Orientador: Maria Luiza Silveira Mello / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T06:29:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ghiraldini_FlaviaGerelli_D.pdf: 75704253 bytes, checksum: 9d1afc3cebcffd05000b5efb25d3996d (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O diabetes mellitus do tipo I (DM1) caracteriza-se pela ocorrência de insulite com consequente hiperglicemia e poliuria. Alterações celulares estruturais e metabólicas decorrentes do aumento da glicemia podem provocar fenótipos de envelhecimento precoce. O envelhecimento celular e resultado de fatores intrínsecos e extrínsecos, que alteram a estrutura e a organização da cromatina e que, consequentemente, afetam a expressão gênica. As sirtuinas, deacetilases NAD+-dependentes, estão envolvidas na transcrição gênica, reparo de DNA, transcrição do rDNA, regulação metabólica e remodelação cromatinica. As sirtuinas nucleares, especialmente Sirt1 e Sirt6 estão envolvidas com o envelhecimento precoce, no metabolismo de glicose e na resposta a inflamação. O presente trabalho teve como objetivo geral comparar os processos de remodelação cromatinica em hepatocitos sob o efeito da hiperglicemia e do envelhecimento, usando-se modelo animal (camundongos). Um modelo de cultura celular (HepG2) foi também utilizado para estudo de efeitos da hiperglicemia, utilizando-se como metodologias analisem morfológicas e moleculares. Foi observado um aumento em conteúdo de DNA e em acessibilidade da cromatina a MNase mais acentuado em hepatocitos de animais DM1 do que de idosos. O aumento na abundancia de Sirt1 em animais hiperglicêmicos não refletiu em sua maior atividade, enquanto em idosos houve um decréscimo generalizado nesses parâmetros e aumento da aceptilação de sítios histónicos. Em animais DM1, Sirt6 apresentou abundancia semelhante à de Sirt1, possivelmente devido à alta fragmentação de DNA observada nesses animais, diferente do ocorrido em idosos. Ambos os animais DM1 e idosos apresentaram baixa relação área AgNOR+/área nuclear. Em animais diabéticos isto foi devido ao aumento na área nuclear, enquanto nos idosos, foi devido à diminuição na área AgNOR+ e aumento na área nuclear. O aumento na metilação de rDNA na porção 18S e a baixa abundancia de Sirt7 confirmam diminuição no metabolismo celular no envelhecimento. Em hepatocitos de camundongos DM1 e idosos foi observado genes diferencialmente expressos relacionados à inflamação. Admite-se que no primeiro caso este achado seja devido à natureza auto-imune da doença, enquanto no segundo possa ser um indício de inflamação naturalmente encontrada em processos de envelhecimento. Em animais DM1, a expressão diferenciada de genes envolvidos com metabolismo de lipídios poderia contribuir para com a peroxidação lipídica e produção de ROS levando a esteatose hepática. Nas células HepG2, alterações na expressão dos genes Apoe, Igfbp1 e Foxo1, ocorridas em meio de cultura hiperglicêmicas, tornaram-se revertidas quando as células foram retornadas a normoglicemia. Contudo, as abundancias das marcações epigenéticas nos promotores desses genes decresceram progressivamente, indicação de uma memória hiperglicêmica, dado não observado em modelo animal. A análise do fenótipo nuclear dessas células indicou possível indução da proliferação celular quando retornadas a normoglicemia. A inibição de sirtuinas aumentou o conteúdo Feulgen-DNA e o contraste entre cromatina condensada e não-condensada, indicativo de atuação na proliferação celular e na remodelação cromatinica. DM1 e envelhecimento, portanto, não podem ser considerados fenômenos idênticos, pois enquanto no primeiro ha um mecanismo compensatório que promove alterações genéticas, epigenéticas e remodelação cromatinica, no segundo ha um decréscimo generalizado no metabolismo celular levando a modificações diferentes nos mesmos parâmetros / Abstract: Diabetes mellitus type I (DM1) is characterized by insulitis and consequent hyperglycemia and polyuria. Structural and metabolic changes in the cell caused by hyperglycemia might induce an early-ageing phenotype. Both intrinsic and extrinsic agents might contribute to cellular ageing thus leading to chromatin structural changes and differential gene expression. Sirtuins, NAD+-dependent deacetilases, play a role in cell metabolism, transcription, DNA repair and chromatin remodeling. Sirt1 and Sirt6, especially, are nuclear proteins related to early-ageing, glucose metabolism and inflammatory response. The general purpose of the present work was to compare processes of chromatin remodeling in hepatocytes under the effects of hyperglycemia and aging, using mouse models. A model using cells in culture (HepG2) was also used to study the effects caused by hyperglycemia. The methodology used involved morphological and molecular analysis. An increase in DNA content and chromatin accessibility to MNAse was found more pronounced in hepatocytes from DM1 than from aged mice. Despite the high abundance of Sirt1 in DM1 animals, its activity was not proportionally high, whereas in old animals there was a reduction in these parameters, increasing the acetylation of Sirt1-histonic sites. In DM1 mice, Sirt6 presented similar abundance as Sirt1, possibly due to the high DNA fragmentation, different to what was found in aged animals. Both DM1 and normoglycemic old mice presented a decrease in AgNOR+ area/nuclear area ratio. While in DM1 animals it was a result from the increase in nuclear area, in