This study (1) quantitatively compared steroid production in cultured Y-l mouse adrenal tumor cells exposed to Camel and Carlton-smoke derived residues, and (2) localized the effects in the cell. Basal steroid production was increased by Camel residues but not by Carlton, while ACTH stimulation was interfered with by both residues. Camel basal stimulation was comparable to that of cAMP, and was abolished by Cytochalasin D. The stimulation was also comparable to that of cholera toxin, which activates adenyl cyclase. Results indicate that residue components dissolve in the membrane stimulating adenyl cyclase at a point similar to or before that utilized by cholera toxin for its stimulating effect.

L’embryologie de la surrénale humaine et la pathogénie de l’hypoplasie congénitale des surrénales sont mal connues et complexes. L’une pouvant expliquer l’autre, nous présentons, à partir de 119 fœtus humains normaux de12 à 36 semaines de développement (SD), une étude cinétique histologique et moléculaire de la surrénale fœtale et nous décrivons 3 cas d’hypoplasie surrénalienne. Après un rappel des mécanismes moléculaires connus, régulant ensemble l’embryologie surrénalienne, gonadique et hypophysaire et ceux de l’hypoplasie surrénale congénitale, nous présentons nos résultats. Dans la corticosurrénale humaine fœtale normale, les cellules du cortex permanent prolifèrent et, dès la 12ème SD, expriment la NCAM, la 3β-HSD et la P450 c21. Elles ont la capacité de synthétiser des minéralocorticoïdes et/ou du cortisol. Les cellules du cortex fœtal ne prolifèrent pas et expriment ni la 3β-HSD, ni la NCAM. La médullosurrénale est formée par des neuroblastes immatures (CgA-, NCAM+) qui migrent et prolifèrent de la périphérie vers le centre de la glande, où ils se différencient en neuroblastes matures (CgA+). Dans les deux cas d’hypoplasie surrénale de type anencéphalique, avec absence de mutation de DAX-1 et de SF-1, la dysembryoplasie surrénalienne est probablement d’origine hypophysaire, par absence de cellules gonadotropes. Dans le 3ème cas, jamais décrit, associant un RCIU, une hypoplasie surrénalienne congénitale, une ambiguïté sexuelle, une absence de différenciation des cellules antéhypophysaires, l’absence de mutation de gènes connus (DAX-1, SF-1, SRY, FGF9, SOX2, SOX3, SOX5 et SOX9) suggère l’existence de nouveaux gènes régulant la différenciation précoce de ces trois glandes endocrines. / The embryology of the human adrenal and the pathogenesis of the hypoplasia adrenal congenital are complex and not well known. We studied the histological and functional characteristics of the fetal human adrenal in normal fetuses aged 12 to 36 weeks development (WD) and presented three cases of congenital adrenal hypoplasia with pituitary abnormalities. In the human fetal adrenal cortex, only the cells of the definitive zone proliferate from the 12th WD. We observe the expression of an adherence protein (NCAM) and of two steroidogenesis enzymes (3β-HSD and P450 c21) in the definitive zone cells, attesting to the capacity of these cells to synthesize mineralocorticoids and/or cortisol. In the fetal zone, only P450 c21 immunoreactivity is detected. The adrenal medulla is formed by immature neuroblasts (CgA -, NCAM+) which migrate and proliferate from the periphery toward the center of the gland, where they differentiate in mature neuroblasts (CgA+). In the two cases of congenital adrenal hypoplasia of anencephalic type without DAX 1 and SF-1 mutation, the cause is probably from pituitary origin and related to absence of gonadotrope cells. In the third case of congenital adrenal hypoplasia, never described, combining a retard intrauterine development, a congenital adrenal hypoplasia, sexual ambiguity, pituitary abnormalities. The absence of mutation of known genes (DAX -1, SF -1, SRY, FGF9, SOX2, SOX3, SOX5 and SOX9) suggests the existence of new genes regulating early differentiation of the adrenal, the gonad and the pituitary.

A hiperplasia adrenocortical macronodular primária (PMAH) é uma causa rara de Síndrome de Cushing (SC). Apresenta como características macronódulos funcionantes em ambas as glândulas suprarrenais e uma produção variável de cortisol. Os nódulos apresentam uma produção ectópica de hormônio adrenocorticotrófico (ACTH) tornando a doença independente do ACTH hipofisário. Estudos independentes mostraram que mutações germinativas no gene armadillo repeat cointaining 5 (ARMC5) são uma causa frequente de PMAH. Além dessa mutação parece haver a participação de receptores hormonais ectópicos no córtex suprarrenal, que estimulariam a esteroidogênese e a hiperplasia da glândula. No entanto, os estudos sobre a relação entre o ARMC5 e a participação dos receptores aberrantes na produção de cortisol são incipientes. Portanto, temos como hipótese que as alterações no gene ARMC5 podem estar envolvidas no padrão celular e funcional das células que compõem os nódulos hiperplásicos na PMAH. Desta forma, nossos objetivos foram analisar: 1) a proporção de células espongiformes e compactas em cortes corados com hematoxilina e eosina; 2) a expressão gênica, nas células espongiformes e proteica de ambas as células, do ARMC5, das enzimas esteroidogênicas StAR, 3βHSD2 e CYP17A1, dos receptores da vasopressina (AVP1AR), serotonina (5HT4R) e do peptídeo inibidor gástrico (GIPR) e do ACTH ectópico e 3) a expressão do antígeno de proliferação celular, a proteína PCNA, para análise do padrão de proliferação em cortes histológicos de nódulos de hiperplasias de pacientes que apresentam mutações germinativas, mutações germinativas e somáticas ou não mutação no gene ARMC5. Os resultados mostraram que os nódulos hiperplásicos são compostos, na sua maioria, por células espongiformes, cujo padrão foi independente da presença de mutação. A expressão do ARMC5 nas células espongiformes foi maior em pacientes com mutação, e os receptores ectópicos apresentaram uma expressão maior