Thesis (doctor of medicine)--Universiteit van Amsterdam, 1979. / Text in English with summaries in English and Dutch.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2006. / Härtill 4 uppsatser.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2006. / Härtill 4 uppsatser.

Os tumores hipofisários representam cerca de 10% a 15% das neoplasias intracranianas. Embora a etiopatogenia ainda não seja plenamente caracterizada, muitos mecanismos moleculares envolvidos na tumorigênese hipofisária já foram desvendados. Utilizandose da metodologia de arranjos de cDNA contendo aproximadamente 20.000 genes, nosso grupo recentemente comparou a expressão de duas condições distintas: um pool de quatro adenomas hipofisários clinicamente não funcionantes e a metástase de um carcinoma hipofisário não funcionante. Vários genes mostraram-se diferencialmente expressos, entre eles, CRABP1 (cellular retinoic acid binding protein 1), CRABP2 (cellular retinoic acid binding protein 2), GRP (gastrin-releasing peptide) e RERG (RAS-like, estrogen-regulated, growth inhibitor). Este estudo visou avaliar a expressão desses quatro genes em uma série de 59 adenomas hipofisários (30 adenomas clinicamente não funcionantes, 13 somatotrofinomas, 8 corticotrofinomas e 8 prolactinomas), comparando cada grupo tumoral com um conjunto de tecidos hipofisários normais. Enquanto os prolactinomas demonstraram expressão reduzida do RNAm dos genes CRABP1 e CRABP2 quando comparados ao grupo de tecidos normais, os somatotrofinomas apresentaram expressão reduzida apenas do RNAm de CRABP2. Os adenomas clinicamente não funcionantes, por sua vez, demonstraram menor expressão do RNAm de GRP e maior expressão do RNAm de RERG quando comparados ao grupo de hipófises normais. Portanto, observou-se que tanto o gene CRABP1 quanto os genes CRABP2, GRP e RERG apresentaram diferenças na expressão do transcrito entre os grupos de adenomas de hipófise, contudo, seu papel na tumorigênese hipofisária permanece a ser investigado. / Pituitary tumors account for approximately 10%-15% of the intracranial neoplasms. Although the pathogenesis is not fully characterized, many molecular mechanisms involved in pituitary tumorigenesis have been unraveled. Using the methodology of cDNA microarray containing approximately 20000 genes, our group recently compared the expression of two distinct conditions: a pool of four clinically nonfunctioning pituitary adenomas and a spinal cord metastasis of a nonfunctioning pituitary carcinoma. Several genes were shown to be differentially expressed, among them, CRABP1 (cellular retinoic acid binding protein 1), CRABP2 (cellular retinoic acid binding protein 2), GRP (gastrin-releasing peptide) and RERG (RAS-like, estrogen-regulated, growth inhibitor). This study aimed to evaluate the expression of these four genes in a series of 59 pituitary adenomas (30 nonfunctioning, 13 GH-secreting, 8 ACTH-secreting and 8 PRL-secreting adenomas), comparing each tumor group with a set of normal pituitary tissues. While PRL-secreting adenomas showed lower expression of CRABP1 and CRABP2 mRNA when compared with normal tissues, GH-secreting adenomas had only lower expression of CRABP2 mRNA. Clinically nonfunctioning adenomas showed lower expression of GRP mRNA and higher expression of RERG mRNA when compared with the normal pituitary glands. Therefore, it was observed that not only the CRABP1 gene but also the CRABP2, GRP and RERG genes showed differences in transcript expression between the groups of pituitary adenomas. However, their role in pituitary tumorigenesis remains to be investigated.

