaram anormalidades genéticas que podem ter um papel na sua tumorigênese. Dentre alguns desses genes foram descritos os oncogenes GNAS e PTTG e os genes supressores tumorais AIP, CDKN1B e MEG3. OBJETIVO: realizar estudo molecular dos genes associados a tumorigênese através da pesquisa de mutações nos genes GNAS, AIP e CDKN1B e o estudo de expressão gênica de CDKN1B, PTTG e MEG3 em adenomas aparentemente esporádicos, correlacionando com os dados clínicos e laboratoriais, em pacientes acompanhados no serviço de Endocrinologia do HCFMUSP. CASUÍSTICA E MÉTODOS: Compreendeu 96 adenomas hipofisários aparentemente esporádicos: 41 somatotropinomas, 27 corticotropinomas, 21 adenomas clinicamente não funcionantes (ACNF) e 7 prolactinomas. Foi realizada avaliação restrospectiva dos dados clínicos e laboratoriais ao diagnóstico. Após a análise histológica por hematoxilinaeosina, foi realizada análise imunohistoquímica das proteínas Ki-67 e p53 e molecular do DNA genômico e RNA, extraídos do tecido tumoral. Análise mutacional das regiões codificantes de AIP e CDKN1B e dos hotspots de GNAS nos éxons 8 e 9 foi realizada através de amplificação por PCR e sequenciamento automático. A quantificação relativa do RNAm de CDKN1B, MEG3 e PTTG foi avaliada pelo método de 2-??Ct por PCR em tempo real. RESULTADOS: Presença de mutações somáticas no gene GNAS (gsp+) em 14,5% dos adenomas. Não houve diferenças significativas clínicas e laboratoriais entre os adenomas gsp+ e gsp-. Variantes com potencial patogênico não foram identificadas nos genes AIP e CDKN1B. A análise imunohistoquímica do Ki-67 apresentou média de 1,32% (0,9-4,5) e do p53 média de 1,04 (1,0-1,8). O gene CDKN1B apresentou expressão média de ,12 ± 0,74 (0,1-3,1), com expressão mais baixa nos corticotropinomas. O gene PTTG apresentou expressão média de 2,49 ± 3,10 (0,2-19,0), com maior expressão nos corticotropinomas. O gene MEG3 apresentou expressão média de 0,95 ± 1,38 (0,0-8,8), com valores mais baixos nos ACNF. Três padrões de cluster nos níveis de expressão de RNAm dos genes CDKN1B, PTTG e MEG3 foram identificados: cluster A = CDKN1B >= 1,85/ PTTG >= 1,25/ MEG3 >= 0,65 foi observado em 100% dos corticotropinomas; cluster B= CDKN1B >= 0,95/ PTTG >= 2,25/ MEG3 >= 0,65 observado apenas nos somatotropinomas (32%) e o cluster C= CDKN1B >= 0,95/ PTTG >= 1,25/ MEG3 >= 0,05 observado na maioria dos ACNF (73%). CONCLUSÕES: A maioria dos adenomas apresentaram índices de Ki-67 menor do que 3%. Em conformidade com este achado, a imunohistoquímica para p53 não se mostrou estatisticamente significativa. A mutação ativadora na proteína Gs? (gsp+) foi a mutação mais frequente em adenomas hipofisários esporádicos, principalmente em somatotropinomas. Não foram identificadas variantes com potencial patogênico nos genes AIP e CDKN1B, portanto, parece ser um evento raro em adenomas esporádicos. A expressão gênica aumentada do gene PTTG foi identificada principalmente nos corticotropinomas. No entanto, ela não foi preditiva de subtipo de adenoma. A expressão gênica do CDKN1B estava diminuída na maioria dos corticotropinomas e normal na maioria dos somatotropinomas e ACNF. A expressão gênica do MEG3 estava diminuída na maioria dos adenomas ACNF e corticotropinomas e normal na maioria dos somatotropinomas. Na análise de cluster hierárquico, foram identificados três padrões de expressão gênica que se correlacionaram com subtipo de adenoma hipofisário / BACKGROUND: Pituitary adenomas are benign tumors that account for about 15% of intracranial tumors. Mostly occurs sporadically. Molecular studies of these adenomas identified genetic abnormalities that may have a role in tumorigenesis. Some of these genes have been described as the oncogenes GNAS and PTTG and tumor suppressor genes AIP, CDKN1B and MEG3. OBJECTIVE: perform a molecular study of genes related in tumorigenesis to evaluate presence of mutations in GNAS, AIP and CDKN1B genes and gene expression analysis of CDKN1B, PTTG and MEG3 genes in apparently sporadic adenomas, correlating with the clinical and laboratory data from patients treated at the Endocrinology service of HCFMUSP.SUBJECTS AND METHODS: 96 apparently sporadic adenomas was included: 41 somatotropinomas, 27 corticotropinomas, 21 clinically nonfunctioning pituitary adenomas (NFPA) and seven prolactinomas. Retrospective evaluation of clinical and laboratory data from diagnosis. After histological analysis by hematoxylin-eosin staining, it was performed immunohistochemical analysis of Ki -67 and p53 proteins and molecular analysis of genomic DNA and RNA extracted from tumor tissue. Mutational analysis of coding regions of AIP and CDKN1B and hotspots exons 8 and 9 of GNAS was performed by PCR and automatic sequencing. Relative quantification of mRNA CDKN1B, MEG3 and PTTG was evaluated by 2-??Ct method using Real Time PCR. RESULTS: Presence of somatic mutations on GNAS gene (gsp+) in 14,5% of pituitary adenomas. There were no clinical and laboratorial differences between gsp+ and gsp- somatotropinomas. Variants with pathogenic potencial were not identified in AIP and CDKN1B genes. Imunohistochemical analysis showed mean of 1,32% (0,9-4,5) for Ki-67 and mean of 1,04% (1,0-1,8) for p53. Gene expression of CDKN1B presented a mean of 1,12 ± 0,74 (0,1-3,1) with lower expression in corticotropinomas. Gene expression of PTTG presented a mean of 2,49 ± 3,10 (0,2-19,0) with higher expression in corticotropinomas. Gene expression of MEG3 presented a mean of 0,95 ± 1,38 (0,0-8,8) with lower expression in NFPA. Three cluster patterns in the levels of mRNA expression of genes CDKN1B, PTTG and MEG3 were identified: cluster A = CDKN1B >= 1,85/ PTTG >= 1,25/ MEG3 >= 0,65 observed