no tecido de PMAH em relação à adrenal normal. A reação de imunoistoquimica revelou células positivas para a proteína ARMC5 e StAR, em ambos os tipos celulares, enquanto a enzima 3βHSD2 foi predominante nas células espongiformes e a enzima CYP17A1 nas células compactas. A expressão de AVP1AR, 5HT4R, e do ACTH ectópico foi positiva em ambos os tipos celulares e independente da presença ou não da mutação no gene ARMC5, bem como a expressão da proteína PCNA. Portanto, nossos resultados sugerem que a presença ou não de mutações no gene ARMC5 nas hiperplasias não está envolvida no padrão celular das células que compõem os nódulos. O mesmo para a presença dos receptores AVP1AR, 5HT4R e GIPR, do ACTH ectópico e da proteína PCNA. Como conclusão, os resultados dos parâmetros analisados sugerem que as alterações no gene ARMC5 não estão envolvidas no padrão celular e funcional das células que compõem os nódulos hiperplásicos na PMAH, e podem ter o mesmo grau de importância na formação desses nódulos. / The primary macronodular adrenal hyperplasia (PMAH) is a rare cause of Cushing\'s Syndrome (SC). It is characterized as macronodules in the adrenal gland and by variable production of cortisol. The nodules present an ectopic production of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) pituitary-independent. Several studies showed that the germ mutations in armadillo repeat cointaining 5 (ARMC5) are a frequent cause of PMAH. In addition, there is a participation of ectopic hormonal receptors in the adrenal cortex, which promotes steroidogenesis and hyperplasia of the gland. However, studies on a relationship between ARMC5 and aberrant receptor involvement in cortisol production are incipient. Therefore, our hypothesis is that ARMC5 gene may be involved in the cellular and functional pattern of the cells in PMAH. Thus, the objectives were to analyzed: 1) the proportion of spongiform and compact cells in sections stained with hematoxylin and eosin; 2) the gene expression in the spongiform cells and the gene and protein expression in both cells types of the ARMC5, the steroidogenic enzymes StAR ,3βHSD2 e CYP17A1, and the ectopic receptors of vasopressin (AVP1AR), serotonin (5HT4R) and gastric inhibitory peptide (GIPR) also the ACTH ectopic and 3) the proliferating cell nuclear antigen (PCNA) that shows the proliferation pattern in patients PMAH that present germline, germinative and somatic mutations or no mutation in ARMC5 gene. We showed that the hyperplastic nodules are mainly composed by spongiform cells independent of the ARMC5 mutation. The expression of ARMC5 in spongiform cells was higher in patients with mutation, and PMAH tissue have a higher expression of the ectopic receptors when compared with normal adrenal. With the immunohistochemical labeling, we observed the ARMC5 and StAR protein expression in both cell types. The 3βHSD2 enzyme was predominant in spongiform cells and the CYP17A1 enzyme in the compact cells. The expression of AVP1AR, 5HT4R, and ectopic ACTH was positive in both cell types regardless of the presence of the ARMC5 mutation, as well as the expression of the PCNA protein. Therefore, the results suggest that the mutation in ARMC5 is not involved with spongiform and compact cell function. Moreover, the presence of the AVP1AR, 5HT4R and GIPR receptors, the ectopic ACTH and the PCNA protein was not related to the gene mutation. In conclusion, the alterations in the ARMC5 gene are not involved in the cell functional pattern in the PMAH and in the onset of the nodules.

Massas adrenais clinicamente silenciosas, diagnosticadas ao acaso ("incidentalomas"), são frequentemente encontradas em avaliações radiológicas devido ao constante progresso dos métodos de imagem. Na revisão das principais fontes científicas até 2004, analisado o grau de evidência concluiu-se: a maioria dos "incidentalomas" são não hipersecretores, mas a avaliação endócrina demonstrou que é comum o achado de hiperfunção hormonal discreto; "incidentaloma" acima de 6cm sugerem malignidade e entre 4-6cm devem ser analisadas por suas características de imagem; adrenalectomia deve ser indicada em massas adrenais funcionantes; massas adrenais não operadas devem ser acompanhadas pelo prazo de 2 anos / Introduction: Clinically silent adrenal masses, incidentally diagnosed during imaging methods performed for other clinical conditions (“incidentalomas") have been more frequently detected due to the constant improvement in imaging methods. There are several causes, diagnoses and treatments for these masses. Thus, whenever a physician comes across such lesion, it is necessary to define whether this mass is hormonally active and whether there is a risk of being malignant. Nevertheless, the methods for clarifying these issues have yet to be defined. Objective: To evaluate the best diagnosis, treatment and follow up of the incidental adrenal lesion. Methods: The main scientific literature available until October 2004 was reviewed, taking evidence into account. Results: Two studies which selected and reviewed articles until September 2003 were found. Fourty-three other studies included in a systematic review until October 2004 were added to this study. Conclusions: In general, “incidentalomas" are non-functioning, but endocrinological evaluation has shown that subclinical hormonal hyperfunction is not unusual, thus stressing the need for measuring substances such as with metanephrine assay, dexamethasone suppression test in low dosage and establishing the upright plasma aldosterone/plasma renin activity ratio. Non-functioning “incidentalomas" smaller than 4 cm should be followed carefully; those between 4 and 6 cm should be analyzed for its imaging characteristics; for those greater than 6 cm adrenalectomy is indicated. Functioning “incidentalomas" must undergo adrenalectomy. Nonoperated adrenal masses must be followed for two years through imaging and function testing.