As sirtuínas 1-7 (SIRT) constituem uma família altamente conservada de desacetilases de histonas que, de modo geral, participam da regulação da longevidade em diversos organismos, modulando a resposta celular frente ao stress oxidativo e promovendo mecanismo de reparo de DNA, parada do ciclo celular, estabilidade telomérica, senescência e apoptose celulares. O envolvimento das SIRTs no processo tumorigênico tem sido bastante investigado, contudo ainda não existe descrição do estudo desses genes nos adenomas hipofisários. O objetivo desse estudo foi avaliar a expressão gênica das SIRT1-7 nos somatotropinomas e adenomas hipofisários clinicamente não funcionantes (ACNF) e sua relação com o tamanho e a invasividade do tumor. A expressão das sirtuínas foi ainda correlacionada à expressão dos marcadores de senescência CDKN1A (p21) e CDKN2A (p16) e do proto-oncogene PTTG (pituitary tumor transforming gene). Foram selecionados 68 pacientes, 37 somatotropinomas e 31 portadores de ACNF. Desses casos, 33 apresentavam tumores invasivos e 35 eram não invasivos. A quantificação do RNAm das SIRT1-7, CDKN1A, CDKN2A e PTTG foi realizada nas amostras tumorais pela técnica de PCR em tempo real utilizando o método de quantificação relativa 2-??Ct. A hiperexpressão da SIRT1 foi observada em 86,5% dos somatotropinomas versus 41,9% dos ACNF (P < 0.01), não sendo observada perda de expressão desse gene. A SIRT3 foi mais hipoexpressa nos ACNF em relação aos somatotropinomas (77,4% e 40,5%, respectivamente; P < 0.01). A SIRT4 foi hipo e hiperexpressa, respectivamente, em 45,2% e 12,9% dos ACNF e 16,2% e 24,3% dos somatotropinomas (P=0.03). A hipoexpressão da SIRT7 também foi maior nos ACNF (67,7%) versus somatotropinomas (32,4%; P=0.01) e, para ambos os subtipos, o percentual de casos apresentando hiperexpressão desse RNAm foi baixo. O padrão de expressão das SIRT2 e 5 não diferiu entre os subtipos tumorais e não se mostrou alterado em relação ao pool de hipófises normais. Não foi observada diferença estatisticamente significante na expressão dos genes das sirtuínas entre os grupos de tumores invasivos e não invasivos. Contudo, a expressão das SIRT1 e 3 foi relacionada ao tamanho tumoral; nos casos com hiperexpressão da SIRT1 a média do maior diâmetro tumoral foi 2.4 ± 1.1 enquanto nos pacientes com expressão normal foi de 3.3 ± 1.3 (P < 0.01). Já os casos com perda de expressão da SIRT3 apresentaram tumores maiores (3.1 ± 1.2) em relação aos casos com expressão normal (2.2 ± 1.1; P < 0.01). A expressão de todas as SIRTs apresentou correlação positiva moderada (SIRT1-5,7) ou forte (SIRT6) com a expressão do CDKN1A. Uma correlação positiva foi observada também em relação a expressão do CDKN2A. Contudo, essa foi fraca e presente apenas para as SIRTs 3-5. Em relação ao PTTG, foi observado apenas uma fraca correlação com a expressão da SIRT1 e SIRT3. Em conclusão, esses resultados sugerem que a hiperexpressão de SIRT1 e a hipoexpressão das SIRTs 3, 4 e 7 podem estar relacionadas ao processo tumorigênico nos somatotropinomas e ACNFs, respectivamente e, em especial as SIRT1 e 3, ao controle da proliferação celular nesses adenomas / Sirtuins 1-7 (SIRT) are a highly conserved family of histone deacetylases. In general, these proteins are involved in the regulation of longevity in several organisms, modulating the cellular response to oxidative stress. SIRTs can also regulate DNA repair, telomeric stability, cell senescence and apoptosis. Due to their functions, there is a growing interest in the role of sirtuins in tumorigenesis. However, these genes were not investigated in pituitary tumors so far. In this study, SIRT1-7 gene expression was evaluated in somatotropinomas and nonfunctioning pituitary adenomas (NFPA) and related to tumor size and invasiveness. SIRT1-7 expression was also correlated with cellular senescence markers CDKN1A (p21) e CDKN2A (p16) and with the proto-oncogene PTTG (pituitary tumor transforming gene). Sixty-eight patients were selected, 37 with somatotropinomas and 31 with NFPA. Tumor invasion was observed in 33 patients. SIRT1-7, CDKN1A, CDKN2A and PTTG mRNA levels was evaluated from pituitary tumor samples by the real-time PCR using 2-??Ct relative quantification. Pronounced differences in SIRT1, 3, 4 and 7 expressions were identified between somatotropinomas and NFPA. Overexpression of SIRT1 was observed in 86.5% of somatotropinomas versus 41.9% of NFPA (P < 0.01) whereas underexpression was not detected. SIRT3 was more underexpressed in NFPA than somatotropinomas (77.4% and 40.5%, respectively, P < 0.01). SIRT4 was under and overexpressed, respectively, in 45.2% and 12.9% of NFPA and 16.2% and 24.3% of