in 100% of corticotropinomas; cluster B= CDKN1B >= 0,95/ PTTG >= 2,25/ MEG3 >= 0,65 observed only in somatotropinomas (32%) and cluster C= CDKN1B >= 0,95/ PTTG >= 1,25/ MEG3 >= 0,05 observed in most of NFPA (73%). CONCLUSIONS: Most of the adenomas showed Ki -67 index lower than 3%. In accordance with this finding, immunohistochemistry for p53 was not statistically significant. The activating mutation in the Gs? protein (gsp+) was the most common mutation in sporadic pituitary adenomas, particularly in somatotropinomas. Variants with pathogenic potential have not been identified in the AIP and CDKN1B gene therefore seems to be a rare event in sporadic adenomas. Increased gene expression of PTTG was primarily identified in corticotropinomas. However, it was not predictive of adenoma subtype. The gene expression of CDKN1B was decreased in most corticotropinomas and normal in most somatotropinomas and NFPA. The gene expression of MEG3 was decreased in most of NFPA and corticotropinomas, and normal in most somatotropinomas. In hierarchical cluster analysis was identified three patterns of gene expression that correlated with pituitary adenoma subtype

A acromegalia é doença insidiosa e desfigurante caracterizada por um crescimento desproporcional dos ossos das mãos, pés e do crânio devido à exposição crônica a altos níveis de hormônio de crescimento (GH) e de seu efetor insuline growth factor 1 (IGF-1). Trata-se de uma doença rara, com incidência estimada de 3-4 casos por milhão, com prevalência de aproximadamente 50 casos por milhão de pessoas. A principal causa da acromegalia é a presença de um tumor hipofisário secretor de GH (somatotropinoma). Caso o somatotropinoma ocorra durante a infância ou adolescência, antes do fechamento das epífises dos ossos longos, a criança crescerá longitudinalmente de forma descontrolada, caracterizando a forma clínica gigantismo. Na grande maioria dos casos a acromegalia se apresenta na forma esporádica, entretanto casos familiais da doença podem ocorrer associados à Neoplasia Endócrina Múltipla tipo 1 (NEM-1), ao complexo de Carney (CNC) e à acromegalia familial isolada (IFS). Os genes responsáveis pela NEM-1 (MEN1) e CNC (PRKAR1A) foram clonados há mais 10 anos, entretanto etiologia molecular da IFS permaneceu desconhecida até recentemente. Vierimaa et al. (2006) combinaram estudos de ligação por análise de polimorfismos e estudos de expressão gênica e identificaram mutações no gene AIP em famílias com acromegalia não-NEM-1 e não-CNC; além de perda de heterozigose (LOH) nos somatotropinomas dos pacientes com mutação AIP. No presente estudo, investigamos o gene AIP em três famílias brasileiras com IFS e em seus tumores (hipofisários e não-hipofisários). Descrevemos uma nova mutação AIP (Y268X) em uma família brasileira com IFS, confirmando o papel desse novo gene na predisposição a tumores hipofisários. A partir de dados gerados em uma extensa revisão da literatura, sugerimos que os tumores hipofisários familiais isolados são doenças multigênicas que possuiriam um gene principal, mas que sofreriam influência de outros genes/loci ainda pouco caracterizados. Assim, investigamos também o envolvimento de diversos genes/loci candidatos (SSTR2, SSTR5, CDKN1B, AHR, PRKAR1A, PTTG, PROP1, MEG3, RB1 e 2p16) como possíveis moduladores do fenótipo na IFS. Nossos dados sugerem que além da mutação AIP, há necessidade da co-segregação de marcadores localizados em regiões com potencial oncogênico para o desenvolvimento da doença hipofisária. Também apresentamos nesta Tese as primeiras análises de tumores nãohipofisários em pacientes com mutação AIP e encontramos evidências do possível envolvimento de AIP na tumorigênese de um carcinoma funcionante do córtex adrenal de paciente com IFS. / Acromegaly is a rare disfigurating and insidious disease characterized by enlargement of hands, feet and skull bones due to excess of growth hormone (GH) secreted by a pituitary tumor (somatotropinoma). The majority of the cases with acromegaly is sporadic, however it may occur in association with inherited disorders as Multiple Endocrine Neoplasia type 1 (MEN1), Carney complex (CNC) and Isolated Familial Somatotropinoma (IFS). The genes associated with MEN1 syndrome (MEN1) and CNC (PRKAR1A) have been described more than a decade ago, however until very recently the molecular etiology of IFS remained unknown. Using a combined strategy of single nucleotide polymorphism (SNP) analysis and gene expression analysis, Vierimaa et al. (2006) described mutations in the AIP gene occurring in families with acromegaly not associated with MEN1 and CNC. In the current study, we investigated three Brazilian families with IFS and were able to describe two germline mutations in the AIP gene, confirming the role of this new gene in the predisposition to familial somatotropinoma. We revised the literature of genetic studies of isolated pituitary adenoma syndromes, which indicated a genetic heterogeneity as well as possible multigenic inheritance for these diseases. Thus, we investigated the role of several genes/loci (SSTR2, SSTR5, CDKN1B, AHR, PRKAR1A, PTTG, PROP1, MEG3, RB1 and 2p16) selected as potentially acting as phenotypic modulators in IFS. Our data indicate that AIP-mutated patients are prone to pituitary disease, however it is necessary the co-segregation of markers located at oncogenic regions to the development of the pituitary tumors and manifestation of the disease. Herein, we also present the first somatic analysis of non-pituitary tumors of AIP-mutated patients. A potential role of AIP, which is implicated in the cAMP pathway, could not be excluded in the development of an adrenocortical carcinoma.