Introdução: A vulnerabilidade dos profissionais de enfermagem ao estresse está associada à exposição crônica aos estressores cotidianos de trabalho e, consequentemente, aos efeitos cumulativos dos mediadores primários e secundários do estresse. Embora vários estudos tenham relatado o elevado nível de estresse dos profissionais de enfermagem, pouco se sabe a respeito das implicações biológicas do estresse no trabalho, expressas na carga alostática e no ritmo de secreção dos hormônios de cortisol um dos principais hormônios do estresse. Isto particularmente é importante visto que a carga alostática aumenta o risco do indivíduo desenvolver transtornos relacionados ao estresse como síndromes cardiovasculares, metabólicas, endócrinas, emocionais e cognitivas. Neste sentido, questiona-se se os profissionais de enfermagem apresentam sobrecarga do sistema adaptativo de reação do estresse (carga alostática), bem como alterações no ritmo de secreção de cortisol (hiper ou hipocortisolemia) ao longo do dia e o risco para o desenvolvimento de doenças relacionadas ao estresse. Objetivo: Descrever a frequência de profissionais de enfermagem com carga alostática elevada e ritmo atípico de secreção de cortisol. Analisar se a carga alostática elevada está associada ao ritmo atípico de secreção de cortisol. Método: Foram incluídos 142 profissionais de enfermagem do turno diurno randomicamente selecionados, alocados nas unidades ambulatório, clínica médica, clínica cirúrgica, centro cirúrgico, pronto socorro infantil e adulto, unidade de terapia intensiva adulto e pediátrica de um hospital universitário. Para avaliação do padrão diurno de secreção de cortisol foram coletadas amostras de saliva em dois dias úteis consecutivos de trabalho e, para a análise dos biomarcadores foram coletadas, em um único dia, amostras de sangue de todos os participantes, bem como, verificada sua pressão arterial e medidas antropométricas. A carga alostática foi analisada por mediadores neuroendócrinos, metabólicos, cardiovasculares e imunológicos. Os dados foram armazenados e analisados utilizando o programa estatístico SPSS versão 14.0 e o nível de significância adotado foi de 5%. Resultados: 31% dos profissionais de enfermagem apresentaram padrão atípico (inconsistente ou flat) de secreção de cortisol e 47,2% carga alostática elevada. Não houve associação entre o ritmo de secreção de cortisol e a carga alostática. Conclusão: Quase metade dos profissionais de enfermagem apresentaram sinais de desgaste do sistema biológico regulador da resposta de estresse, sugerindo que o trabalho possa estar associado a esta sobrecarga e destacando a vulnerabilidade destes trabalhadores ao desenvolvimento de doenças relacionadas ao estresse / Background: The vulnerability of nursing professionals to stress is associated with chronic exposure to everyday stressors and, therefore, with the cumulative effects of primary and secondary stress mediators. Despite the fact that several studies have reported the high stress level of nursing professionals, little is known about the biological implications of stress at work, expressed in the allostatic load and in the rhythm of cortisol secretion, one of the main hormones of stress. This is especially important since the allostatic load increases the risk of an individual to develop stress-related disorders like cardiovascular syndromes, metabolic, endocrine, cognitive and emotional. In this aspect, there are questions whether the nursing professionals present overload on the stress adaptive reaction system (allostatic load), as well as, changes in the rhythm of cortisol secretion (hyper or hypocortisolemia) throughout the day and the risk of developing stress-related diseases. Objective: To describe the frequency of nursing professionals with high allostatic load and atypical rhythm of cortisol secretion. To analyze whether the high allostatic load is associated with atypical rhythm of cortisol secretion. Methods: We included 142 nursing professionals day shift randomly selected, allocated in the outpatient units, medical clinic, surgical clinic, surgery, children and adults emergency room and adult intensive care unit in a pediatric teaching hospital. To evaluate the daytime pattern of cortisol secretion, saliva samples were collected in two work day and, for the analysis of biomarkers, were collected in a single day, blood samples from all participants, as well as, checked his blood pressure and anthropometric measurements. Allostatic load was analized by neuroendocrine, metabolic, cardiovascular and immune mediators. The data was stored and analyzed using the program SPSS version 14.0 and the statistical significance level adopted was 5%. Results: 31% of nursing professionals showed atypical pattern (inconsistent or \"flat\") of secretion of cortisol and 47.2% showed high allostatic load. There was no association between the rate of secretion of cortisol and the allostatic load. Conclusion: Nearly half of nursing professionals showed signs of wear in the biological system stress response regulator, suggesting that the job can be associated with this overload and highlighting the vulnerability of these workers to the development of stress-related diseases.