somatotropinomas (P=0.03). SIRT7 underexpression was also higher in NFPAs (67.7%) versus somatotropinomas (32.4%; P=0.01) with few cases showing overexpression. SIRT2 and 5 expressions did not differ between tumors subtypes and was not altered in relation to the normal pituitary gland pool. No statistically significant difference was observed in the expression of these genes between invasive and non-invasive tumor groups. However, SIRT1 and 3 expressions were related to tumor size. Mean of the largest tumor diameter was 2.4 ± 1.1 and 3.3 ± 1.3 (P < 0.01) in adenomas with SIRT1 over- and normal expression, respectively. On the other hand, cases with SIRT3 underepression exhibited larger tumors (3.1 ± 1.2) compared to cases with SIRT3 normal expression (2.2 ± 1.1, P < 0.01). Moderated (SIRT1-5.7) or strong (SIRT6) positive correlation was observed between sirtuins and CDKN1A expression. A weak correlation was observed with respect to CDKN2A expression and SIRTs 3-5. Regarding PTTG mRNA, only a weak correlation with SIRT1 and SIRT3 expression was observed. In conclusion, these results suggest that overexpression of SIRT1 and underexpression of SIRTs 3, 4 and 7 could be related to the tumorigenic process in somatotropinomas and NFPAs, respectively. SIRT1 and 3 could also play a role in control of pituitary adenomas cell proliferation

Os tumores hipofisários representam cerca de 10% a 15% das neoplasias intracranianas. Embora a etiopatogenia ainda não seja plenamente caracterizada, muitos mecanismos moleculares envolvidos na tumorigênese hipofisária já foram desvendados. Utilizandose da metodologia de arranjos de cDNA contendo aproximadamente 20.000 genes, nosso grupo recentemente comparou a expressão de duas condições distintas: um pool de quatro adenomas hipofisários clinicamente não funcionantes e a metástase de um carcinoma hipofisário não funcionante. Vários genes mostraram-se diferencialmente expressos, entre eles, CRABP1 (cellular retinoic acid binding protein 1), CRABP2 (cellular retinoic acid binding protein 2), GRP (gastrin-releasing peptide) e RERG (RAS-like, estrogen-regulated, growth inhibitor). Este estudo visou avaliar a expressão desses quatro genes em uma série de 59 adenomas hipofisários (30 adenomas clinicamente não funcionantes, 13 somatotrofinomas, 8 corticotrofinomas e 8 prolactinomas), comparando cada grupo tumoral com um conjunto de tecidos hipofisários normais. Enquanto os prolactinomas demonstraram expressão reduzida do RNAm dos genes CRABP1 e CRABP2 quando comparados ao grupo de tecidos normais, os somatotrofinomas apresentaram expressão reduzida apenas do RNAm de CRABP2. Os adenomas clinicamente não funcionantes, por sua vez, demonstraram menor expressão do RNAm de GRP e maior expressão do RNAm de RERG quando comparados ao grupo de hipófises normais. Portanto, observou-se que tanto o gene CRABP1 quanto os genes CRABP2, GRP e RERG apresentaram diferenças na expressão do transcrito entre os grupos de adenomas de hipófise, contudo, seu papel na tumorigênese hipofisária permanece a ser investigado. / Pituitary tumors account for approximately 10%-15% of the intracranial neoplasms. Although the pathogenesis is not fully characterized, many molecular mechanisms involved in pituitary tumorigenesis have been unraveled. Using the methodology of cDNA microarray containing approximately 20000 genes, our group recently compared the expression of two distinct conditions: a pool of four clinically nonfunctioning pituitary adenomas and a spinal cord metastasis of a nonfunctioning pituitary carcinoma. Several genes were shown to be differentially expressed, among them, CRABP1 (cellular retinoic acid binding protein 1), CRABP2 (cellular retinoic acid binding protein 2), GRP (gastrin-releasing peptide) and RERG (RAS-like, estrogen-regulated, growth inhibitor). This study aimed to evaluate the expression of these four genes in a series of 59 pituitary adenomas (30 nonfunctioning, 13 GH-secreting, 8 ACTH-secreting and 8 PRL-secreting adenomas), comparing each tumor group with a set of normal pituitary tissues. While PRL-secreting adenomas showed lower expression of CRABP1 and CRABP2 mRNA when compared with normal tissues, GH-secreting adenomas had only lower expression of CRABP2 mRNA. Clinically nonfunctioning adenomas showed lower expression of GRP mRNA and higher expression of RERG mRNA when compared with the normal pituitary glands. Therefore, it was observed that not only the CRABP1 gene but also the CRABP2, GRP and RERG genes showed differences in transcript expression between the groups of pituitary adenomas. However, their role in pituitary tumorigenesis remains to be investigated.