old animals it was a combination of increased nuclear areas and decreased AgNOR+ areas. The DNA methylation increase in the 18S rDNA region and the decrease in Sirt7 abundance in the hepatocytes from old mice support the hypothesis of diminished cellular metabolism. Differential expression analysis for DM1 and old mouse hepatocytes presented a high number of genes involved in the inflammatory response. While in the former it could be an autoimmune characteristic of the disease, in the latter it might be an evidence of inflammatory state naturally associated with aging. Moreover, DM1 mice also presented differential gene expression related to lipid metabolism, which could contribute to increase lipid peroxidation and ROS production leading to hepatic steatosis. HepG2 cells showed changes in Apoe, Igfbp1 and Foxo1 expression in hyperglycemic medium and they were reverted when the cells returned to normoglycemic medium. The epigenetic marks, however, presented a progressive decrease in abundance, indicative of a hyperglycemic memory, which was not observed in DM1 animals. The nuclear phenotype in HepG2 cells under these same experimental conditions indicated a possible induction in cellular proliferation when the cells were returned to the normoglycemic medium. Inhibition of sirtuins increased the contrast between condensed and non-condensed chromatin and the Feulgen-DNA content, indicating a role in cell division and chromatin remodeling. Therefore, DM1 and ageing cannot be considered as identical processes, because while in DM1 there is a compensatory mechanism that induces changes in epigenetic marks, chromatin remodeling and differential gene expression, there is a general decrease in cell metabolism under aging that leads to different changes in the same parameters / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

INTRODUÇÃO: A premissa da relação entre o processo aterosclerótico da doença arterial coronária e a doença periodontal é o processo imunoinflamatório, que provoca aumento significativo da concentração sérica de lectina ligadora de manose. Essa proteína é parte da imunidade inata e possui a capacidade de ligar-se aos resíduos de manose comuns a vários patógenos. Estudos em animais também mostraram que o aumento da concentração sérica de sirtuína-1 associou-se com redução da inflamação. Evidências indicam que a sirtuína-1 desempenha um importante papel na proteção vascular e está associada ao envelhecimento. OBJETIVOS: Esse estudo analisou a influência do tratamento não cirúrgico da doença periodontal na concentração sérica de lectina ligadora de manose e de sirtuína-1 em pacientes com doença periodontal e doença arterial coronária. MÉTODOS: Foram avaliados 78 pacientes, 38 mulheres e 40 homens, média de idade de 58 ± 8 anos, distribuídos em 4 grupos: 20 indivíduos saudáveis (grupo 1), 18 pacientes com doença aterosclerótica e isentos da doença periodontal (grupo 2), 20 pacientes com doença periodontal e isentos de doença arterial coronária (grupo 3) e 20 pacientes com doença aterosclerótica e doença periodontal (grupo 4). Foi realizada coleta de sangue periférico no início e no final do tratamento da doença periodontal. RESULTADOS: Observou-se uma correlação negativa entre a variação de concentração de lectina ligadora de manose e a concentração de sirtuína-1 (r = -0,30; p = 0,006). Os pacientes que receberam tratamento para a doença periodontal tiveram aumento da concentração sérica de sirtuína-1 (1,06 ± 1,03 vs. 1,66 ± 1,64 ng/mL; p < 0,001) e redução da concentração sérica da lectina ligadora de manose (1099,35 ± 916,59 vs. 861,42 ± 724,82 ng/mL; p < 0,001) quando comparamos os momentos inicial e final do estudo. Observou-se redução na concentração sérica da lectina ligadora de manose e aumento da sirtuína-1 nos grupos 3 e 4. A lectina ligadora de manose reduziu no grupo 3 de 886,27 ± 906,72 ng/mL para 689,94 ± 808,36 ng/mL (p = 0,003) e no grupo 4 de 1.312,43 ± 898,21 ng/mL para 1.032,90 ± 602,52 ng/mL (p = 0,010). A sirtuína-1 aumentou no grupo 3 de 0,80 ± 1,01 ng/mL para 1,49 ± 1,55 ng/mL (p = 0,005) e no grupo 4 de 1,32 ± 1,00 ng/mL para 1,82 ± 1,75 ng/mL (p = 0,044). CONCLUSÃO: O tratamento periodontal, além da redução de processos infecciosos locais, promove a redução da concentração sérica de lectina ligadora de manose e aumento da concentração sérica da sirtuína-1. Porém, estudos prospectivos serão necessários para avaliar o impacto das alterações séricas dessas proteínas como biomarcadores na incidência e no prognóstigo da doença arterial coronária / BACKGROUND: The premise of the relationship between the atherosclerotic process of coronary artery disease and periodontal disease is the immunoinflammatory process, which causes a significant increase in serum concentration of mannose-binding lectin. This protein is part of the innate immunity and has the ability to bind to the mannose residues common to various pathogens. Animal studies also showed that increased serum concentration of sirtuin-1 was associated with reduced inflammation. Evidence indicates that sirtuin-1 plays an important role in vascular protection and is associated with aging. OBJECTIVES: This study examined the influence of nonsurgical treatment of periodontal disease on the serum concentration of mannose-binding lectin and sirtuin-1 in patients with periodontal disease and coronary artery disease. METHODS: Seventy-eight patients, 38 women and 40 men, mean age 58 ± 8 years old, were