INTRODUÇÃO: Os adenomas hipofisários são neoplasias benignas que representam cerca de 15% das neoplasias intracranianas. Em sua maioria ocorre de forma esporádica. Estudos moleculares desses adenomas identificaram anormalidades genéticas que podem ter um papel na sua tumorigênese. Dentre alguns desses genes foram descritos os oncogenes GNAS e PTTG e os genes supressores tumorais AIP, CDKN1B e MEG3. OBJETIVO: realizar estudo molecular dos genes associados a tumorigênese através da pesquisa de mutações nos genes GNAS, AIP e CDKN1B e o estudo de expressão gênica de CDKN1B, PTTG e MEG3 em adenomas aparentemente esporádicos, correlacionando com os dados clínicos e laboratoriais, em pacientes acompanhados no serviço de Endocrinologia do HCFMUSP. CASUÍSTICA E MÉTODOS: Compreendeu 96 adenomas hipofisários aparentemente esporádicos: 41 somatotropinomas, 27 corticotropinomas, 21 adenomas clinicamente não funcionantes (ACNF) e 7 prolactinomas. Foi realizada avaliação restrospectiva dos dados clínicos e laboratoriais ao diagnóstico. Após a análise histológica por hematoxilinaeosina, foi realizada análise imunohistoquímica das proteínas Ki-67 e p53 e molecular do DNA genômico e RNA, extraídos do tecido tumoral. Análise mutacional das regiões codificantes de AIP e CDKN1B e dos hotspots de GNAS nos éxons 8 e 9 foi realizada através de amplificação por PCR e sequenciamento automático. A quantificação relativa do RNAm de CDKN1B, MEG3 e PTTG foi avaliada pelo método de 2-??Ct por PCR em tempo real. RESULTADOS: Presença de mutações somáticas no gene GNAS (gsp+) em 14,5% dos adenomas. Não houve diferenças significativas clínicas e laboratoriais entre os adenomas gsp+ e gsp-. Variantes com potencial patogênico não foram identificadas nos genes AIP e CDKN1B. A análise imunohistoquímica do Ki-67 apresentou média de 1,32% (0,9-4,5) e do p53 média de 1,04 (1,0-1,8). O gene CDKN1B apresentou expressão média de ,12 ± 0,74 (0,1-3,1), com expressão mais baixa nos corticotropinomas. O gene PTTG apresentou expressão média de 2,49 ± 3,10 (0,2-19,0), com maior expressão nos corticotropinomas. O gene MEG3 apresentou expressão média de 0,95 ± 1,38 (0,0-8,8), com valores mais baixos nos ACNF. Três padrões de cluster nos níveis de expressão de RNAm dos genes CDKN1B, PTTG e MEG3 foram identificados: cluster A = CDKN1B >= 1,85/ PTTG >= 1,25/ MEG3 >= 0,65 foi observado em 100% dos corticotropinomas; cluster B= CDKN1B >= 0,95/ PTTG >= 2,25/ MEG3 >= 0,65 observado apenas nos somatotropinomas (32%) e o cluster C= CDKN1B >= 0,95/ PTTG >= 1,25/ MEG3 >= 0,05 observado na maioria dos ACNF (73%). CONCLUSÕES: A maioria dos adenomas apresentaram índices de Ki-67 menor do que 3%. Em conformidade com este achado, a imunohistoquímica para p53 não se mostrou estatisticamente significativa. A mutação ativadora na proteína Gs? (gsp+) foi a mutação mais frequente em adenomas hipofisários esporádicos, principalmente em somatotropinomas. Não foram identificadas variantes com potencial patogênico nos genes AIP e CDKN1B, portanto, parece ser um evento raro em adenomas esporádicos. A expressão gênica aumentada do gene PTTG foi identificada principalmente nos corticotropinomas. No entanto, ela não foi preditiva de subtipo de adenoma. A expressão gênica do CDKN1B estava diminuída na maioria dos corticotropinomas e normal na maioria dos somatotropinomas e ACNF. A expressão gênica do MEG3 estava diminuída na maioria dos adenomas ACNF e corticotropinomas e normal na maioria dos somatotropinomas. Na análise de cluster hierárquico, foram identificados três padrões de expressão gênica que se correlacionaram com subtipo de adenoma hipofisário / BACKGROUND: Pituitary adenomas are benign tumors that account for about 15% of intracranial tumors. Mostly occurs sporadically. Molecular studies of these adenomas identified genetic abnormalities that may have a role in tumorigenesis. Some of these genes have been described as the oncogenes GNAS and PTTG and tumor suppressor genes AIP, CDKN1B and MEG3. OBJECTIVE: perform a molecular study of genes related in tumorigenesis to evaluate presence of mutations in GNAS, AIP and CDKN1B genes and gene expression analysis of CDKN1B, PTTG and MEG3 genes in apparently sporadic adenomas, correlating with the clinical and laboratory data from patients treated at the Endocrinology service of HCFMUSP.SUBJECTS AND METHODS: 96 apparently sporadic adenomas was included: 41 somatotropinomas, 27 corticotropinomas, 21 clinically nonfunctioning pituitary adenomas (NFPA) and seven prolactinomas. Retrospective evaluation of clinical and laboratory data from diagnosis. After histological analysis by hematoxylin-eosin staining, it was performed immunohistochemical analysis of Ki -67 and p53 proteins and molecular analysis of genomic DNA and RNA extracted from tumor tissue. Mutational analysis of coding regions of AIP and CDKN1B and hotspots exons 8 and 9 of GNAS was performed by PCR and automatic sequencing. Relative quantification of mRNA CDKN1B, MEG3 and PTTG was evaluated by 2-??Ct method using Real Time PCR. RESULTS: Presence of somatic mutations on GNAS gene (gsp+) in 14,5% of pituitary adenomas. There were no clinical and laboratorial differences between gsp+ and gsp- somatotropinomas. Variants with pathogenic potencial were not identified in AIP and CDKN1B genes. Imunohistochemical analysis showed mean of 1,32% (0,9-4,5) for Ki-67 and mean of 1,04% (1,0-1,8) for p53. Gene expression of CDKN1B presented a mean of 1,12 ± 0,74 (0,1-3,1) with lower expression in corticotropinomas. Gene expression of PTTG presented a mean of 2,49 ± 3,10 (0,2-19,0) with higher expression in corticotropinomas. Gene expression of MEG3 presented a mean of 0,95 ± 1,38 (0,0-8,8) with lower expression in NFPA. Three cluster patterns in the levels of mRNA expression of genes