As sirtuínas 1-7 (SIRT) constituem uma família altamente conservada de desacetilases de histonas que, de modo geral, participam da regulação da longevidade em diversos organismos, modulando a resposta celular frente ao stress oxidativo e promovendo mecanismo de reparo de DNA, parada do ciclo celular, estabilidade telomérica, senescência e apoptose celulares. O envolvimento das SIRTs no processo tumorigênico tem sido bastante investigado, contudo ainda não existe descrição do estudo desses genes nos adenomas hipofisários. O objetivo desse estudo foi avaliar a expressão gênica das SIRT1-7 nos somatotropinomas e adenomas hipofisários clinicamente não funcionantes (ACNF) e sua relação com o tamanho e a invasividade do tumor. A expressão das sirtuínas foi ainda correlacionada à expressão dos marcadores de senescência CDKN1A (p21) e CDKN2A (p16) e do proto-oncogene PTTG (pituitary tumor transforming gene). Foram selecionados 68 pacientes, 37 somatotropinomas e 31 portadores de ACNF. Desses casos, 33 apresentavam tumores invasivos e 35 eram não invasivos. A quantificação do RNAm das SIRT1-7, CDKN1A, CDKN2A e PTTG foi realizada nas amostras tumorais pela técnica de PCR em tempo real utilizando o método de quantificação relativa 2-??Ct. A hiperexpressão da SIRT1 foi observada em 86,5% dos somatotropinomas versus 41,9% dos ACNF (P < 0.01), não sendo observada perda de expressão desse gene. A SIRT3 foi mais hipoexpressa nos ACNF em relação aos somatotropinomas (77,4% e 40,5%, respectivamente; P < 0.01). A SIRT4 foi hipo e hiperexpressa, respectivamente, em 45,2% e 12,9% dos ACNF e 16,2% e 24,3% dos somatotropinomas (P=0.03). A hipoexpressão da SIRT7 também foi maior nos ACNF (67,7%) versus somatotropinomas (32,4%; P=0.01) e, para ambos os subtipos, o percentual de casos apresentando hiperexpressão desse RNAm foi baixo. O padrão de expressão das SIRT2 e 5 não diferiu entre os subtipos tumorais e não se mostrou alterado em relação ao pool de hipófises normais. Não foi observada diferença estatisticamente significante na expressão dos genes das sirtuínas entre os grupos de tumores invasivos e não invasivos. Contudo, a expressão das SIRT1 e 3 foi relacionada ao tamanho tumoral; nos casos com hiperexpressão da SIRT1 a média do maior diâmetro tumoral foi 2.4 ± 1.1 enquanto nos pacientes com expressão normal foi de 3.3 ± 1.3 (P < 0.01). Já os casos com perda de expressão da SIRT3 apresentaram tumores maiores (3.1 ± 1.2) em relação aos casos com expressão normal (2.2 ± 1.1; P < 0.01). A expressão de todas as SIRTs apresentou correlação positiva moderada (SIRT1-5,7) ou forte (SIRT6) com a expressão do CDKN1A. Uma correlação positiva foi observada também em relação a expressão do CDKN2A. Contudo, essa foi fraca e presente apenas para as SIRTs 3-5. Em relação ao PTTG, foi observado apenas uma fraca correlação com a expressão da SIRT1 e SIRT3. Em conclusão, esses resultados sugerem que a hiperexpressão de SIRT1 e a hipoexpressão das SIRTs 3, 4 e 7 podem estar relacionadas ao processo tumorigênico nos somatotropinomas e ACNFs, respectivamente e, em especial as SIRT1 e 3, ao controle da proliferação celular nesses adenomas / Sirtuins 1-7 (SIRT) are a highly conserved family of histone deacetylases. In general, these proteins are involved in the regulation of longevity in several organisms, modulating the cellular response to oxidative stress. SIRTs can also regulate DNA repair, telomeric stability, cell senescence and apoptosis. Due to their functions, there is a growing interest in the role of sirtuins in tumorigenesis. However, these genes were not investigated in pituitary tumors so far. In this study, SIRT1-7 gene expression was evaluated in somatotropinomas and nonfunctioning pituitary adenomas (NFPA) and related to tumor size and invasiveness. SIRT1-7 expression was also correlated with cellular senescence markers CDKN1A (p21) e CDKN2A (p16) and with the proto-oncogene PTTG (pituitary tumor transforming gene). Sixty-eight patients were selected, 37 with somatotropinomas and 31 with NFPA. Tumor invasion was observed in 33 