Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The respiratory viruses of dogs are associated with a disease called canine infectious respiratory disease (CIRD). The main etiological agents of CIRD are canine distemper virus (CDV), canine parainfluenza virus (cPIV), canine adenovirus type 2 and canid herpesvirus type 1 (CaHV-1), which may cause single or mixed infections. CIRD occurs most frequently in places with high animal density and constant movement. CDV, cPIV, CAdV-2 and CaHV-1 infections have been described worldwide, however, few reports of molecular identification of these viruses are available in Brazil. Thus, the objective of this study was to investigate the occurrence of respiratory viruses in dogs in Santa Maria, RS, and in dog shelters in RS, trying to correlate their occurrence with the environmental conditions. Nasal secretions were collected from dogs with respiratory signs submitted to veterinary clinics in Santa Maria; and from dogs of three shelters of RS (Cachoeira do Sul [shelters #1 and #2] and Passo Fundo [shelter #3]). Viral detection/identification was performed by polymerase chain reaction (PCR) for CDV, cPIV, CAdV-2 and CaHV-1. Positive samples were sequenced and, for some viruses, phylogenetic analysis was performed, comparing with sequences deposited in GenBank. Samples of shelters #1 and #3 were obtained during the cold season. Shelter #1 presented poor sanitary and nutrition conditions, high animal density and constant direct contact among dogs. In this shelter 78% (58/74) of the respiratory samples were positive for at least one virus. The single infections were caused by cPIV in 30% (22/74) of the samples and CAdV-2 in 5% (4/74). Coinfections represented 23% (cPIV and CAdV-2); 13% cPIV, CDV and CAdV-2; 4% cPIV-2 and CDV; and 3% CDV and CAdV-2. Shelters #2 and #3 presented satisfactory sanitary and nutrition conditions, with large outdoors exercise areas (#2) and animal separation by groups (#3). In shelter #2, 8% (5/35) of the samples were positive to cPIV and 6% to CaHV-1; in shelter #3, 8% (7/77) of the samples were positive to CAdV-2 and 1% to CDV. Of samples obtained in Santa Maria, 40% (10/25) were positive for virus, being 28% (7/25) for cPIV, and 4% (1/25) to each of the other viruses. Thus, the results obtained demonstrate that infections and coinfections by respiratory viruses are common in shelter dogs in RS, and their occurrence is related to population density, health and nutritional conditions and season. These viruses are also circulating in domestic dogs in Santa Maria, associated with respiratory disease. This study reinforces the importance of preventive measures such as vaccination and good environmental conditions to prevent/reduce infections caused by respiratory viruses in dogs. / Os vírus respiratórios de cães estão associados com uma enfermidade denominada doença respiratória infecciosa canina (canine infectious respiratory disease - CIRD). Os principais agentes da CIRD são o vírus da cinomose (canine distemper virus - CDV), vírus da parainfluenza canina tipo 2 (canine parainfluenza virus - cPIV), adenovírus canino tipo 2 (canine adenovirus type 2 - CAdV-2) e herpesvírus canino tipo 1 (canid herpesvirus 1 - CaHV-1), que podem causar infecções simples ou mistas. A CIRD ocorre com maior frequência em locais com alta densidade populacional e constante fluxo de animais. Infecções pelo CDV, cPIV, CAdV-2 e CaHV-1 tem sido descritas em vários países, contudo, são escassos os relatos da identificação molecular desses agentes no Brasil. Além disso, há falta de estudos relacionados aos fatores que favorecem a ocorrência e disseminação desses agentes em cães de abrigos. Desta forma, o objetivo do presente estudo foi investigar a ocorrência de vírus respiratórios em cães do município de Santa Maria, Rio Grande do Sul, e em cães de abrigos, buscando-se associar a ocorrência das infecções com as condições ambientais. Para isso, foram coletadas secreções nasais de cães com sinais respiratórios em clínicas veterinárias de Santa Maria; e de cães de três abrigos do estado do RS (dois em Cachoeira do Sul [#1 e #2] e um em Passo Fundo [#3]). A identificação viral foi realizada por reação em cadeia de polimerase (PCR) para o CDV, cPIV, CAdV-2 e CaHV-1. As amostras positivas foram sequenciadas e, para alguns vírus, foi realizada a análise filogenética, comparando-se com sequências depositadas no GenBank. As amostras dos abrigos #1 e #3 foram obtidas durante épocas de baixas temperaturas. O abrigo #1 apresentava condições sanitárias e nutricionais precárias, além de alta densidade populacional e constante contato entre os cães. Neste abrigo, 