CDKN1B, PTTG and MEG3 were identified: cluster A = CDKN1B >= 1,85/ PTTG >= 1,25/ MEG3 >= 0,65 observed in 100% of corticotropinomas; cluster B= CDKN1B >= 0,95/ PTTG >= 2,25/ MEG3 >= 0,65 observed only in somatotropinomas (32%) and cluster C= CDKN1B >= 0,95/ PTTG >= 1,25/ MEG3 >= 0,05 observed in most of NFPA (73%). CONCLUSIONS: Most of the adenomas showed Ki -67 index lower than 3%. In accordance with this finding, immunohistochemistry for p53 was not statistically significant. The activating mutation in the Gs? protein (gsp+) was the most common mutation in sporadic pituitary adenomas, particularly in somatotropinomas. Variants with pathogenic potential have not been identified in the AIP and CDKN1B gene therefore seems to be a rare event in sporadic adenomas. Increased gene expression of PTTG was primarily identified in corticotropinomas. However, it was not predictive of adenoma subtype. The gene expression of CDKN1B was decreased in most corticotropinomas and normal in most somatotropinomas and NFPA. The gene expression of MEG3 was decreased in most of NFPA and corticotropinomas, and normal in most somatotropinomas. In hierarchical cluster analysis was identified three patterns of gene expression that correlated with pituitary adenoma subtype

A acromegalia é doença insidiosa e desfigurante caracterizada por um crescimento desproporcional dos ossos das mãos, pés e do crânio devido à exposição crônica a altos níveis de hormônio de crescimento (GH) e de seu efetor insuline growth factor 1 (IGF-1). Trata-se de uma doença rara, com incidência estimada de 3-4 casos por milhão, com prevalência de aproximadamente 50 casos por milhão de pessoas. A principal causa da acromegalia é a presença de um tumor hipofisário secretor de GH (somatotropinoma). Caso o somatotropinoma ocorra durante a infância ou adolescência, antes do fechamento das epífises dos ossos longos, a criança crescerá longitudinalmente de forma descontrolada, caracterizando a forma clínica gigantismo. Na grande maioria dos casos a acromegalia se apresenta na forma esporádica, entretanto casos familiais da doença podem ocorrer associados à Neoplasia Endócrina Múltipla tipo 1 (NEM-1), ao complexo de Carney (CNC) e à acromegalia familial isolada (IFS). Os genes responsáveis pela NEM-1 (MEN1) e CNC (PRKAR1A) foram clonados há mais 10 anos, entretanto etiologia molecular da IFS permaneceu desconhecida até recentemente. Vierimaa et al. (2006) combinaram estudos de ligação por análise de polimorfismos e estudos de expressão gênica e identificaram mutações no gene AIP em famílias com acromegalia não-NEM-1 e não-CNC; além de perda de heterozigose (LOH) nos somatotropinomas dos pacientes com mutação AIP. No presente estudo, investigamos o gene AIP em três famílias brasileiras com IFS e em seus tumores (hipofisários e não-hipofisários). Descrevemos uma nova mutação AIP (Y268X) em uma família brasileira com IFS, confirmando o papel desse novo gene na predisposição a tumores hipofisários. A partir de dados gerados em uma extensa revisão da literatura, sugerimos que os tumores hipofisários familiais isolados são doenças multigênicas que possuiriam um gene principal, mas que sofreriam influência de outros genes/loci ainda pouco caracterizados. Assim, investigamos também o envolvimento de diversos genes/loci candidatos (SSTR2, SSTR5, CDKN1B, AHR, PRKAR1A, PTTG, PROP1, MEG3, RB1 e 2p16) como possíveis moduladores do fenótipo na IFS. Nossos dados sugerem que além da mutação AIP, há necessidade da co-segregação de marcadores localizados em regiões com potencial oncogênico para o desenvolvimento da doença hipofisária. Também apresentamos nesta Tese as primeiras análises de tumores nãohipofisários em pacientes com mutação AIP e encontramos evidências do possível envolvimento de AIP na tumorigênese de um carcinoma funcionante do córtex adrenal de paciente com IFS. / Acromegaly is a rare disfigurating and insidious disease characterized by enlargement of hands, feet and skull bones due to excess of growth hormone (GH) secreted by a pituitary tumor (somatotropinoma). The majority of the cases with acromegaly is sporadic, however it may occur in association with inherited disorders as Multiple Endocrine Neoplasia type 1 (MEN1), Carney complex (CNC) and Isolated Familial Somatotropinoma (IFS). The genes associated with MEN1 syndrome (MEN1) and CNC (PRKAR1A) have been described more than a decade ago, however until very recently the molecular etiology of IFS remained unknown. Using a combined strategy of single nucleotide polymorphism (SNP) analysis and gene expression analysis, Vierimaa et al. (2006) described mutations in the AIP gene occurring in families with acromegaly not associated with MEN1 and CNC. In the current study, we investigated three Brazilian families with IFS and were able to describe two germline mutations in the AIP gene, confirming the role of this new gene in the predisposition to familial somatotropinoma. We revised the literature of genetic studies of isolated pituitary adenoma syndromes, which indicated a genetic heterogeneity as well as possible multigenic inheritance for these diseases. Thus, we investigated the role of several genes/loci (SSTR2, SSTR5, CDKN1B, AHR, PRKAR1A, PTTG, PROP1, MEG3, RB1 and 2p16) selected as potentially acting as phenotypic modulators in IFS. Our data indicate that AIP-mutated patients are prone to pituitary disease, however it is necessary the co-segregation of markers located at oncogenic regions to the development of the pituitary tumors and manifestation of the disease. Herein, we also present the first somatic analysis of non-pituitary tumors of AIP-mutated patients. A potential role of AIP, which is implicated in the cAMP pathway, could not be excluded in the development of an adrenocortical carcinoma.