As massas adrenocorticais são majoritariamente (70-80%) adenomas adrenocorticais (ACA). Os carcinomas adrenocorticais (ACC) são mais raros e de prognóstico restrito, com incidência de 1-2 casos por milhão, com alta taxa de reincidência (70-80%). Apesar dos tumores adrenocorticais (ACT) serem raros, no Brasil a incidência desses tumores em crianças é cerca de 10 vezes superior ao do restante do mundo, devido a uma mutação do gene TP53. Atualmente, o diagnóstico de massas adrenocorticais é realizado através dos critérios de Weiss, que possuem limitações, e por isso é intensa a busca de novos marcadores moleculares que facilite o diagnóstico de ACTs. POD-1/ TCF21 é um fator de transcrição do tipo helix-loop-helix básica (bHLH) expresso nos sítios de interação mesênquima-epitélio durante o desenvolvimento embrionário. Em ACTs, POD-1 regula a expressão endógena de SF-1 através da ligação na sequencia E-box da região promotora de SF-1, e nesses tumores parece estar relacionado negativamente com genes reguladores do ciclo celular, como BUB1B. BUB1B é um gene que codifica uma quinase com funções importantes durante o checkpoint mitótico. A expressão de BUB1B é considerada fator de prognóstico em diferentes tipos de tumores, inclusive em ACTs humanos, nos quais a expressão combinada de BUB1B e PINK1 (ΔCtBUB1B - ΔCtPINK1) mostrou-se um bom marcador de sobrevida em pacientes com ACC. PINK1, quinase 1 induzida por PTEN, é regulada principalmente pela mitocôndria, e em ACTs sua expressão está reduzida em ACC mais agressivos. Temos como hipótese que a expressão de POD-1 pode ter valor diferencial no diagnóstico de massas adrenocorticais, e que a análise da expressão combinada de POD-1, BUB1B e PINK1 pode ter valor diferencial para prognóstico de pacientes com ACT. Nesse trabalho foram analisados, por reação de qPCR com sondas Taqman, o cDNA obtido de 130 amostras de tumores: 79 adultos (44 ACAs e 35 ACCs), 35 crianças com menos de 5 anos de idade (27 ACAs e 8 ACCs) e 16 crianças de 5 a 18 anos de idade (6 ACAs e 10 ACCs). Nossos resultados mostram que POD-1 e BUB1B tem valor diferencial em ACT adulto e que a expressão combinada de POD-1 e BUB1B pode ser um marcador de prognóstico em pacientes com carcinoma adulto. Enquanto que, a expressão combinada de POD-1 e SF-1 pode ter valor de diagnóstico em pacientes pediátricos com menos de 5 anos. Em resumo, concluímos que estudos experimentais devem ser realizados para comprovar a relação entre os genes estudados, para que os resultados sejam sólidos o suficiente para serem utilizados no diagnóstico e prognóstico dos tumores adrenocorticais. / The adrenocortical masses are mostly (70-80%) adrenocortical adenomas (ACA). Adrenocortical carcinomas (ACC) are scarce and have limited prognosis, with an incidence of 1-2 cases per million and high recurrence rate (70-80%). Despite adrenocortical tumors (ACT) are rare in Brazil the incidence of these tumors in children is about 10 times higher than the rest of the world, due to a mutation of the TP53 gene. Currently, the diagnosis of adrenocortical mass is carried through Weiss criteria that have limitations, so it is intensive the search for new molecular markers that facilitate the diagnostic of ACTs. TCF21/POD-1 is a transcription factor helix-loop-helix type expressed in mesenchymal-epithelial sites of interaction during embryonic development. In ACTs, POD-1 regulates the expression of endogenous SF-1 through binding the E-box sequence of SF-1 promoter region, and seems to be negatively relates with cell cycle regulatory genes such as BUB1B. BUB1B is a gene encoding a kinase-with important function during mitotic checkpoint. The expression of BUB1B is considered a prognostic factor in different types of tumors, including ACTs. Combined expression of BUB1B and PINK1 (ΔCtBUB1B - ΔCtPINK1) has been shown to be a good marker of survival in adults with ACC, whereas the PINK1 expression is reduced in the most aggressive ACC. We hypothesized that the POD-1 expression may have differential value in the diagnosis of adrenocortical masses, and that the analysis of the combined expression of POD-1, BUB1B and PINK1 may have differential value for the prognosis of patients with ACT. In this work were analyzed by PCRq Taqman probes the cDNA obtained from 130 tumor samples: 79 adults (44 ACAs and 35 ACCs), 35 children under 5 years old (27 ACAs and 8 ACCs) and 16 children 5-18 years of age (6 ACAs and 10 ACCs). Our results show that POD-1 and BUB1B has differential value in adult ACT, and the combined expression of POD-1 and BUB1B may have a prognostic value in patients with adult carcinoma. In addition, the combined expression of POD-1 and SF-1 might have diagnostic value in pediatric patients younger than 5 years. In summary, we conclude that experimental studies should be conducted to confirm the relationship between the genes studied, so that the results are solid enough to be used in the diagnosis and prognosis of adrenocortical tumors.

A necropsia é essencial para a identificação da causa de morte e dos processos que culminaram no óbito do animal. O presente estudo visou à pesquisa da real ocorrência de morte súbita e inesperada em cães submetidos à necropsia, e à determinação da discrepância entre as suspeitas dos proprietários em relação ao estado de saúde prévio e à causa de morte de seus cães, quando comparadas às conclusões necroscópicas. Este trabalho também focou nas alterações morfológicas e funcionais nas glândulas adrenais de cães necropsiados, a fim de se estudar a aplicação de possíveis marcadores da resposta adrenal ao estresse sofrido pelo animal na iminência do óbito. Foram utilizados os dados de 82 cães necropsiados na FMVZ-USP para análise da ocorrência real de morte súbita nestes animais. As alterações morfológicas nas adrenais de 46 cães necropsiados foram avaliadas através de análises morfométricas e histopatológicas. Também foram avaliados os índices de proliferação e apoptose nas células do córtex adrenal em relação à causa de morte do animal, através da marcação imunoistoquímica para o antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) e para BAX e Bcl-2, proteínas envolvidas na regulação da apoptose. A análise das alterações funcionais sofridas pelas adrenais focou na quantificação das concentrações das