78% (58/74) das amostras foram positivas para, pelo menos, um dos vírus investigados. As infecções simples foram causadas pelo cPIV em 30% (22/74) das amostras e CAdV-2 em 5% (4/74). As coinfecções totalizaram 23% (17/74) para o cPIV e CAdV-2; 13% (10/74) para o cPIV, CDV e CAdV-2; 4% (3/74) para o cPIV e CDV; e 3% (2/74) para o CDV e CAdV-2. Os abrigos #2 e #3 eram higienizados corretamente e os cães recebiam alimentação adequada, sendo que no abrigo #2 os animais possuíam amplo espaço para se exercitarem, e no abrigo #3 os animais eram separados em grupos e alojados em gaiolas. No abrigo #2 foram detectadas 8% de amostras positivas para o cPIV e 6% para o CaHV-1; e no abrigo #3, 8% de amostras positivas para o CAdV-2 e 1% para o CDV. Das amostras obtidas em clínicas de Santa Maria, 40% (10/25) foram positivas para um dos vírus pesquisados, sendo 28% (7/25) para o cPIV, e 4% (1/25) para cada um dos outros vírus. Assim, os resultados obtidos demonstram que infecções e coinfecções por vírus respiratórios são comuns em cães de abrigos no estado do RS, estando relacionadas com a densidade populacional, condições sanitárias e nutricionais e estação do ano. Estes vírus também circulam em cães domésticos em Santa Maria, estando associados com doença respiratória. Este estudo reforça a importância de medidas de prevenção, tendo em vista que a vacinação e boas condições ambientais podem reduzir e/ou prevenir as infecções causadas por vírus respiratórios em cães.

As muitas formas diferentes de câncer representam uma grande dimensão no âmbito da saúde pública mundial. Embora os esforços da medicina diagnóstica, vários tumores permanecem sem resposta à terapia tradicional. Uma alternativa é o uso de terapia gênica, a qual consiste a transferência de um gene terapêutico para a célula tumoral com a expectativa de inibição da progressão tumoral. Nosso laboratório desenvolveu uma série de vetores adenovirais onde a expressão do transgene é controlada pela p53 e usamos esses vetores para mostrar que a presença de p19Arf (um parceiro funcional de p53) sensibiliza células de melanoma murino, B16-F10 (p53-tipo selvagem), associado à ação do interferão-beta (IFNbeta, uma citocina pleiotrópica) quando testado in vitro. Mesmo que os vetores adenovirais representem o sistema de transferência gênica mais utilizado para a terapia de genes de câncer, seu uso por via sistêmica é limitado principalmente por inativação pelo sistema imune. Diferentes técnicas visam proteger as partículas de vírus do sistema imunológico e direcioná-las para o leito tumoral. Uma dessas técnicas envolve a utilização de células estaminais mesenquimais (MSCs). As propriedades dos MSC incluem a auto renovação, o potencial de diferenciação, bem como a sua capacidade de migrar e infiltrar tumores. Para este fim, nosso objetivo era utilizar MSCs murinos como portadores de adenovírus que expressam IFNbeta e para verificar se a presença de p19Arf nas células tumorais aumentaria a sua sensibilidade para IFNbeta. Para itso, os CTMs foram isolados da medula óssea ou do tecido adiposo de ratinhos C57BL/ 6 machos. Foi verificada a presença de marcadores de CTM (Sca1, CD29) e a ausência de marcadores para linhagens hematopoiéticas (CD31, CD11b, CD45). Sendo as CTM do tecido adiposo foram mais fáceis de cultivar, estes foram utilizados nos seguintes ensaios. In vitro, a aplicação do vector adenoviral que codifica um gene repórter (eGFP) resultou em mais de 70% de eficiênciamde transdução de CTM, sem indução de alterações morfológicas até 72 horas após o tratamento. A aplicação de vector portador de IFNbeta também foi bem tolerada, no entanto transdução com p19Arf sozinho ou em combinação com IFNbeta induziu alterações morfológicas nas CTMs. Em seguida, as células B16-F10 foram transduzidas ou não com o vetor codificando p19Arf e co-cultivadas com MSCs que foram transduzidas ou não com IFNbeta, demonstrando que a presença de p19Arf confere sensibilidade aumentada de células B16-F10 ao tratamento com IFNbeta . Em ensaios preliminares, os tumores B16-F10 foram estabelecidos subcutaneamente em camundongos C57BL / 6 e, posteriormente, as MSC marcadas com eGFP foram aplicadas na circulação após a injeção da veia da cauda. Após 48 horas, estes tumores foram recuperados e a presença de células positivas para eGFP foi confirmada, indicando que os MSCs se infiltraram no microambiente do tumor / The many different forms of cancer represent a tremendous investment for public health all over the world. Although the efforts of both diagnostic and therapeutic medicine have reduced the number of deaths due to cancer, many tumor types remain impervious to traditional therapy. An