Adenomas hipofisários são tumores benignos, de crescimento lento, originados no interior da sela túrcica e constituem de 10% a 15% dos tumores intracranianos, Os adenomas clinicamente não funcionantes (ACNF), correspondem aproximadamente um terço dos adenomas em geral. Por não apresentarem síndrome clínica hormonal são geralmente diagnosticados devido a sintomas neurológicos ou oftalmológicos, como macroadenomas, com grandes dimensões, invasão de estruturas circunvizinhas e hipopituitarismo. A cirurgia é o tratamento de escolha para estes tumores e apesar de ser eficaz na resolução do quadro compressivo, a possibilidade de cura cirúrgica é reduzida principalmente em tumores invasivos. Seu acompanhamento pós-operatório é efetuado por exame de imagem, preferencialmente ressonância magnética, devido à indisponibilidade de marcadores séricos. Nesta pesquisa avaliou-se a relação da expressão dos genes relacionados à apoptose, Bcl-2, Bax e Caspase-3 e sua relação com o comportamento dos ACNF. Na Divisão de Neurocirurgia Funcional do Instituto de Psiquiatria do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo foram operados 119 doentes com tumores hipofisários, de 28/05/08 à 07/04/09, 50 deles com ACNF, 30 deles foram estudados. A ressonância magnética da região selar pré-operatória possibilitou a medida dos três maiores diâmetros do tumor, ou seja, antero-posterior (AP), crânio-caudal (CC), látero-lateral (LL) e avaliar a invasão do seios cavernoso e esfenoidal. O tamanho dos tumores foi avaliado pela soma dos três diâmetros, pelo maior diâmetro e pelo cálculo do volume, efetuado pela fórmula AP x CC x LL x 0,5. No intraoperatório foram avaliados, a consistência e invasão tumoral. A análise histológica por hematoxilina-eosina, foi efetuada em todos os tumores, assim como a análise imuno-histoquímica (IHQ) dos hormônios hipofisários, Ki-67, p53 e Bcl-2. Foi realizada a análise molecular dos genes Bcl-2, Bax e Caspase-3 por RT-PCR. Dados demográficos: 17 do sexo masculino, 13 do sexo feminino, mediana da idade foi de 54,5 anos e mediana da duração dos sintomas de 31 meses. Todos apresentavam macroadenoma, 87% deles com perda visual, 53% com cefaléia, 17% com outras alterações neurológicas e um assintomático diagnosticado incidentalmente. Avaliação hormonal, disponível em 26 doentes, confirmou deficiência em 92% deles, com mais de dois eixos acometidos em 50% dos casos. A mediana do volume dos tumores foi de 11,6 cm3, do maior diâmetro de 3,8cm e da soma dos três diâmetros de 8,6cm, observou estreita correlação significativa estatisticamente entre as três medidas. Quarenta porcento dos tumores eram gigantes (diâmetro maior ou igual a 4 cm). Consistência amolecida e invasão tumoral foram observadas em 87% e 67% dos tumores, respectivamente. Todos doentes foram operados pela via transesfenoidal, exceto um operado por craniotomia pterional. Complicações cirúrgicas ocorreram em cinco pacientes, três com fistula liquórica, dois com meningite e dois óbitos. A análise histológica confirmou o diagnóstico de adenoma hipofisário em todos os casos. A IHQ foi negativa para todos hormônios em 18 e positiva em 12 tumores (TSH, FSH, LH, GH ou ACTH). A IHQ para proteína P-53 foi negativa em todos os casos. A IHQ para KI-67 revelou ausência da proteína em 11, positividade em menos de 3% das células em 15 e em mais de 3% em 4 tumores. A IHQ para Bcl-2 foi positiva em apenas três pacientes. A análise molecular dos genes Bcl-2, Bax e Caspase-3 revelou expressão muito inferior nos tumores em relação à observada para um pool de hipófise normal. Observou-se correlação positiva estatisticamente significante entre os três genes porém não foi observada correlação entre os níveis destes três genes e nenhum fator de prognóstico tumoral estudado, quais sejam, idade, positividade para hormônios na IHQ, tamanho ou invasão tumoral / Pituitary adenomas are benign, slow-growing tumors that arise in the sella turcica and account for 10% to 15% of all intracranial tumors. Non-functioning pituitary adenomas (NFPA) account for around one third of all pituitary adenomas. NFPA do not clinically present as hormonal syndromes and are generally diagnosed as macroadenomas due to marked neurological and ophthalmologic symptoms and invasion of surrounding structures, beside hypopituitarism. Surgery is the gold standard to treat these tumors. It effectively relieves compressive symptoms but cure is uncommon. Despite benign in nature, NFPA usually show aggressive behavior. There are no hormonal markers and the follow-up usually is made only by magnetic resonance imaging. Apoptosis-related genes, Bcl-2, Bax, and caspase-3, were here studied in NFPA to assess their role as potential markers of tumor behavior. Out of 119 patients with pituitary adenomas treated by surgery, 30 patients (17 men, 13 women, median age 54.5 years old) harboring NFPA who underwent surgery in the Department of Functional Neurosurgery at Hospital das Clínicas Psychiatric Institute, University of S. Paulo Medical School, from August 2008 to July 2009, were studied. Information on gender, age, pituitary function, symptoms and their length was collected. Tumor dimensions were measured using magnetic resonance imaging of the sella turcica. The tumor volume was calculated by the following equation: anterior-posterior diameter x cranial-caudal diameter x lateral-lateral diameter x 0.5. Intra-operative information such as tumor invasion and consistence was recorded. Histological examination by hematoxylin-eosin staining and immunohistochemistry analysis of pituitary hormones, Ki-67, p53, and Bcl-2 were performed. The molecular analysis of Bcl-2, Bax, and caspase-3 genes was performed by real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) in all tumor specimens collected during surgery and compared to a poll of normal pituitary gland. All patients had macroadenomas diagnosed due to visual loss (87%), headache (53%) and other neurological symptoms (17%) and one case was incidentally found. Hormonal deficits were seen in 92% of 26 cases; more than two axes were involved in half of these patients. There was found good