catecolaminas adrenalina e noradrenalina na medula adrenal dos cães por cromatografia líquida de alta eficiência com detecção eletroquímica (CLAE-DE). Dentre os resultados encontrados, a suspeita do proprietário de que seu cão sofreu uma morte súbita e inesperada é muito maior do que a real ocorrência deste tipo de morte em cães, sendo o óbito por decorrência de complicações de doenças muito mais frequente. As características morfométricas das adrenais dos cães apresentaram maior influência pelo peso corpóreo do animal e pela presença ou ausência de hiperplasia cortical do que pela associação com doenças crônicas ou condições agudas. Cães que vieram a óbito em decorrência de complicações de doenças crônicas exibiram fibrose em região corticomedular e focos de infiltrado inflamatório, ausentes nos animais com morte súbita ou doenças agudas, além de maior ocorrência de hiperplasia adrenocortical. Cães que sofriam de alterações cardíacas crônicas apresentaram alterações histopatológicas significativas mais marcantes em suas adrenais, como necrose, fibrose e depleção vacuolar cortical. Por outro lado, a congestão severa nas adrenais foi um achado mais frequente nos animais previamente saudáveis que sofreram morte súbita ou que vieram a óbito por doenças agudas. A avaliação dos índices de proliferação celular e apoptose no córtex das adrenais através da marcação imunoistoquímica para PCNA e BAX e Bcl-2, respectivamente, não apresentou potencial relevante para o estudo dos efeitos do estresse por doenças crônicas sobre as adrenais de cães. As concentrações de adrenalina e noradrenalina na medula adrenal se mostraram muito maiores em cães machos quando comparados às fêmeas. Os achados deste estudo podem auxiliar nas conclusões da necropsia, sendo especialmente relevantes em casos médico-legais, nos quais todos os achados possíveis devem ser relatados e analisados a fim de se prover um diagnóstico preciso, seguro e incontroverso / The necropsy is essential to identify the cause of death and the processes that culminated in the death of the animal. The present study aimed to research the actual occurrence of sudden and unexpected death in dogs subjected to necropsy, and to determine the discrepancy between the suspicions of owners regarding the previous state of health or cause of death of their dogs when compared to the gross findings. This work also focused on the morphological and functional changes in the adrenal glands of dogs submitted to necropsy in order to study the application of possible markers of adrenal stress response experienced by the animal on the verge of death. The data of 82 dogs necropsied in FMVZ-USP was used for analysis of the actual occurrence of sudden death in these animals. The morphological changes in the adrenal glands of 46 necropsied dogs were evaluated by morphometric and histopathological analysis. The proliferation rates and apoptosis in cells of the adrenal cortex regarding the cause of death of the animal were also evaluated by immunohistochemical staining for the nuclear antigen of cellular proliferation (PCNA) and BAX and Bcl-2, proteins involved in apoptosis regulation. The analysis of functional changes in the adrenal gland focused on quantifying the concentrations of the catecholamines adrenaline and noradrenaline in the adrenal medulla of dogs by high-performance liquid chromatography with electrochemical detection (HPLC-DE). Regarding the results of this study, the owners’ suspicion that their dog suffered a sudden and unexpected death is much greater than the actual occurrence of this type of death in dogs, while death due to complications from diseases is far more frequent. The morphometric characteristics of the adrenal glands of dogs showed greater influence by the body weight of the animal and the presence or absence of cortical hyperplasia than by association with chronic or acute conditions. Dogs that died due to chronic disease complications exhibited fibrosis in the corticomedullary region and foci of inflammatory infiltrate, absent in animals with sudden death or acute diseases, as well as higher incidence of adrenocortical hyperplasia. Dogs suffering from chronic cardiac conditions showed more marked significant histopathological changes in their adrenal glands, such as necrosis, fibrosis and cortical vacuolar depletion. On the other hand, severe congestion in the adrenal glands was a frequent finding in previously healthy animals who suffered sudden death or that died from acute illnesses. The evaluation of cell proliferation rates and apoptosis in the cortex of the adrenal by immunohistochemical staining for PCNA and BAX and Bcl-2, respectively, did not show significant potential for studying the effects of stress by chronic diseases in the adrenal glands of dogs. The adrenaline and noradrenaline concentrations in the adrenal medulla were much higher in male dogs when compared to females. This study’s findings may help the necropsy conclusions, which are particularly relevant in forensic cases where all possible findings should be reported and analyzed in order to provide an accurate, confident and uncontroversial diagnosis

Introdução: DAX1 (NR0B1), SF1 (NR5A1) e a via Wnt controlam o desenvolvimento de células progenitoras/tronco adrenais. NANOG, OCT4, SOX2 e STAT3 estão envolvidos na manutenção de células-tronco e têm papel em vários cânceres de diferentes tecidos. Ainda não está claro se esses fatores de transcrição interagem para promover a tumorigênese adrenocortical. Objetivo: Nos tumores adrenocorticais (TAC): avaliar o ganho de material genômico e a expressão de RNAm e proteica de DAX1 e SF1; avaliar a expressão de RNAm e proteica de marcadores de células-tronco (NANOG, OCT4, SOX2 e STAT3). No desenvolvimento do córtex adrenal: avaliar a expressão proteica desses genes. In vitro: avaliar a interação entre a via Wnt/Beta-catenina e a expressão de NANOG. Pacientes e Métodos: Painel de 30 córtices adrenais fetais humanos (20-38 semanas de gestação) e 14 pós-natais. Pacientes com TAC: 96 crianças/adolescentes (81% do sexo feminino, idade mediana de 1,6 anos [0,4 a 15,6 anos]) e 18 adultos (10 adenomas e 8 carcinomas, 89% do sexo feminino e idade mediana de 42,5 anos [21-66 anos]). Tecidos adrenais normais (controles para qPCR e MLPA): 13 crianças (idade mediana