divided into 4 groups: 20 healthy subjects (group 1), 18 patients with coronary artery disease and without periodontal disease (group 2), 20 patients with periodontal disease and without coronary artery disease (group 3) and 20 patients with coronary artery disease and periodontal disease (group 4). Peripheral blood samples were collected at the beginning and at the end of the treatment of periodontal disease. RESULTS: A negative correlation was observed between the concentration of mannose-binding lectin and the concentration of sirtuin-1 (r = -0.30; p = 0.006). Patients receiving treatment for periodontal disease had increased serum sirtuin-1 concentration (1.06 ± 1.03 vs. 1.66 ± 1.64 ng/mL, p < 0.001) and decreased serum mannose-binding lectin concentration (1099.35 ± 916.59 vs. 861.42 ± 724.82 ng/mL, p <0.001) when we compared the initial and final moments of the study. Reduction in serum concentration of mannose-binding lectin and increase of sirtuin-1 were observed in groups 3 and 4. Mannosebinding lectin reduced in group 3 from 886.27 ± 906.72 ng/mL to 689.94 ± 808 (P = 0.010), and in group 4 from 1312.43 ± 898.21 ng / mL to 1032.90 ± 602.52 ng/mL (p = 0.010). Sirtuin-1 increased in group 3 from 0.80 ± 1.01 ng/mL to 1.49 ± 1.55 ng/mL (p = 0.005) and in group 4 of 1.32 ± 1.00 ng/mL to 1.82 ± 1.75 ng/mL (p = 0.044). CONCLUSION: The periodontal treatment, in addition to the reduction of local infectious processes, promoted the reduction of serum concentration of mannose-binding lectin and increased serum concentration of sirtuin-1. However, prospective studies will be needed to evaluate the impact of serum changes of these proteins as biomarkers on the incidence and prognosis of coronary artery disease

A deterioração da qualidade do ar ameaça a qualidade de vida dos habitantes nos grandes centros urbanos. O material particulado é constituído por partículas sólidas, liquidas ou ambas, suspensas no ar. Os idosos são o grupo mais susceptível aos efeitos negativos da poluição atmosférica e essa população vem crescendo exponencialmente no mundo inteiro, afetando quase todos os países do mundo, inclusive o Brasil, atualmente representado por um contingente populacional correspondente a 12% da população. Há fortes evidências científicas que a família das sirtuínas tem grande influência no processo do envelhecimento e longevidade em mamíferos. Alguns estudos apontam uma função protetora de Sirt1 contra danos oxidativos e inflamatórios. O objetivo desse estudo é avaliar o impacto das partículas de exaustão do diesel (DEP) sobre as alterações pulmonares decorrentes do processo do envelhecimento e a possível influência das sirtuínas nesse processo. Camundongos na idade de 02 meses e 15 meses foram expostos às DEPs ou ar filtrado por um período de 30 dias. Os parâmetros funcionais foram mensurados pelo FlexiVent. Após as exposições os pulmões foram coletados e o perfil inflamatório avaliado no lavado broncoalveolar e no soro sanguíneo, por meio das mensurações das citocinas inflamatórias. O estresse oxidativo foi avaliado pela técnica espectrofotometria e as expressões gênicas das sirtuínas foram mensuradas pela técnica de RT-PCR no homogenato do tecido pulmonar. De forma geral, além das diferenças fisiológicas relacionadas com a idade observadas entre os grupos, às exposições as DEPs afetaram o perfil inflamatório e as enzimas antioxidantes nos animais jovens e idosos. Além disso, o grupo idoso apresentou comprometeram no ganho de peso e aumento na deposição de colágeno no tecido pulmonar. As exposições diminuíram os níveis de expressão gênica de Sirt6, enquanto Sirt1 foi diminuída com a idade. Em conjunto, os dados obtidos enfatizam que as exposições ambientais aceleraram as alterações associadas ao envelhecimento pulmonar / The deterioration of the air quality is a threat to the habitants\' quality of life of the urban areas. The particulate matter is constituted of solid, liquid or both particles suspended in the air. The elderly is the most susceptible group to the harmful effects of the air pollution and this population is growing exponentially all over the world, affecting almost all the countries, including Brazil, representing 12.1% of the population. There are strong scientific evidences that the Sirtuins family has great influence on the aging and longevity process in mammals. Some studies points out a Sirt1 protective function against oxidative and inflammatory damage. This study aims to evaluate the impact of the diesel exhaust particulate (DEP) on the pulmonary changes resulting from the aging process and the possible influence of the sirtuins in this process. Two and fifteen months old mice were exposed to DEP for a period of 30 days. Functional assessment of these animals was measured by FlexiVent. After the exposures period, the lungs were collected and the inflammatory profile was evaluated in the bronchoalveolar lavage fluid and blood serum, by means of the measurements of the inflammatory cytokines. Oxidative stress was evaluated by the spectrophotometric technique and the sirtuin gene expression was measured by the RT-PCR technique in the pulmonary tissue homogenate. Our data showed that, besides the age-related physiological differences observed between groups; exposure to DEPs affected the inflammatory profile and antioxidant enzymes activity in young and old animals. In addition, the elderly group presented compromised in weight gain and increased collagen deposition in lung tissue. The exposures decreased gene expression levels of Sirt6, while Sirt1 was decreased due to age. Taken together, the data obtained emphasize that environmental exposures accelerated changes associated with pulmonary aging