correlation between tumor volume, largest diameter and the sum of the 3 diameters, and tumor volume was used to assess the correlations with other parameters. The median volume was 11.6 cm3. Giant tumors (4 cm) were diagnosed in 40% of the patients. Soft tumors and tumor invasion were observed in 87% and 67% of cases, respectively. A transsphenoidal approach was used in all patients, except one who had pterional craniotomy. Five patients presented post-operative complications: three had CSF leakage, two meningitis and two died. The histological examination confirmed pituitary adenoma in all cases, 18 of them were null cell and 12 showed a positive immunohistochemistry analysis for one or more hormones, mainly TSH. Immunohistochemistry analysis results for p-53 was negative in all cases; for Ki-67 was negative in 11, positive in less than 3% of the cells in 15 and positive in more than 3% of the cells in 4 cases; and for Bcl-2 was positive only in three patients. Bcl-2, Bax and caspase-3 molecular analysis revealed very low expression compared to normal pituitary values. There was found a positive correlation between these three genes but no correlation between them and age, tumor volume or invasion. The Bcl-2, Bax, and caspase-3 gene analysis by RT-PCR in NFPA did not evidence their potential as markers of tumor behavior

Introdução: Os mecanismos envolvidos na patogênese molecular dos tumores hipofisários corticotróficos são complexos, heterogêneos e permanecem na maioria dos casos desconhecidos. Alterações da expressão de componentes da via Ikaros (Ik), tais como do receptor 4 dos fatores de crescimento de fibroblastos (FGFR4) têm sido detectadas em tumores hipofisários, inclusive nos corticotropinomas. O desbalanço entre as isoformas longas e curtas do Ikaros resulta em um início de transcrição alternativa do FGFR4, codificando uma isoforma truncada do gene (pdt- FGFR4) que foi associada a tumores hipofisários maiores e mais invasivos. A isoforma curta Ik6 promove a expressão do fator anti-apoptótico Bcl-XL in vitro, um efeito independente da interação com as isoformas longas. Além disso, um polimorfismo do FGFR4, com substituição da glicina por arginina no códon 388 (G388R), tem sido associado à evolução desfavorável em vários tipos tumorais humanos. Objetivos: Analisar a expressão do Bcl-XL, das isoformas do Ikaros (Ik1+Ik2/Ik total) e do FGFR4 em corticotropinomas humanos. Avaliar a freqüência dos genótipos do códon 388 do FGFR4 nos pacientes com doença de Cushing e sua associação com a evolução pósoperatória após a primeira cirurgia transesfenoidal. Métodos: Noventa e sete pacientes com diagnóstico de doença de Cushing foram estudados. Os dados clínicos, hormonais e histopatológicos foram avaliados retrospectivamente. O estudo da expressão do Bcl-XL, do Ikaros, e do FGFR4 foi realizado por PCR em tempo real em 20 amostras de corticotropinomas, sendo dois tumores correspondentes à síndrome de Nelson. A determinação dos genótipos no códon 388 do FGFR4 foi realizada nos 97 pacientes e em 103 indivíduos controles, por PCR de fragmento do exon 9 do gene FGFR4 seguida de digestão com a enzima de restrição BstNI. A evolução pós-operatória (remissão/recidiva) da doença de Cushing foi avaliada em 76 pacientes. Foram considerados em remissão aqueles pacientes com níveis normais de cortisol urinário durante todo o primeiro ano após a cirurgia, na ausência de reposição hormonal, bem como os que necessitaram de reposição com glicocorticóide no mesmo período. Resultados: Dos 76 pacientes submetidos à primeira cirurgia transesfenoidal, a remissão pós-operatória ocorreu em 68,4% dos pacientes. Treze pacientes (25%) evoluíram com recidiva da doença de Cushing após remissão inicial. A expressão do Bcl-XL foi semelhante à hipófise normal na maioria das amostras tumorais [mediana (mín-máx): 1,36 (0,6 - 2,70)]. Aumento da expressão das isoformas longas do Ikaros foi detectado em 40% dos tumores, enquanto as isoformas curtas corresponderam a mais de 50% da expressão do Ikaros em apenas 3 casos, não havendo associação da expressão do Ikaros com qualquer das variáveis analisadas. O aumento da expressão do FGFR4 foi detectado em 8/18 (44,4%) dos corticotropinomas com doença de Cushing, havendo associação entre a hiperexpressão do FGFR4 e a menor freqüência de remissão pós-operatória da doença de Cushing (p = 0,009). A distribuição genotípica do polimorfismo G388R foi semelhante entre pacientes e controles. O genótipo glicina em homozigose (Gly/Gly) não foi associado à menor frequência de remissão pós-operatória da doença, no entanto, uma freqüência maior de recidiva pós-operatória foi encontrada no grupo de pacientes Gly/Gly (p = 0,019). O genótipo Gly/Gly foi ainda associado à redução da sobrevida livre de doença (hazard ratio [HR], 6,91; Intervalo de Confiança (IC) de 95%, 1,14 a 11,26; p = 0,028). Outras variáveis que se associaram significativamente com maior freqüência de recidiva foram: tamanho e grau de invasão tumoral de acordo com a classificação de Hardy modificada (p = 0,017), o sexo masculino (p = 0,033), a não confirmação Imuno-histológica do tumor produtor de ACTH (p = 0,026) e os valores de cortisol > 2 ?g/dL no pós-operatório precoce (p = 0,01). Conclusões: A expressão normal detectada do Bcl-XL e das isoformas curtas do Ikaros, na maioria das amostras tumorais, sugere a não participação destes fatores na patogênese dos tumores corticotróficos. O aumento da expressão do FGFR4 e o genótipo glicina em homozigose foram associados, respectivamente, à menor freqüência de remissão e maior recidiva pós-operatória da doença de Cushing. Estes resultados sugerem que o FGFR4 pode ter um papel na progressão dos tumores corticotróficos favorecendo a persistência e/ou recidiva da doença de Cushing. / Introduction: The mechanisms involved in the molecular pathogenesis of corticotroph pituitary tumors are complex, heterogeneous and in most cases remain unknown. Changes in the expression of components of Ikaros (Ik) pathway, such as receptor 4 of fibroblast growth factor (FGFR4), have been detected in pituitary tumors including corticotropinomas. Imbalance