de 3 anos) e 13 adultos (mediana de idade de 48 anos). A expressão proteica de SF1, DAX1, STAT3, NANOG e OCT4 foi avaliada por imunohistoquímica nos TAC e nos córtices adrenais fetais e pós-natais. A expressão de RNAm de NR0B1, NR5A1, STAT3, NANOG e POU5F1 (OCT4) foi avaliada por qPCR nos TAC. Ganho ou perda de material genômico de NR0B1 e NR5A1 foi avaliada por MLPA nos TAC. In vitro, a expressão de NANOG (qPCR) foi avaliada em células adrenais H295 antes e após inibição da via Wnt/Beta-catenina com a substância PNU-74654. Resultados: Em adrenais fetais com 20 e 25 semanas de gestação detectou-se marcação intensa de SF1, DAX1, SOX2 e OCT4 na região subcapsular e marcação leve a moderada e difusa de STAT3 e NANOG. Após as 31 semanas e no período pós-natal, a marcação intensa de SF1 persistiu, porém a marcação de DAX1, STAT3, NANOG e OCT4 diminuiu ou desapareceu. Nos TAC, a marcação nuclear de SF1 foi positiva em 67% das amostras pediátricas e em 19% das amostras de adultos. Ganho de material genômico do NR5A1 foi observado em 71% dos TAC pediátricos e 33% de TAC adultos. Porém observou-se hipoexpressão do RNAm do NR5A1 em 84% dos TAC pediátricos. Nenhum ganho de material genômico ou aumento da expressão do RNAm do NR0B1 foi observado nos TAC pediátricos. Porém em 45% desses tumores detectou-se marcação nuclear. Nos TAC de pacientes adultos, houve aumento da expressão de RNAm de NR0B1 em 89% das amostras. Não se observou marcação de STAT3 nos TAC pediátricos e adultos. Porém nos pacientes adultos, a expressão do RNAm de STAT3 foi significativamente maior nos adenomas do que nos carcinomas. Por sua vez, a marcação nuclear do OCT4 associou-se significativamente com a ocorrência de metástases nos pacientes pediátricos. Nos TAC com a mutação p.S45P no gene da Beta-catenina detectou-se expressão significativamente aumentada do RNAm do NANOG. Além disso, após a inibição in vitro da via Wnt/Beta-catenina nas células tumorais adrenais houve redução significativa na expressão do RNAm de NANOG. Conclusão: Existe um padrão temporal na expressão de SF1, DAX1, STAT3, NANOG e OCT4 durante o desenvolvimento do córtex adrenal fetal, porém apenas a expressão de SF1 permanece no final da gestação e após o nascimento. TAC pediátricos exibem ganho de material gênico, aumento da expressão proteica e aparentemente redução paradoxal do RNAm do SF1 (NR5A1). Marcação nuclear de OCT4 se associa a fenótipo tumoral mais agressivo nos pacientes pediátricos. Parece exisitir interação entre a via Wnt/Beta-catenina e células-tronco, por meio do fator de transcrição NANOG, na tumorigênese adrenocortical. / Background: DAX1 (NR0B1), SF1 (NR5A1) and the Wnt pathway control adrenal stem/progenitor cells development. NANOG, OCT4, SOX2 and STAT3 are involved in the maintenance of stem cells and have role in various types of cancers in different tissues. It is still unclear whether these transcription factors interact to promote adrenocortical tumorigenesis. Objective: In adrenocortical tumors (ACT): to evaluate the gain of genomic material and the expression of mRNA and protein of DAX1 and SF1; to evaluate the mRNA and protein expression of stem cell markers (NANOG, OCT4, SOX2 and STAT3). In the development of the adrenal cortex: to evaluate the protein expression of these genes. In vitro: to evaluate the interaction between the Wnt/Beta-catenin pathway and NANOG expression. Patients & Methods: Panel of 30 fetal human adrenal cortices (20-38 gestational weeks) and 14 postnatal human adrenal cortices. ACT Patients: 96 children/ teenagers (81% female; median age of 1.6 years; 0.4-15.6 years) and 18 adults (10 adenomas and 8 carcinomas; 89% female; median age of 42.5 years; 21-66 years). Normal adrenal tissues (qPCR and MLPA controls): 13 children (median age of 3 years) and 13 adults (median age of 48 years). Protein expression of SF1, DAX1, STAT3, NANOG and OCT4 was assessed by immunohistochemistry in ACT, fetal and postnatal adrenal cortices. The mRNA expression of NR0B1, NR5A1, STAT3, NANOG and POU5F1 (OCT4) was assessed by qPCR in ACT. Gain or loss of NR0B1 and NR5A1 genomic material was assessed by MLPA in ACT. In vitro, NANOG expression (qPCR) was evaluated in H295 adrenal cells before and after inhibition of the Wnt/Beta-catenin pathway with PNU-74654. Results: In the adrenal glands at 20 and 25 gestational weeks, intense staining of SF1, DAX1, SOX2 and OCT4 was detected in the subcapsular region and a diffuse pattern mild to moderate staining of STAT3 and NANOG. After 31 weeks and in the postnatal period, intense SF1 staining persisted, but the staining of DAX1, STAT3, NANOG and OCT4 decreased or disappeared. In the ACT, the nuclear staining of SF1 was positive in 67% of pediatric samples and in 19% of adult samples. Gain of NR5A1 genomic material was observed in 71% of pediatric ACT and 33% of adult ACT. However, hypoexpression of NR5A1 mRNA was observed in 84% of pediatric ACT. No gain of genomic material or increase in mRNA expression of NR0B1 was observed in pediatric ACT. However, in 45% of these tumors nuclear staining was detected. In adult ACT, there was an increase in NR0B1 mRNA expression in 89% of the samples. No STAT3 staining was found in pediatric and adult ACT. However, in adult ACT, the STAT3 mRNA expression was significantly higher in adenomas than in carcinomas. In turn, the nuclear marking of OCT4 was significantly associated with the occurrence of metastases in pediatric patients. In the TACs with the p.S45P mutation in the Beta-catenin gene significantly increased NANOG mRNA expression was detected. In addition, after in vitro inhibition of the Wnt / Beta-catenin pathway in adrenal tumor cells there was a significant reduction in NANOG mRNA expression. Conclusion: There is a temporal pattern in the expression of SF1, DAX1, STAT3, NANOG and OCT4 during the development of the fetal adrenal cortex, but only SF1 expression remains at the end of gestation and after birth. Pediatric ACT show gain in NR5A1 gene material, increase in its protein expression but an apparent paradoxical reduction of mRNA. Nuclear staining of OCT4 is associated with more aggressive tumor phenotype in pediatric patients. There appears to be an interaction between the Wnt/Beta-catenin pathway and stem cells via NANOG, in adrenocortical tumorigenesis.