patients. SIRT1-7, CDKN1A, CDKN2A and PTTG mRNA levels was evaluated from pituitary tumor samples by the real-time PCR using 2-??Ct relative quantification. Pronounced differences in SIRT1, 3, 4 and 7 expressions were identified between somatotropinomas and NFPA. Overexpression of SIRT1 was observed in 86.5% of somatotropinomas versus 41.9% of NFPA (P < 0.01) whereas underexpression was not detected. SIRT3 was more underexpressed in NFPA than somatotropinomas (77.4% and 40.5%, respectively, P < 0.01). SIRT4 was under and overexpressed, respectively, in 45.2% and 12.9% of NFPA and 16.2% and 24.3% of somatotropinomas (P=0.03). SIRT7 underexpression was also higher in NFPAs (67.7%) versus somatotropinomas (32.4%; P=0.01) with few cases showing overexpression. SIRT2 and 5 expressions did not differ between tumors subtypes and was not altered in relation to the normal pituitary gland pool. No statistically significant difference was observed in the expression of these genes between invasive and non-invasive tumor groups. However, SIRT1 and 3 expressions were related to tumor size. Mean of the largest tumor diameter was 2.4 ± 1.1 and 3.3 ± 1.3 (P < 0.01) in adenomas with SIRT1 over- and normal expression, respectively. On the other hand, cases with SIRT3 underepression exhibited larger tumors (3.1 ± 1.2) compared to cases with SIRT3 normal expression (2.2 ± 1.1, P < 0.01). Moderated (SIRT1-5.7) or strong (SIRT6) positive correlation was observed between sirtuins and CDKN1A expression. A weak correlation was observed with respect to CDKN2A expression and SIRTs 3-5. Regarding PTTG mRNA, only a weak correlation with SIRT1 and SIRT3 expression was observed. In conclusion, these results suggest that overexpression of SIRT1 and underexpression of SIRTs 3, 4 and 7 could be related to the tumorigenic process in somatotropinomas and NFPAs, respectively. SIRT1 and 3 could also play a role in control of pituitary adenomas cell proliferation

INTRODUÇÃO: O diagnóstico diferencial da síndrome de Cushing (SC) ACTH-dependente é um dos maiores desafios da endocrinologia, devido ao comportamento clínico e laboratorial semelhante de alguns tumores carcinóides com a doença de Cushing (DC). Assim, testes dinâmicos de secreção de ACTH e cortisol têm sido utilizados com o objetivo de identificar respostas que sejam preditivas e específicas no diagnóstico diferencial. O padrão dessas respostas é atribuído à superexpressão de receptores; entretanto, poucos estudos foram realizados para comprovar tal associação. O objetivo deste estudo foi verificar se a secreção de ACTH e cortisol em resposta aos testes do CRH humano (hCRH), da desmopressina, e do peptídeo liberador do GH (GHRP-6) é dependente da magnitude de expressão dos seus respectivos receptores (CRHR1, AVPR1B e GHSR-1a) em amostras de tumores de pacientes portadores da SC ACTH-dependente. CASUÍSTICA E MÉTODOS: Entre 2002 e 2004, foram avaliados 22 pacientes (20 com DC e dois com Secreção Ectópica de ACTH [SEA], carcinóide de pulmão e timo), idade mediana de 32 anos (15-54 anos), sendo 18 do sexo feminino e quatro do sexo masculino, provenientes da Disciplina de Endocrinologia e Metabologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. Os pacientes foram submetidos aos testes do hCRH (100 µg), desmopressina (10 µg) e GHRP-6 (1 µg/kg) com dosagens de ACTH e cortisol e também de GH no caso do GHRP-6. Vinte e um indivíduos controles, pareados por sexo e idade, foram submetidos ao teste do GHRP-6. Durante o ato operatório, fragmentos de tumor foram coletados para posterior extração do RNA total. O estudo da expressão foi feito por meio de PCR quantitativo em tempo real dos genes CRHR1, AVPR1B e GHSR-1a em relação ao GAPDH. Fragmentos de tecidos normais (hipófise, pulmão e timo) procedentes de necropsias foram utilizados como controles. RESULTADOS: Observamos maior expressão de GHSR-1a nos pacientes responsivos ao GHRP-6, tanto naqueles com DC quanto no paciente com carcinóide pulmonar. Não houve maior expressão dos receptores CRHR1 e AVPR1B nos pacientes com DC responsivos aos respectivos