between long and short Ik isoforms results in alternative transcription initiation of FGFR4 and encodes a truncated isoform of the gene (pdt-FGFR4) which was associated with larger and more invasive pituitary tumors. The Ik6 short isoform promotes Bcl-XL expression in vitro, an effect independent of the interaction with the long isoforms. In addition, a polymorphism of FGFR4 gene, the substitution of glycine by arginine at codon 388 (G388R), has been associated with adverse outcome in several human tumor types. Objectives: To analyze the expression of Bcl-XL, Ikaros isoforms (Ik1 + Ik2/Ikaros total), and FGFR4 in human corticotropinomas. To determine the frequency of each genotype at codon 388 of FGFR4 in patients with Cushing\'s disease and its association with the postoperative outcome after the first transsphenoidal surgery. Methods: Ninety-seven patients with Cushing\'s disease were evaluated. Clinical, hormonal and histopathological findings were assessed retrospectively. The expression of Bcl-XL, Ikaros and FGFR4 were evaluated by real-time PCR in 20 samples of corticotropinomas, including two samples of Nelson\'s syndrome. The FGFR4 genotype was determined in the 97 patients and 103 control subjects by PCR fragment of exon 9 of the FGFR4 gene, followed by digestion with the BstNI restriction enzyme. The postoperative outcome (remission/relapse) of Cushing\'s disease was assessed in 76 patients. The patients with normal urinary cortisol levels during the first year after surgery, in the absence of hormone replacement therapy, and those who required glucocorticoid replacement within the same period were considered in remission. Results: Of the 76 patients who underwent the first transsphenoidal surgery, remission was achieved in 68.4% of patients. Thirteen patients (25%) developed recurrence of Cushing\'s disease after initial remission. The expression of Bcl-XL in the majority of tumor samples was similar to normal pituitary [median (min-max): 1.36 (0.6 - 2.70)]. Overexpression of long isoforms of Ik was detected in 40% of tumors, while the short isoforms represented more than 50% of the expression in only 3 samples. Ik expression was not associated with any of the variables analysed. FGFR4 transcripts were overexpressed in 8/18 (44.4%) of corticotropinomas with Cushing\'s disease. There was an association between the overexpression of FGFR4 and lower postoperative remission rate (p = 0.009). The FGFR4 genotype distribution at codon 388 was similar between control individuals and patients. The glycine homozygous genotype (Gly/Gly) was not associated with lower remission rate. However, a higher frequency of postoperative recurrence was found in the Gly/Gly group (p = 0.019). The Gly/Gly genotype was also associated with reduced disease-free survival (hazard ratio [HR] 6.91, confidence interval (CI) 95%, 1.14 to 11.26; p = 0.028). Other variables that were significantly associated with higher frequency of recurrence were: size and tumor invasion according to modified Hardy classification (p = 0.017), male gender (p = 0.033), non-immuno-histological confirmation of ACTH secreting tumor (p = 0.026) and cortisol levels > 2 ?g/dL in the early postoperative period (p = 0.01). Conclusions: The normal expression of Bcl-XL and short isoforms of Ik in most samples suggest that these factors are not involved in the pathogenesis of corticotroph tumors. Overexpression of FGFR4 and the glycine homozygous genotype were associated with lower frequency of remission and higher postoperative recurrence of Cushing\'s disease, respectively. These results suggest that FGFR4 may play a role in progression of corticotroph tumors favoring the persistence and/or recurrence of Cushing\'s disease.

Introdução: Os mecanismos envolvidos na patogênese molecular dos tumores hipofisários corticotróficos são complexos, heterogêneos e permanecem na maioria dos casos desconhecidos. Alterações da expressão de componentes da via Ikaros (Ik), tais como do receptor 4 dos fatores de crescimento de fibroblastos (FGFR4) têm sido detectadas em tumores hipofisários, inclusive nos corticotropinomas. O desbalanço entre as isoformas longas e curtas do Ikaros resulta em um início de transcrição alternativa do FGFR4, codificando uma isoforma truncada do gene (pdt- FGFR4) que foi associada a tumores hipofisários maiores e mais invasivos. A isoforma curta Ik6 promove a expressão do fator anti-apoptótico Bcl-XL in vitro, um efeito independente da interação com as isoformas longas. Além disso, um polimorfismo do FGFR4, com substituição da glicina por arginina no códon 388 (G388R), tem sido associado à evolução desfavorável em vários tipos tumorais humanos. Objetivos: Analisar a expressão do Bcl-XL, das isoformas do Ikaros (Ik1+Ik2/Ik total) e do FGFR4 em corticotropinomas humanos. Avaliar a freqüência dos genótipos do códon 388 do FGFR4 nos pacientes com doença de Cushing e sua associação com a evolução pósoperatória após a primeira cirurgia transesfenoidal. Métodos: Noventa e sete pacientes com diagnóstico de doença de Cushing foram estudados. Os dados clínicos, hormonais e histopatológicos foram avaliados retrospectivamente. O estudo da expressão do Bcl-XL, do Ikaros, e do FGFR4 foi realizado por PCR em tempo real em 20 amostras de corticotropinomas, sendo dois tumores correspondentes à síndrome de Nelson. A determinação dos genótipos no códon 388 do FGFR4 foi realizada nos 97 pacientes e em 103 indivíduos controles, por PCR de fragmento do exon 9 do gene FGFR4 seguida de digestão com a enzima de restrição BstNI. A evolução pós-operatória (remissão/recidiva) da doença de Cushing foi avaliada em 76 pacientes. Foram considerados em remissão aqueles pacientes com níveis normais de cortisol urinário durante todo o primeiro ano após a cirurgia, na ausência de reposição hormonal, bem como os que necessitaram de reposição com glicocorticóide no mesmo período. Resultados: Dos 76 pacientes submetidos à primeira cirurgia transesfenoidal, a remissão pós-operatória ocorreu em 68,4% dos pacientes. Treze pacientes (25%) evoluíram com recidiva da doença de Cushing após remissão inicial. A