A necropsia é essencial para a identificação da causa de morte e dos processos que culminaram no óbito do animal. O presente estudo visou à pesquisa da real ocorrência de morte súbita e inesperada em cães submetidos à necropsia, e à determinação da discrepância entre as suspeitas dos proprietários em relação ao estado de saúde prévio e à causa de morte de seus cães, quando comparadas às conclusões necroscópicas. Este trabalho também focou nas alterações morfológicas e funcionais nas glândulas adrenais de cães necropsiados, a fim de se estudar a aplicação de possíveis marcadores da resposta adrenal ao estresse sofrido pelo animal na iminência do óbito. Foram utilizados os dados de 82 cães necropsiados na FMVZ-USP para análise da ocorrência real de morte súbita nestes animais. As alterações morfológicas nas adrenais de 46 cães necropsiados foram avaliadas através de análises morfométricas e histopatológicas. Também foram avaliados os índices de proliferação e apoptose nas células do córtex adrenal em relação à causa de morte do animal, através da marcação imunoistoquímica para o antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) e para BAX e Bcl-2, proteínas envolvidas na regulação da apoptose. A análise das alterações funcionais sofridas pelas adrenais focou na quantificação das concentrações das catecolaminas adrenalina e noradrenalina na medula adrenal dos cães por cromatografia líquida de alta eficiência com detecção eletroquímica (CLAE-DE). Dentre os resultados encontrados, a suspeita do proprietário de que seu cão sofreu uma morte súbita e inesperada é muito maior do que a real ocorrência deste tipo de morte em cães, sendo o óbito por decorrência de complicações de doenças muito mais frequente. As características morfométricas das adrenais dos cães apresentaram maior influência pelo peso corpóreo do animal e pela presença ou ausência de hiperplasia cortical do que pela associação com doenças crônicas ou condições agudas. Cães que vieram a óbito em decorrência de complicações de doenças crônicas exibiram fibrose em região corticomedular e focos de infiltrado inflamatório, ausentes nos animais com morte súbita ou doenças agudas, além de maior ocorrência de hiperplasia adrenocortical. Cães que sofriam de alterações cardíacas crônicas apresentaram alterações histopatológicas significativas mais marcantes em suas adrenais, como necrose, fibrose e depleção vacuolar cortical. Por outro lado, a congestão severa nas adrenais foi um achado mais frequente nos animais previamente saudáveis que sofreram morte súbita ou que vieram a óbito por doenças agudas. A avaliação dos índices de proliferação celular e apoptose no córtex das adrenais através da marcação imunoistoquímica para PCNA e BAX e Bcl-2, respectivamente, não apresentou potencial relevante para o estudo dos efeitos do estresse por doenças crônicas sobre as adrenais de cães. As concentrações de adrenalina e noradrenalina na medula adrenal se mostraram muito maiores em cães machos quando comparados às fêmeas. Os achados deste estudo podem auxiliar nas conclusões da necropsia, sendo especialmente relevantes em casos médico-legais, nos quais todos os achados possíveis devem ser relatados e analisados a fim de se prover um diagnóstico preciso, seguro e incontroverso / The necropsy is essential to identify the cause of death and the processes that culminated in the death of the animal. The present study aimed to research the actual occurrence of sudden and unexpected death in dogs subjected to necropsy, and to determine the discrepancy between the suspicions of owners regarding the previous state of health or cause of death of their dogs when compared to the gross findings. This work also focused on the morphological and functional changes in the adrenal glands of dogs submitted to necropsy in order to study the application of possible markers of adrenal stress response experienced by the animal on the verge of death. The data of 82 dogs necropsied in FMVZ-USP was used for analysis of the actual occurrence of sudden death in these animals. The morphological changes in the adrenal glands of 46 necropsied dogs were evaluated by morphometric and histopathological analysis. The proliferation rates and apoptosis in cells of the adrenal cortex regarding the cause of death of the animal were also evaluated by immunohistochemical staining for the nuclear antigen of cellular proliferation (PCNA) and BAX and Bcl-2, proteins involved in apoptosis regulation. The analysis of functional changes in the adrenal gland focused on quantifying the concentrations of the catecholamines adrenaline and noradrenaline in the adrenal medulla of dogs by high-performance liquid chromatography with electrochemical detection (HPLC-DE). Regarding the results of this study, the owners’ suspicion that their dog suffered a sudden and unexpected death is much greater than the actual occurrence of this type of death in dogs, while death due to complications from diseases is far more frequent. The morphometric characteristics of the adrenal glands of dogs showed greater influence by the body weight of the animal and the presence or absence of cortical hyperplasia than by association with chronic or acute conditions. Dogs that died due to chronic disease complications exhibited fibrosis in the corticomedullary region and foci of inflammatory infiltrate, absent in animals with sudden death or acute diseases, as well as higher incidence of adrenocortical hyperplasia. Dogs suffering from chronic cardiac conditions showed more marked significant histopathological changes in their adrenal glands, such as necrosis, fibrosis and cortical vacuolar depletion. On the other hand, severe congestion in the adrenal glands was a frequent finding in previously healthy animals who suffered sudden death or that died from acute illnesses. The evaluation of cell proliferation rates and apoptosis in the cortex of the adrenal by immunohistochemical staining for PCNA and BAX and Bcl-2, respectively, did not show significant potential for studying the effects of stress by chronic diseases in the adrenal glands of dogs. The adrenaline and noradrenaline concentrations in the adrenal medulla were much higher in male dogs when compared to females. This study’s findings may help the necropsy conclusions, which are particularly relevant in forensic cases where all possible findings should be reported and analyzed in order to provide an accurate, confident and uncontroversial diagnosis