SIRT3, membre de la família d’histona desacetilases anomenades sirtuïnes, es troba principalment al mitocondri de teixits amb alta capacitat oxidativa com el fetge, el múscul, el cor o teixit adipós marró i s’ha suggerit que podria jugar un paper en el metabolisme energètic. Per tal d’aclarir el seu rol en la termogènesi, es van analitzar les alteracions en ratolins SIRT3 -/- en dues condicions de termogènesi augmentada: la transició fetal-neonatal i l’exposició crònica al fred en ratolins adults, així com es va estudiar l’efecte del dejuni en adults SIRT3 -/- , una situació en la qual la termogènesi es troba inhibida. Es van avaluar els possibles trastorns metabòlics i es va procedir a un anàlisi transcriptòmic de l’expressió de gens marcadors de diverses vies metabòliques en el teixit adipós marró i altres teixits dels ratolins SIRT3 -/-. Els resultats obtinguts indiquen alteracions significatives en el període perinatal com a conseqüència de la manca de SIRT3, però no en l’etapa adulta. Concretament s’observa una expressió alterada de gens específics de la termogènesi (uncoupling protein-1, 5’-deiodinasa, PRDM16) al teixit adipós marró en l’etapa perinatal així com de gens implicats en l’oxidació d’àcids grassos (enoil-CoA, hidratasa/3-hidroxiacil CoA deshidrogenasa, acil-CoA oxidasa) al fetge durant l’etapa perinatal. Aquests resultats posen de manifest el potencial paper de SIRT3 en aquestes vies metabòliques i evidencien l’existència de mecanismes homeostàtics durant el desenvolupament post-natal capaços de compensar l’absència de SIRT3 en l’animal adult. D’altra banda, mitjançant l’ús d’adipòcits SIRT3 -/-, vam determinat que SIRT3 és necessària per una resposta apropiada de les cèl•lules a l’activació noradrenèrgica mediada per AMPc de l’expressió de gens termogènics del teixit adipós marró. El co-activador transcripcional PGC1α (peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α) indueix l’expressió de SIRT3 en adipòcits blancs i fibroblasts embrionaris com a part de la inducció global del patró d’expressió gènica específic del teixit adipós marró. A les cèl•lules sense SIRT3, PGC1α no pot induir completament l’expressió de gens termogènics específics de l’adipòcit marró. PGC1α activa la transcripció del gen SIRT3 a través de la coactivació del receptor nuclear orfe ERRα (estrogen-related receptor-α) el qual s’uneix a la regió proximal del promotor del gen SIRT3. Assajos de pèrdua de funció d’ERRα, indiquen que aquest és necessari per a la completa inducció de la l’expressió del gen SIRT3 en resposta a PGC1α. Aquests resultats indiquen que PGC1α controla l’expressió de SIRT3 i que aquesta acció és un component essencial del mecanisme global a través del qual PGC1α indueix la completa adquisició del fenotip d’adipòcit marró diferenciat. / SIRT3 is a member of the sirtuin family of deacetylases present mainly in mitochondria from tissues such as brown adipose tissue, liver, muscle and heart. To gain insight in the role of SIRT3 in thermogenesis, we determined the alterations in mice with targeted invalidation of the SIRT3 gene (SIRT3-/- mice) in two conditions of enhanced thermogenesis: the fetal-to-neonatal transition and chronic exposure of adult mice to cold, an in fasting of adult mice, a condition of depressed thermogenesis. Assessment of overall metabolic disturbances and a transcritomic analysis of the expression of marker genes of distinct metabolic pathways were performed in brown fat and other tissues from SIRT3-/- mice in these conditions. Results indicated significant alterations in the perinatal period but not in adulthood. Impaired expression of specific genes of thermogenesis in perinatal brown fat, and of genes encoding components of the fatty acid oxidation machinery in perinatal liver were observed in SIRT3-/- mice. Results highlight the potential role of SIRT3 in these pathways and evidence the appearance of homeostatic mechanisms during post-natal development capable to compensate for the absence of SIRT3 in the adulthood. Sirt3 is expressed in association with brown adipocyte differentiation. Using Sirt3-null brown adipocytes, we determined that Sirt3 is required for an appropriate responsiveness of cells to noradrenergic, cAMP-mediated activation of the expression of brown adipose tissue thermogenic genes. The transcriptional coactivator Pgc-1α (peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1 α) induced Sirt3 gene expression in white adipocytes and embryonic fibroblasts as part of its overall induction of a brown adipose tissue-specific pattern of gene expression. In cells lacking Sirt3, Pgc-1α failed to fully induce the expression of brown fat-specific thermogenic genes. Pgc-1α activates Sirt3 gene transcription through coactivation of the orphan nuclear receptor Err (estrogen-related receptor)- α, which bound the proximal Sirt3 gene promoter region. Errα knockdown assays indicated that Errα is required for full induction of Sirt3 gene expression in response to Pgc-1 α. The present study indicates that Pgc-1α controls Sirt3 gene expression and this action is an essential component of the overall mechanisms by which Pgc-1α induces the full acquisition of a brown adipocyte differentiated phenotype.