alternative is the use of gene therapy which entails the transfer of a therapeutic gene to the tumor cells with the expectation of inhibiting tumor progression. Our laboratory has developed a series of adenoviral vectors where transgene expression is controlled by p53 and we have used these vectors to show that the presence of p19Arf (a functional partner of p53) sensitizes murine melanoma cells, B16-F10 (p53-wild type), to the action of interferon-beta (IFNbeta, a pleiotropic cytokine) when tested in vitro. Even though adenoviral vectors are the most utilized gene transfer system for cancer gene therapy, their systemic application is limited principally by immune inactivation. Different techniques aim to protect the virus particles from the immune system and to direct them to the tumor bed. One of these techniques involves the utilization of mesenchymal stem cells (MSCs). The properties of MSCs include self-renewal, the potential for differentiation as well as their ability to migrate to and infiltrate tumors. To this end, our objective was to utilize murine MSCs as carriers of adenovirus that express IFNbeta and to verify if the presence of p19Arf in the tumor cells would enhance their sensitivity to IFNbeta. For this, MSCs were isolated from bone marrow or adipose tissue from male C57BL/6 mice. The presence of MSC markers (Sca1, CD29) was verified as was the absence of markers for hematopoietic lineages (CD31, CD11b, CD45). Since the MSCs from adipose tissue were easier to cultivate, these were utilized in the following assays. In vitro, application of the adenoviral vector encoding a reporter gene (eGFP) at a multiplicity of infection of 1000 resulted in the transduction of more than 70% of the MSCs and without the induction of morphological alterations even by 72 hours post treatment. The application of a vector encoding IFN? was also well tolerated, however transduction with p19Arf alone or in combination with IFNbeta induced morphologic alterations in the MSCs. Next, B16-F10 cells were transduced or not with the vector encoding p19Arf and co-cultivated with MSCs that had been transduced or not with IFNbeta, demonstrating that the presence of p19Arf confers enhanced sensitivity of B16-F10 cells to the treatment with IFN?. In preliminary assays, B16-F10 tumors were established subcutaneously in C57BL/6 mice and later MSCs labeled with eGFP were applied in the circulation upon tail vein injection. After 48 hours, these tumors were recovered and the presence of eGFP-positive cells was confirmed, indicating that the MSCs infiltrated the tumor microenvironment

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2017-03-13T17:29:42Z No. of bitstreams: 1 andressasilvinoferreiraassis.pdf: 3364177 bytes, checksum: ff9c20080e11e36f28daf805d56ecc7e (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-03-13T19:33:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 andressasilvinoferreiraassis.pdf: 3364177 bytes, checksum: ff9c20080e11e36f28daf805d56ecc7e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-13T19:33:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 andressasilvinoferreiraassis.pdf: 3364177 bytes, checksum: ff9c20080e11e36f28daf805d56ecc7e (MD5) Previous issue date: 2016-12-19 / O tratamento de esgoto pode ser insuficiente para a completa eliminação de vírus entéricos, tais como adenovírus humanos (HAdV) e rotavírus do grupo A (RVA). Portanto, o retorno do lodo e do efluente tratado ao ambiente pode representar riscos à saúde pública. Este estudo foi conduzido para otimizar um protocolo de floculação orgânica para recuperação viral a partir de lodo de esgoto e efluente tratado, bem como realizar um monitoramento de HAdV e RVA na estação de tratamento de esgoto (ETE) de Juiz de Fora, MG. Nos estudos de otimização, foram propostas adaptações no protocolo de floculação com leite desnatado para lodo e efluente tratado, com modificações no tempo de agitação da amostra, na concentração final de leite desnatado e/ou na etapa de centrifugação. No estudo de monitoramento, esgoto bruto (P1), esgoto primário (P2), lodo (P3) e efluente tratado (P4) foram coletados bimensalmente em 2014 (durante as épocas seca e chuvosa), totalizando 96 amostras (simples e compostas). As cargas virais foram determinadas por PCR quantitativo e o bacteriófago PP7 foi usado como controle interno. Amostras de HAdV e RVA foram submetidas ao sequenciamento e a viabilidade das partículas de HAdV foi avaliada em amostras de P4. Os parâmetros físico-químicos e a contagem de coliformes termotolerantes (CT) foram determinados em cada ponto. Nos estudos de otimização, foram selecionadas duas condições que