testes, observando-se, no entanto, uma forte associação entre respostas in vivo e a expressão desses receptores nos pacientes com SEA. As concentrações de ACTH e cortisol induzidas pela administração de GHRP-6 foram mais elevadas nos pacientes com DC quando comparados aos controles, havendo, no entanto, superposição entre as respostas. Observamos também elevação dos níveis séricos de GH nos indivíduos controles e, em menor intensidade, nos pacientes com DC. CONCLUSÕES: Houve maior expressão do receptor GHSR-1a em pacientes com SC ACTH-dependente responsivos ao GHRP-6, estabelecendo-se uma relação direta entre a expressão do receptor e a resposta in vivo ao secretagogo, tanto em pacientes com DC quanto nos portadores de SEA. Uma associação entre a expressão dos receptores CRHR1 e AVPR1B com a resposta in vivo aos respectivos secretagogos foi observada nos pacientes com SEA e não nos pacientes com DC. Tendo em vista a resposta ao GHRP-6 em paciente com SEA, limita-se o uso desse peptídeo no diagnóstico diferencial da SC ACTH-dependente. / INTRODUCTION: The differential diagnosis of ACTH-dependent Cushing\'s syndrome (CS) is one of the major challenges in endocrinology, especially in view of the similar clinical and laboratorial behavior between some carcinoid tumors and Cushing\'s disease (CD). Hence, dynamic tests of ACTH and cortisol release have been carried out with the aim to identify predictive and specific responses for this differential diagnosis. The pattern of the responses has been attributed to receptors overexpression, yet few studies have been undertaken to confirm such association. The aim of the present study was to verify whether ACTH and cortisol release in response to human CRH (hCRH), desmopressin, and GH releasing peptide (GHRP-6) depends on the magnitude of expression of their respective receptors (CRHR1, AVPR1B e GHSR-1a) in samples of tumors from patients with ACTH-dependent CS. PATIENTS AND METHODS: Twenty two patients (20 with CD and 2 with Ectopic ACTH Syndrome [EAS], lung and thymus carcinoid tumors) from the Division of Endocrinology and Metabolism of University of Sao Paulo School of Medicine, median age of 32 years (15-54 years), being 18 females and 4 males, were evaluated between 2002 and 2004. The patients were submitted to dynamic tests with hCRH (100 µg), desmopressin (10 µg) and GHRP-6 (1 µg/kg), with measurement of ACTH and cortisol levels, and also of GH in the case of GHRP-6 stimulation. Twenty one age and sex-matched controls were submitted to the GHRP-6 test. During surgery, tumor fragments were collected and subsequently processed for total mRNA extraction. Gene expression of CRHR1, AVPR1B and GHSR-1a relative to GAPDH was quantitated by real-time qPCR. Tissue samples of normal pituitary, lung and thymus from necropsy were used as controls. RESULTS: Greater expression of GHSR-1a was observed in patients responsive to the GHRP-6 test, both in those with CD and in the one with pulmonary carcinoid tumor. No enhanced expression of receptors CRHR1 and AVPR1B was found in CD patients responsive to the respective dynamic tests, yet there was a strong association between the in vivo responses and the expression of those receptors in the two patients with EAS. GHRP-6 -induced ACTH and cortisol release was more marked in patients with CD as compared with control individuals, but there was overlap of the responses. GH stimulation was observed in control individuals and, to a lesser extent, in patients with CD. CONCLUSIONS: There was greater expression of GHSR-1a in patients with ACTH-dependent CS who responded to GHRP-6, establishing a direct association between receptor gene expression and the in vivo response to the secretagogue in both CD patients and those with EAS. An association between expression of CRHR1 and AVPR1B and the in vivo response to the respective secretagogues was found in patients with EAS but not in those with CD. In view of the response to GHRP-6 in a patient with EAS, we considered the use of this peptide in the differential diagnosis of ACTH-dependent CS of limited value.