A deterioração da qualidade do ar ameaça a qualidade de vida dos habitantes nos grandes centros urbanos. O material particulado é constituído por partículas sólidas, liquidas ou ambas, suspensas no ar. Os idosos são o grupo mais susceptível aos efeitos negativos da poluição atmosférica e essa população vem crescendo exponencialmente no mundo inteiro, afetando quase todos os países do mundo, inclusive o Brasil, atualmente representado por um contingente populacional correspondente a 12% da população. Há fortes evidências científicas que a família das sirtuínas tem grande influência no processo do envelhecimento e longevidade em mamíferos. Alguns estudos apontam uma função protetora de Sirt1 contra danos oxidativos e inflamatórios. O objetivo desse estudo é avaliar o impacto das partículas de exaustão do diesel (DEP) sobre as alterações pulmonares decorrentes do processo do envelhecimento e a possível influência das sirtuínas nesse processo. Camundongos na idade de 02 meses e 15 meses foram expostos às DEPs ou ar filtrado por um período de 30 dias. Os parâmetros funcionais foram mensurados pelo FlexiVent. Após as exposições os pulmões foram coletados e o perfil inflamatório avaliado no lavado broncoalveolar e no soro sanguíneo, por meio das mensurações das citocinas inflamatórias. O estresse oxidativo foi avaliado pela técnica espectrofotometria e as expressões gênicas das sirtuínas foram mensuradas pela técnica de RT-PCR no homogenato do tecido pulmonar. De forma geral, além das diferenças fisiológicas relacionadas com a idade observadas entre os grupos, às exposições as DEPs afetaram o perfil inflamatório e as enzimas antioxidantes nos animais jovens e idosos. Além disso, o grupo idoso apresentou comprometeram no ganho de peso e aumento na deposição de colágeno no tecido pulmonar. As exposições diminuíram os níveis de expressão gênica de Sirt6, enquanto Sirt1 foi diminuída com a idade. Em conjunto, os dados obtidos enfatizam que as exposições ambientais aceleraram as alterações associadas ao envelhecimento pulmonar / The deterioration of the air quality is a threat to the habitants\' quality of life of the urban areas. The particulate matter is constituted of solid, liquid or both particles suspended in the air. The elderly is the most susceptible group to the harmful effects of the air pollution and this population is growing exponentially all over the world, affecting almost all the countries, including Brazil, representing 12.1% of the population. There are strong scientific evidences that the Sirtuins family has great influence on the aging and longevity process in mammals. Some studies points out a Sirt1 protective function against oxidative and inflammatory damage. This study aims to evaluate the impact of the diesel exhaust particulate (DEP) on the pulmonary changes resulting from the aging process and the possible influence of the sirtuins in this process. Two and fifteen months old mice were exposed to DEP for a period of 30 days. Functional assessment of these animals was measured by FlexiVent. After the exposures period, the lungs were collected and the inflammatory profile was evaluated in the bronchoalveolar lavage fluid and blood serum, by means of the measurements of the inflammatory cytokines. Oxidative stress was evaluated by the spectrophotometric technique and the sirtuin gene expression was measured by the RT-PCR technique in the pulmonary tissue homogenate. Our data showed that, besides the age-related physiological differences observed between groups; exposure to DEPs affected the inflammatory profile and antioxidant enzymes activity in young and old animals. In addition, the elderly group presented compromised in weight gain and increased collagen deposition in lung tissue. The exposures decreased gene expression levels of Sirt6, while Sirt1 was decreased due to age. Taken together, the data obtained emphasize that environmental exposures accelerated changes associated with pulmonary aging

As sirtuínas 1-7 (SIRT) constituem uma família altamente conservada de desacetilases de histonas que, de modo geral, participam da regulação da longevidade em diversos organismos, modulando a resposta celular frente ao stress oxidativo e promovendo mecanismo de reparo de DNA, parada do ciclo celular, estabilidade telomérica, senescência e apoptose celulares. O envolvimento das SIRTs no processo tumorigênico tem sido bastante investigado, contudo ainda não existe descrição do estudo desses genes nos adenomas hipofisários. O objetivo desse estudo foi avaliar a expressão gênica das SIRT1-7 nos somatotropinomas e adenomas hipofisários clinicamente não funcionantes (ACNF) e sua relação com o tamanho e a invasividade do tumor. A expressão das sirtuínas foi ainda correlacionada à expressão dos marcadores de senescência CDKN1A (p21) e CDKN2A (p16) e do proto-oncogene PTTG (pituitary tumor transforming gene). Foram selecionados 68 pacientes, 37 somatotropinomas e 31 portadores de ACNF. Desses casos, 33 apresentavam tumores invasivos e 35 eram não invasivos. A quantificação do RNAm das