apresentaram as maiores taxas de recuperação viral no lodo (menor tempo de agitação e maior concentração de leite desnatado) e no efluente tratado (sem primeira etapa de centrifugação e com maior concentração de leite desnatado). Ambas provaram ser ferramentas úteis para pesquisa viral em amostras de campo, inclusive para a pesquisa de vírus gigantes. No monitoramento, o HAdV foi detectado em 85,4% (82/96) dos concentrados, com cargas virais variando de 3,27 x 102 a 2,42 x 106 cópias do genoma por mililitro (cg/mL), ao longo do ano. A presença de RVA foi observada em 52,1% (50/96) dos concentrados (1,38 x 103 a 3,65 x 105 cg/mL), com maior detecção na época seca. A carga viral não foi influenciada pelo tipo de amostra, sendo detectada tanto em amostras simples, quanto em amostras compostas. Todas as amostras de HAdV sequenciadas pertenciam à espécie F tipo 41 e as amostras de RVA pertenciam ao genótipo I1. O tratamento de esgoto reduziu a quantidade de matéria orgânica e sólidos, bem como a contagem de CT e as cargas virais. No entanto, a presença de HAdV e RVA foi observada mesmo após o tratamento, inclusive em amostras de efluente tratado consideradas adequadas pelas legislações atuais, com detecção de partículas infecciosas de HAdV. Foram observadas correlações positivas entre a carga viral e a demanda bioquímica de oxigênio, os sólidos sedimentáveis e sólidos suspensos totais. Os dois protocolos otimizados neste estudo podem ser facilmente adequados para uso em laboratório de rotina, podendo impulsionar o monitoramento viral nos subprodutos gerados na ETE. A carga viral detectada na ETE salienta a disseminação ambiental de RVA e HAdV e aponta o potencial do HAdV como um marcador viral de contaminação em ambientes aquáticos. / Sewage treatment may be insufficient for the complete elimination of enteric viruses such as human adenoviruses (HAdV) and group A rotaviruses (RVA). Thus, the return of sewage sludge and treated effluent to the environment poses concerns potential for public health. This study was conducted to optimize an organic flocculation procedure for viral recovery from sludge and treated effluent, and carry out a surveillance of HAdV and RVA in a wastewater treatment plant (WWTP) at Juiz de Fora, MG. In optimization studies, conditions were proposed for sludge and treated effluent with changes in the stirring time, in the final concentration of skimmed-milk and/or in the centrifugation step. In surveillance study, raw sewage (P1), primary sewage (P2), sludge (P3) and treated effluent (P4) were collected bimonthly in 2014 (during the dry and the rainy season), totaling 96 samples (simple and composite). Quantitative PCR determined viral loads and PP7 bacteriophage was used as internal control. HAdV and RVA strains were selected for sequencing, and the HAdV viability was evaluated in P4 samples. Physicochemical parameters and thermotolerant coliforms (TC) counting were determined at each point. After the optimization studies, two conditions were selected: the ones that showed the highest viral recovery rates in sludge (lower stirring time and higher concentration of skimmed-milk) and treated effluent (without the first centrifugation step and with a higher concentration of skimmed-milk). These conditions proved to be a useful tool for viral search in the field samples, including for the research of giant virus. In surveillance study, HAdV was detected in 85.4% (82/96) of the concentrated, with viral loads ranging from 3.27 x 102 to 2.42 x 106 genome copies per milliliter (gc/mL), throughout the year. RVA presence was observed in 52.1% (50/96) of the samples (1.38 x 103 to 3.65 x 105 gc/mL) with detection greater in the dry season. Viral load was not influenced by the type of sample being detected both in single samples, as in composite samples. All the sequenced HAdV strains belonged to species F type 41, and RVA strains belonged to genotype I1. Sewage treatment reduced the content of organic matter and solids, as well as the TC counts and the viral loads. However, the presence of HAdV and RVA was observed after treatment, even in samples considered adequate by current laws with detection of infectious HAdV particles. Positive correlations were observed between viral load and biochemical oxygen demand, sedimented solids and total suspended solids. Two optimized protocols in this study are easily suitable for routine laboratory use and can boost viral monitoring in by-products generated in the WWTP. Viral load detected in WWTP stress the environmental dissemination of HAdV and RVA and addressed the potential of HAdV as a virological marker of contamination in aquatic environments.