O cetoconazol, inicialmente descrito como um agente antifúngico, revelou-se um potente inibidor da esteroidogênese adrenal, podendo, assim, ser utilizado no manejo da doença de Cushing, como terapia primária ou após insucesso cirúrgico, enquanto aguarda o efeito da radioterapia. Durante o tratamento com cetoconazol, uma redução dos níveis de cortisol é observada, usualmente não acompanhada por uma elevação do ACTH plasmático, como poderia ser esperada. Este fenômeno paradoxal, caracterizado pela redução do cortisol com níveis de ACTH inadequadamente normais ou não elevados, pode estar relacionado a uma ação adicional do cetoconazol nas células hipofisárias produtoras de ACTH. Para se testar essa hipótese, alguns estudos in vitro realizados na década de 80, avaliando a secreção de ACTH na vigência do cetoconazol, sugeriram a sua ação em células adenohipofisárias. Em adição, foi evidenciado que o cetoconazol ativou vias de apoptose em linhagens tumorais não hipofisárias. O presente estudo tem como objetivo avaliar o efeito in vitro do cetoconazol na viabilidade celular e na expressão de genes envolvidos na apoptose e replicação do DNA em linhagens tumorais hipofisárias imortalizadas corticotróficas (AtT-20), gonadotróficas (alfaT3.1), mamossomatotróficas (GH3) e mamotróficas (MMQ), utilizando-se a técnica de RT-qPCR. Os resultados mostraram que, na presença do cetoconazol, ocorreu uma redução da viabilidade celular nas linhagens hipofisárias, de forma concentração-dependente, às custas do estímulo da via extrínseca e intrínseca da apoptose, com aumento da expressão dos receptores de morte celular (ex.: Fas, TNFR) e/ou caspases (ex.: -2, -3, -6 ,-7 ,-9). Estes resultados foram associados a um aumento da expressão gênica dos inibidores do ciclo celular p21 (nas linhagens GH3 e alfaT3.1) e p27 (nas linhagens GH3 e MMQ), com uma redução acentuada da expressão destes genes após retirada do cetoconazol do meio de cultura. Concluímos que o cetoconazol tem o potencial de reduzir a viabilidade celular em linhagens tumorais hipofisárias possivelmente devido a uma ação citotóxica (pelo aumento de genes pró-apoptóticos) e citostática (pelo aumento de genes inibidores do ciclo celular) / Ketoconazole, initially described as an antifungal agent, proved to be a potent inhibitor of steroidogenesis, allowing its use in the management of Cushing\'s disease as primary or after unsuccessfully surgery and waiting the effect of radiotherapy. During treatment with ketoconazole, there a reduction in the cortisol levels is observed, usually not accompanied by an elevation of plasmatic ACTH, as could be expected. This paradoxical phenomenon, characterized by reduced cortisol with ACTH levels inappropriately normal or not elevated, could be related to an additional action of ketoconazole on ACTH-producing pituitary cells. In agreement with this hypothesis, some in vitro studies in the 80\'s, evaluating ACTH secretion in the presence of ketoconazole, suggested its action in pituitary cells. In addition, ketoconazole activated apoptosis pathways in non-pituitary tumor cell lines. Therefore, the present study aims to revisit this topic and evaluate the in vitro effect of ketoconazole on cell viability and expression of genes involved in apoptosis and DNA replication by RT-qPCR in immortalized pituitary tumoral corticotroph (AtT-20), gonadotroph (alphaT3.1), mammosomatotroph (GH3), mammotroph (MMQ) cell line. As a result, there was a reduction in pituitary cell viability with ketoconazole, in a concentration-dependent manner, due to stimulation of the extrinsic and intrinsic pathway of apoptosis, with increased expression of cell death receptors (eg. Fas, TNFR) and/or caspases (eg. -2, -3, -6, -7, -9). These results were associated with an increased gene expression of the cell cycle inhibitors p21 (in GH3 and alphaT3.1 cell line), and also p27 (in GH3 and MMQ cell line), with a significant reduction in the expression of these genes after removal of ketoconazole in the media. In conclusion, the ketoconazole have the potential of reduce cell viability in pituitary tumoral lineages possibly due to a cytotoxic effect (by increasing of pro-apoptotic genes) and cytostatic (by increasing of inhibitors of cell cycle genes)