SIRT1-7, CDKN1A, CDKN2A e PTTG foi realizada nas amostras tumorais pela técnica de PCR em tempo real utilizando o método de quantificação relativa 2-??Ct. A hiperexpressão da SIRT1 foi observada em 86,5% dos somatotropinomas versus 41,9% dos ACNF (P < 0.01), não sendo observada perda de expressão desse gene. A SIRT3 foi mais hipoexpressa nos ACNF em relação aos somatotropinomas (77,4% e 40,5%, respectivamente; P < 0.01). A SIRT4 foi hipo e hiperexpressa, respectivamente, em 45,2% e 12,9% dos ACNF e 16,2% e 24,3% dos somatotropinomas (P=0.03). A hipoexpressão da SIRT7 também foi maior nos ACNF (67,7%) versus somatotropinomas (32,4%; P=0.01) e, para ambos os subtipos, o percentual de casos apresentando hiperexpressão desse RNAm foi baixo. O padrão de expressão das SIRT2 e 5 não diferiu entre os subtipos tumorais e não se mostrou alterado em relação ao pool de hipófises normais. Não foi observada diferença estatisticamente significante na expressão dos genes das sirtuínas entre os grupos de tumores invasivos e não invasivos. Contudo, a expressão das SIRT1 e 3 foi relacionada ao tamanho tumoral; nos casos com hiperexpressão da SIRT1 a média do maior diâmetro tumoral foi 2.4 ± 1.1 enquanto nos pacientes com expressão normal foi de 3.3 ± 1.3 (P < 0.01). Já os casos com perda de expressão da SIRT3 apresentaram tumores maiores (3.1 ± 1.2) em relação aos casos com expressão normal (2.2 ± 1.1; P < 0.01). A expressão de todas as SIRTs apresentou correlação positiva moderada (SIRT1-5,7) ou forte (SIRT6) com a expressão do CDKN1A. Uma correlação positiva foi observada também em relação a expressão do CDKN2A. Contudo, essa foi fraca e presente apenas para as SIRTs 3-5. Em relação ao PTTG, foi observado apenas uma fraca correlação com a expressão da SIRT1 e SIRT3. Em conclusão, esses resultados sugerem que a hiperexpressão de SIRT1 e a hipoexpressão das SIRTs 3, 4 e 7 podem estar relacionadas ao processo tumorigênico nos somatotropinomas e ACNFs, respectivamente e, em especial as SIRT1 e 3, ao controle da proliferação celular nesses adenomas / Sirtuins 1-7 (SIRT) are a highly conserved family of histone deacetylases. In general, these proteins are involved in the regulation of longevity in several organisms, modulating the cellular response to oxidative stress. SIRTs can also regulate DNA repair, telomeric stability, cell senescence and apoptosis. Due to their functions, there is a growing interest in the role of sirtuins in tumorigenesis. However, these genes were not investigated in pituitary tumors so far. In this study, SIRT1-7 gene expression was evaluated in somatotropinomas and nonfunctioning pituitary adenomas (NFPA) and related to tumor size and invasiveness. SIRT1-7 expression was also correlated with cellular senescence markers CDKN1A (p21) e CDKN2A (p16) and with the proto-oncogene PTTG (pituitary tumor transforming gene). Sixty-eight patients were selected, 37 with somatotropinomas and 31 with NFPA. Tumor invasion was observed in 33 patients. SIRT1-7, CDKN1A, CDKN2A and PTTG mRNA levels was evaluated from pituitary tumor samples by the real-time PCR using 2-??Ct relative quantification. Pronounced differences in SIRT1, 3, 4 and 7 expressions were identified between somatotropinomas and NFPA. Overexpression of SIRT1 was observed in 86.5% of somatotropinomas versus 41.9% of NFPA (P < 0.01) whereas underexpression was not detected. SIRT3 was more underexpressed in NFPA than somatotropinomas (77.4% and 40.5%, respectively, P < 0.01). SIRT4 was under and overexpressed, respectively, in 45.2% and 12.9% of NFPA and 16.2% and 24.3% of somatotropinomas (P=0.03). SIRT7 underexpression was also higher in NFPAs (67.7%) versus somatotropinomas (32.4%; P=0.01) with few cases showing overexpression. SIRT2 and 5 expressions did not differ between tumors subtypes and was not altered in relation to the normal pituitary gland pool. No statistically significant difference was observed in the expression of these genes between invasive and non-invasive tumor groups. However, SIRT1 and 3 expressions were related to tumor size. Mean of the largest tumor diameter was 2.4 ± 1.1 and 3.3 ± 1.3 (P < 0.01) in adenomas with SIRT1 over- and normal expression, respectively. On the other hand, cases with SIRT3 underepression exhibited larger tumors (3.1 ± 1.2) compared to cases with SIRT3 normal expression (2.2 ± 1.1, P < 0.01). Moderated (SIRT1-5.7) or strong (SIRT6) positive correlation was observed between sirtuins and CDKN1A expression. A weak correlation was observed with respect to CDKN2A expression and SIRTs 3-5. Regarding PTTG mRNA, only a weak correlation with SIRT1 and SIRT3 expression was observed. In conclusion, these results suggest that overexpression of SIRT1 and underexpression of SIRTs 3, 4 and 7 could be related to the tumorigenic process in somatotropinomas and NFPAs, respectively. SIRT1 and 3 could also play a role in control of pituitary adenomas cell proliferation