expressão do Bcl-XL foi semelhante à hipófise normal na maioria das amostras tumorais [mediana (mín-máx): 1,36 (0,6 - 2,70)]. Aumento da expressão das isoformas longas do Ikaros foi detectado em 40% dos tumores, enquanto as isoformas curtas corresponderam a mais de 50% da expressão do Ikaros em apenas 3 casos, não havendo associação da expressão do Ikaros com qualquer das variáveis analisadas. O aumento da expressão do FGFR4 foi detectado em 8/18 (44,4%) dos corticotropinomas com doença de Cushing, havendo associação entre a hiperexpressão do FGFR4 e a menor freqüência de remissão pós-operatória da doença de Cushing (p = 0,009). A distribuição genotípica do polimorfismo G388R foi semelhante entre pacientes e controles. O genótipo glicina em homozigose (Gly/Gly) não foi associado à menor frequência de remissão pós-operatória da doença, no entanto, uma freqüência maior de recidiva pós-operatória foi encontrada no grupo de pacientes Gly/Gly (p = 0,019). O genótipo Gly/Gly foi ainda associado à redução da sobrevida livre de doença (hazard ratio [HR], 6,91; Intervalo de Confiança (IC) de 95%, 1,14 a 11,26; p = 0,028). Outras variáveis que se associaram significativamente com maior freqüência de recidiva foram: tamanho e grau de invasão tumoral de acordo com a classificação de Hardy modificada (p = 0,017), o sexo masculino (p = 0,033), a não confirmação Imuno-histológica do tumor produtor de ACTH (p = 0,026) e os valores de cortisol > 2 ?g/dL no pós-operatório precoce (p = 0,01). Conclusões: A expressão normal detectada do Bcl-XL e das isoformas curtas do Ikaros, na maioria das amostras tumorais, sugere a não participação destes fatores na patogênese dos tumores corticotróficos. O aumento da expressão do FGFR4 e o genótipo glicina em homozigose foram associados, respectivamente, à menor freqüência de remissão e maior recidiva pós-operatória da doença de Cushing. Estes resultados sugerem que o FGFR4 pode ter um papel na progressão dos tumores corticotróficos favorecendo a persistência e/ou recidiva da doença de Cushing. / Introduction: The mechanisms involved in the molecular pathogenesis of corticotroph pituitary tumors are complex, heterogeneous and in most cases remain unknown. Changes in the expression of components of Ikaros (Ik) pathway, such as receptor 4 of fibroblast growth factor (FGFR4), have been detected in pituitary tumors including corticotropinomas. Imbalance between long and short Ik isoforms results in alternative transcription initiation of FGFR4 and encodes a truncated isoform of the gene (pdt-FGFR4) which was associated with larger and more invasive pituitary tumors. The Ik6 short isoform promotes Bcl-XL expression in vitro, an effect independent of the interaction with the long isoforms. In addition, a polymorphism of FGFR4 gene, the substitution of glycine by arginine at codon 388 (G388R), has been associated with adverse outcome in several human tumor types. Objectives: To analyze the expression of Bcl-XL, Ikaros isoforms (Ik1 + Ik2/Ikaros total), and FGFR4 in human corticotropinomas. To determine the frequency of each genotype at codon 388 of FGFR4 in patients with Cushing\'s disease and its association with the postoperative outcome after the first transsphenoidal surgery. Methods: Ninety-seven patients with Cushing\'s disease were evaluated. Clinical, hormonal and histopathological findings were assessed retrospectively. The expression of Bcl-XL, Ikaros and FGFR4 were evaluated by real-time PCR in 20 samples of corticotropinomas, including two samples of Nelson\'s syndrome. The FGFR4 genotype was determined in the 97 patients and 103 control subjects by PCR fragment of exon 9 of the FGFR4 gene, followed by digestion with the BstNI restriction enzyme. The postoperative outcome (remission/relapse) of Cushing\'s disease was assessed in 76 patients. The patients with normal urinary cortisol levels during the first year after surgery, in the absence of hormone replacement therapy, and those who required glucocorticoid replacement within the same period were considered in remission. Results: Of the 76 patients who underwent the first transsphenoidal surgery, remission was achieved in 68.4% of patients. Thirteen patients (25%) developed recurrence of Cushing\'s disease after initial remission. The expression of Bcl-XL in the majority of tumor samples was similar to normal pituitary [median (min-max): 1.36 (0.6 - 2.70)]. Overexpression of long isoforms of Ik was detected in 40% of tumors, while the short isoforms represented more than 50% of the expression in only 3 samples. Ik expression was not associated with any of the variables analysed. FGFR4 transcripts were overexpressed in 8/18 (44.4%) of corticotropinomas with Cushing\'s disease. There was an association between the overexpression of FGFR4 and lower postoperative remission rate (p = 0.009). The FGFR4 genotype distribution at codon 388 was similar between control individuals and patients. The glycine homozygous genotype (Gly/Gly) was not associated with lower remission rate. However, a higher frequency of postoperative recurrence was found in the Gly/Gly group (p = 0.019). The Gly/Gly genotype was also associated with reduced disease-free survival (hazard ratio [HR] 6.91, confidence interval (CI) 95%, 1.14 to 11.26; p = 0.028). Other variables that were significantly associated with higher frequency of recurrence were: size and tumor invasion according to modified Hardy classification (p = 0.017), male gender (p = 0.033), non-immuno-histological confirmation of ACTH secreting tumor (p = 0.026) and cortisol levels > 2 ?g/dL in the early postoperative period (p = 0.01). Conclusions: The normal expression of Bcl-XL and short isoforms of Ik in most samples suggest that these factors are not involved in the pathogenesis of corticotroph tumors. Overexpression of FGFR4 and the glycine homozygous genotype were associated with lower frequency of remission and higher postoperative recurrence of Cushing\'s disease, respectively. These results suggest that FGFR4 may play a role in progression of corticotroph tumors favoring the persistence and/or recurrence of Cushing\'s disease.