Os tumores hipofisários mesmo sendo, em sua maioria, benignos, podem apresentar comportamento invasivo, com extensão para seio cavernoso, seio esfenoidal e clivo. As metaloproteinases de matriz tipo 2 (MMP-2) e 9 (MMP-9) e o inibidor tecidual de metaloproteinases-2 (TIMP-2) têm sido estudados em relação ao comportamento invasivo desses tumores, em especial quanto à invasão do seio cavernoso. Esse estudo teve como objetivo avaliar a expressão proteica das MMP-2, MMP-9 e do TIMP-2 nos tumores hipofisários e sua relação com invasão do seio cavernoso e, de maneira inédita, investigar a expressão dessas proteínas em nível plasmático. Adicionalmente, foram avaliadas a expressão dos RNAs mensageiros (RNAm) das MMP-2 e TIMP-2 com intuito de correlacioná-las com a expressão proteica no tecido tumoral, bem como a expressão do marcador de proliferação Ki67. Foram selecionados 77 casos, todos com amostras de tumor emblocado em parafina para análise imuno-histoquímica (IHQ). Destes, foram coletadas amostras de tumor fresco em 29 pacientes e de sangue periférico pré-operatório em outros 29 casos. A expressão proteica plasmática foi detectada de forma semi-quantitativa utilizando um arranjo de anticorpos em membrana comercial. A expressão dos RNAm das MMP-2 e TIMP-2 foi avaliada por reação em cadeia da polimerase quantitativo (qPCR) em tempo real. Do total de casos, 20 pacientes apresentavam tumores com invasão para o seio cavernoso. A expressão proteica tumoral das MMP-2, MMP-9 e TIMP-2 apresentou-se aumentada no grupo invasivo, contudo esta diferença não foi estatisticamente significante em relação ao grupo não- invasivo. A expressão plasmática das MMP-9 e TIMP-2 também não mostrou diferença entre os dois grupos e não se correlacionou com a expressão tumoral. A expressão plasmática da MMP-2 não foi detectada em nenhum caso. Quanto à expressão do RNAm das MMP-2 e TIMP-2, também não houve diferença significante entre os grupos e nem correlação com a expressão proteica tecidual ou plasmática. Foi observada uma diferença significante na dimensão tumoral [3.6 (2.5-5.2) x 2.0 (1.3-2.7); P < 0.001] e no índice do Ki67 [1.05 (0.27-25) x 0.5 (0.2-1.0); P < 0.001] entre os grupos invasivo e não-invasivo respectivamente. Em conclusão, em nossa coorte, não foi encontrada relação entre a expressão tecidual e plasmática das MMP-2, MMP-9 e TIMP-2 e a invasão para o seio cavernoso nos adenomas hipofisários / Pituitary tumors, although mostly benign, may present invasive behavior, with extension to the cavernous sinus, sphenoid sinus and clivus. Type 2 (MMP-2) and type 9 (MMP-9) matrix metalloproteinases and the metalloproteinase tissue inhibitor type 2 (TIMP-2) have been studied in relation to the invasive behavior of these tumors, especially regarding invasion of the cavernous sinus. The aim of this study was to evaluate the protein expression of MMP-2, MMP-9 and TIMP-2 in pituitary tumors and its relation with invasion of the cavernous sinus and, in an unprecedented way, to investigate the expression of these proteins at the plasma level. Additionally, expression of MMP-2 and TIMP-2 messenger RNAs (mRNAs) was evaluated in order to correlate with protein expression in tumor tissue, as well as Ki67 proliferation marker expression. A total of 77 cases were selected, all of them with paraffin embedded tumor samples for immunohistochemical analysis (IHC). Of these, fresh tumor samples were collected in 29 patients and preoperative peripheral blood in another 29 cases. Protein plasma expression was detected semi-quantitatively using a commercial membrane antibody array. Expression of MMP-2 and TIMP-2 mRNAs was evaluated by quantitative realtime polymerase chain reaction (qPCR). Of the total cases, 20 patients presented tumors invasive to the cavernous sinus. Tumor protein expression of MMP-2, MMP-9 and TIMP-2 was increased in the invasive group, not reaching, however, statistically significant difference as compared with the non-invasive group. Plasma expression of MMP-9 and TIMP-2 also did not differ between the two groups and did not correlate with tumor expression. Plasma expression of MMP-2 was not detected in any case. Concerning MMP-2 and TIMP-2 mRNA expression, there was also no significant difference between groups and no correlation with tissue or plasma protein expression was observed. A significant difference was observed in tumor size [3.6 (2.5-5.2) x 2.0 (1.3-2.7); P < 0.001] and in the Ki67 index [1.05 (0.27-25) x 0.5 (0.2-1.0); P < 0.001] between the invasive and non-invasive groups respectively. In conclusion, in our cohort, no relationship was found between the tissue and plasma expression of MMP-2, MMP-9 and TIMP-2 and the invasion of the cavernous sinus in pituitary adenomas