Submitted by SAMUEL RODRIGUES LOURENÇO DE MORAIS null (samuelrodrigues@foa.unesp.br) on 2016-10-04T19:15:34Z No. of bitstreams: 1 TESE - SAMUEL R L DE MORAIS.pdf: 2524842 bytes, checksum: 61664d3b0e3fff46188835de7508312b (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-10-05T12:13:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 morais_srl_dr_araca.pdf: 2524842 bytes, checksum: 61664d3b0e3fff46188835de7508312b (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-05T12:13:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 morais_srl_dr_araca.pdf: 2524842 bytes, checksum: 61664d3b0e3fff46188835de7508312b (MD5) Previous issue date: 2016-08-22 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A diminuição das concentrações plasmáticas de estrógeno está intimamente relacionada com o aumento do estresse oxidativo e a diminuição da massa muscular em idosos. A terapêutica hormonal estrogênica (THE) e o treinamento de força (TF) apresentam resultados efetivos sobre a manutenção do tecido muscular em idosos. No entanto, os mecanismos responsáveis pelas melhorias induzias por ambas as intervenções são pouco elucidados. Nesse sentido, avaliamos os efeitos da THE, do TF e a associação sobre a manutenção do tecido muscular esquelético de ratas periestropausadas. Ratas Wistar (18 meses) foram distribuídas em: Grupo não treinado (NT-Veh), Grupo NT tratado com a THE (NT-E2), Grupo TF (TF-Veh) e Grupo TF-E2. Os animais receberam a THE (17β estradiol; 2 x semana; 25 µg/kg/administração) e/ou praticaram TF (3 x semana; 80% sobrecarga) durante 16 semanas. A THE e o TF induzem benefícios ao tecido muscular esquelético de ratas periestropausadas, no entanto, por diferentes maneiras. Enquanto a THE induziu diminuição do estresse oxidativo muscular (Dihidroetidina), o TF resultou em melhoras significativas na função muscular, no sistema antioxidante muscular (Catalase) e na expressão de miRNAs (206, 146b e 133a). Já a interação das intervenções resultou em melhora no estado redox (Sirt1, Sirt3, PGC-1α, COXIV), na responsividade dos receptores estrogênicos (ERα, ERβ e GPR30), e atividade de vias de sinalização do tecido muscular (IGF-1/Akt-1/mTOR). Além disso, as intervenções de maneira isolada ou em associação, levaram ao aumento no percentual de fibras glicolíticas e redução das oxidativas. Sugerimos que a aderências das intervenções (associadas ou não) possam minimizar/atenuar a perda da massa muscular observada em fases tardias durante o processo de envelhecimento. / The decrease of estrogen (E2) circulating levels is strongly related to increased oxidative stress and the loss of muscle mass in elderly. The hormone replacement therapy (HRT) and strength training (ST) are the main effective interventions to prevent the loss of muscle mass, however, the mechanisms involved in interventions-induced benefits are not well elucidated. In this sense we evaluate the effect of HRT, ST and association on skeletal muscle maintenance of periestropaused rats. Female Wistar rats (18 months old) were randomly assigned into: non-exercised and non-treated group (NE-Veh), NE treated group (NE-E2), exercised and non-treated group (ST-Veh) and ST-E2 group. The animals received the HRT (17β estradiol; 2 x week; 50 µg/kg/week) and/or performed ST (3 x week, 80% overload) for 16 weeks. The HRT and ST promoted beneficial effects on skeletal muscle of periestropaused rats, however, by different manners. While HRT treatment leaves the reduction of oxidative stress (Dihidroetidine), the ST resulted in significate improvement on skeletal muscle function, in skeletal muscle antioxidant system (Catalase) and in miRNAs expression (2016, 146b and 133a). Already, the association of interventions resulted in improvement of redox state (Sirt1, Sirt3, PGC-1α, COXIV), in estrogen receptor responsiveness (ERα, ERβ and GPR30) and the activity of skeletal muscle signaling pathways (IGF-1/Akt-1/mTOR). In addition, the interventions, isolated or combinated, leaves an increase of the percentage of glycolytic fibers and reduced percentage of oxidative fibers. We suggest that the adherence to interventions (combinated or not) could minimize/attenuate the loss of skeletal muscle mass observed in later phases of aging process. / 13/18907-2

As sirtuínas 1-7 (SIRT) constituem uma família altamente conservada de desacetilases de histonas que, de modo geral, participam da regulação da longevidade em diversos organismos, modulando a resposta celular frente ao stress oxidativo e promovendo mecanismo de reparo de DNA, parada do ciclo celular, estabilidade telomérica, senescência e apoptose celulares. O envolvimento das SIRTs no processo tumorigênico tem sido bastante investigado, contudo ainda não existe descrição do estudo desses genes nos adenomas hipofisários. O objetivo desse estudo foi avaliar a expressão gênica das SIRT1-7 nos somatotropinomas e adenomas hipofisários clinicamente não funcionantes (ACNF) e sua relação com o tamanho e a invasividade do tumor. A expressão das sirtuínas foi ainda correlacionada à expressão dos marcadores de senescência CDKN1A (p21) e CDKN2A (p16) e do proto-oncogene PTTG (pituitary tumor transforming gene). Foram selecionados 68 pacientes, 37 somatotropinomas e 31 portadores de ACNF. Desses casos, 33 apresentavam tumores invasivos e 35 eram não invasivos. A quantificação do RNAm das SIRT1-7, CDKN1A, CDKN2A e PTTG foi realizada nas amostras tumorais pela técnica de PCR em tempo real utilizando o método de quantificação relativa 2-??Ct. A hiperexpressão da SIRT1 foi observada em 86,5% dos somatotropinomas versus 41,9% dos ACNF (P < 0.01), não sendo observada perda de expressão desse gene. A SIRT3 foi mais hipoexpressa nos ACNF em relação aos somatotropinomas (77,4% e 40,5%, respectivamente; P < 0.01). A SIRT4 foi hipo e hiperexpressa, respectivamente, em 45,2% e 12,9% dos ACNF e 16,2% e 24,3% dos somatotropinomas (P=0.03). A hipoexpressão da SIRT7 também foi maior nos ACNF (67,7%) versus somatotropinomas (32,4%; P=0.01) e, para ambos os subtipos, o percentual de casos apresentando hiperexpressão desse RNAm foi baixo. O padrão de expressão das SIRT2 e 5 não diferiu entre os subtipos tumorais e não se mostrou alterado em relação ao pool de hipófises normais. Não foi observada diferença estatisticamente significante na expressão dos genes das sirtuínas entre os grupos de tumores invasivos e não invasivos. Contudo, a expressão das SIRT1 e 3 foi relacionada ao tamanho tumoral; nos casos com hiperexpressão da SIRT1 a média do maior diâmetro tumoral foi 2.4 ± 1.1 enquanto nos pacientes com expressão normal foi de 3.3 ± 1.3 (P < 0.01). Já os casos com perda de expressão da SIRT3 apresentaram tumores maiores (3.1 ± 1.2) em relação aos casos com expressão normal (2.2 ± 1.1; P < 0.01). A expressão de todas as SIRTs apresentou correlação positiva moderada (SIRT1-5,7) ou forte (SIRT6) com a expressão do CDKN1A. Uma correlação positiva foi observada também em relação a expressão do CDKN2A. Contudo, essa foi fraca e presente apenas para as SIRTs 3-5. Em relação ao PTTG, foi observado apenas uma fraca correlação com a expressão da SIRT1 e SIRT3. Em conclusão, esses resultados sugerem que a hiperexpressão de SIRT1 e a hipoexpressão das SIRTs 3, 4 e 7 podem estar relacionadas ao processo tumorigênico nos somatotropinomas e ACNFs, respectivamente e, em especial as SIRT1 e 3, ao controle da proliferação celular nesses adenomas / Sirtuins 1-7 (SIRT) are a highly conserved family of histone deacetylases. In general, these proteins are involved in the regulation of longevity in several organisms, modulating the cellular response to oxidative stress. SIRTs can also regulate DNA repair, telomeric stability, cell senescence and apoptosis. Due to their functions, there is a growing interest in the role of sirtuins in tumorigenesis. However, these genes were not investigated in pituitary tumors so far. In this study, SIRT1-7 gene expression was evaluated in somatotropinomas and nonfunctioning pituitary adenomas (NFPA) and related to tumor size and invasiveness. SIRT1-7 expression was also correlated with cellular senescence markers CDKN1A (p21) e CDKN2A (p16) and with the proto-oncogene PTTG (pituitary tumor transforming gene). Sixty-eight patients were selected, 37 with somatotropinomas and 31 with NFPA. Tumor invasion was observed in 33 patients. SIRT1-7, CDKN1A, CDKN2A and PTTG mRNA levels was evaluated from pituitary tumor samples by the real-time PCR using 2-??Ct relative quantification. Pronounced differences in SIRT1, 3, 4 and 7 expressions were identified between somatotropinomas and NFPA. Overexpression of SIRT1 was observed in 86.5% of somatotropinomas versus 41.9% of NFPA (P < 0.01) whereas underexpression was not detected. SIRT3 was more underexpressed in NFPA than somatotropinomas (77.4% and 40.5%, respectively, P < 0.01). SIRT4 was under and overexpressed, respectively, in 45.2% and 12.9% of NFPA and 16.2% and 24.3% of somatotropinomas (P=0.03). SIRT7 underexpression was also higher in NFPAs (67.7%) versus somatotropinomas (32.4%; P=0.01) with few cases showing overexpression. SIRT2 and 5 expressions did not differ between tumors subtypes and was not altered in relation to the normal pituitary gland pool. No statistically significant difference was observed in the expression of these genes between invasive and non-invasive tumor groups. However, SIRT1 and 3 expressions were related to tumor size. Mean of the largest tumor diameter was 2.4 ± 1.1 and 3.3 ± 1.3 (P < 0.01) in adenomas with SIRT1 over- and normal expression, respectively. On the other hand, cases with SIRT3 underepression exhibited larger tumors (3.1 ± 1.2) compared to cases with SIRT3 normal expression (2.2 ± 1.1, P < 0.01). Moderated (SIRT1-5.7) or strong (SIRT6) positive correlation was observed between sirtuins and CDKN1A expression. A weak correlation was observed with respect to CDKN2A expression and SIRTs 3-5. Regarding PTTG mRNA, only a weak correlation with SIRT1 and SIRT3 expression was observed. In conclusion, these results suggest that overexpression of SIRT1 and underexpression of SIRTs 3, 4 and 7 could be related to the tumorigenic process in somatotropinomas and NFPAs, respectively. SIRT1 and 3 could also play a role in control of pituitary adenomas cell proliferation