Introdução: DAX1 (NR0B1), SF1 (NR5A1) e a via Wnt controlam o desenvolvimento de células progenitoras/tronco adrenais. NANOG, OCT4, SOX2 e STAT3 estão envolvidos na manutenção de células-tronco e têm papel em vários cânceres de diferentes tecidos. Ainda não está claro se esses fatores de transcrição interagem para promover a tumorigênese adrenocortical. Objetivo: Nos tumores adrenocorticais (TAC): avaliar o ganho de material genômico e a expressão de RNAm e proteica de DAX1 e SF1; avaliar a expressão de RNAm e proteica de marcadores de células-tronco (NANOG, OCT4, SOX2 e STAT3). No desenvolvimento do córtex adrenal: avaliar a expressão proteica desses genes. In vitro: avaliar a interação entre a via Wnt/Beta-catenina e a expressão de NANOG. Pacientes e Métodos: Painel de 30 córtices adrenais fetais humanos (20-38 semanas de gestação) e 14 pós-natais. Pacientes com TAC: 96 crianças/adolescentes (81% do sexo feminino, idade mediana de 1,6 anos [0,4 a 15,6 anos]) e 18 adultos (10 adenomas e 8 carcinomas, 89% do sexo feminino e idade mediana de 42,5 anos [21-66 anos]). Tecidos adrenais normais (controles para qPCR e MLPA): 13 crianças (idade mediana de 3 anos) e 13 adultos (mediana de idade de 48 anos). A expressão proteica de SF1, DAX1, STAT3, NANOG e OCT4 foi avaliada por imunohistoquímica nos TAC e nos córtices adrenais fetais e pós-natais. A expressão de RNAm de NR0B1, NR5A1, STAT3, NANOG e POU5F1 (OCT4) foi avaliada por qPCR nos TAC. Ganho ou perda de material genômico de NR0B1 e NR5A1 foi avaliada por MLPA nos TAC. In vitro, a expressão de NANOG (qPCR) foi avaliada em células adrenais H295 antes e após inibição da via Wnt/Beta-catenina com a substância PNU-74654. Resultados: Em adrenais fetais com 20 e 25 semanas de gestação detectou-se marcação intensa de SF1, DAX1, SOX2 e OCT4 na região subcapsular e marcação leve a moderada e difusa de STAT3 e NANOG. Após as 31 semanas e no período pós-natal, a marcação intensa de SF1 persistiu, porém a marcação de DAX1, STAT3, NANOG e OCT4 diminuiu ou desapareceu. Nos TAC, a marcação nuclear de SF1 foi positiva em 67% das amostras pediátricas e em 19% das amostras de adultos. Ganho de material genômico do NR5A1 foi observado em 71% dos TAC pediátricos e 33% de TAC adultos. Porém observou-se hipoexpressão do RNAm do NR5A1 em 84% dos TAC pediátricos. Nenhum ganho de material genômico ou aumento da expressão do RNAm do NR0B1 foi observado nos TAC pediátricos. Porém em 45% desses tumores detectou-se marcação nuclear. Nos TAC de pacientes adultos, houve aumento da expressão de RNAm de NR0B1 em 89% das amostras. Não se observou marcação de STAT3 nos TAC pediátricos e adultos. Porém nos pacientes adultos, a expressão do RNAm de STAT3 foi significativamente maior nos adenomas do que nos carcinomas. Por sua vez, a marcação nuclear do OCT4 associou-se significativamente com a ocorrência de metástases nos pacientes pediátricos. Nos TAC com a mutação p.S45P no gene da Beta-catenina detectou-se expressão significativamente aumentada do RNAm do NANOG. Além disso, após a inibição in vitro da via Wnt/Beta-catenina nas células tumorais adrenais houve redução significativa na expressão do RNAm de NANOG. Conclusão: Existe um padrão temporal na expressão de SF1, DAX1, STAT3, NANOG e OCT4 durante o desenvolvimento do córtex adrenal fetal, porém apenas a expressão de SF1 permanece no final da gestação e após o nascimento. TAC pediátricos exibem ganho de material gênico, aumento da expressão proteica e aparentemente redução paradoxal do RNAm do SF1 (NR5A1). Marcação nuclear de OCT4 se associa a fenótipo tumoral mais agressivo nos pacientes pediátricos. Parece exisitir interação entre a via Wnt/Beta-catenina e células-tronco, por meio do fator de transcrição NANOG, na tumorigênese adrenocortical. / Background: DAX1 (NR0B1), SF1 (NR5A1) and the Wnt pathway control adrenal stem/progenitor cells development. NANOG, OCT4, SOX2 and STAT3 are involved in the maintenance of stem cells and have role in various types of cancers in different tissues. It is still unclear whether these transcription factors interact to promote adrenocortical tumorigenesis. Objective: In adrenocortical tumors (ACT): to evaluate the gain of genomic material and the expression of mRNA and protein of DAX1 and SF1; to evaluate the mRNA and protein expression of stem cell markers (NANOG, OCT4, SOX2 and STAT3). In the development of the adrenal cortex: to evaluate the protein expression of these genes. In vitro: to evaluate the interaction between the Wnt/Beta-catenin pathway and NANOG expression. Patients & Methods: Panel of 30 fetal human adrenal cortices (20-38 gestational weeks) and 14 postnatal human adrenal cortices. ACT Patients: 96 children/ teenagers (81% female; median age of 1.6 years; 0.4-15.6 years) and 18 adults (10 adenomas and 8 carcinomas; 89% female; median age of 42.5 years; 21-66 years). Normal adrenal tissues (qPCR and MLPA controls): 13 children (median age of 3 years) and 13 adults (median age of 48 years). Protein expression of SF1, DAX1, STAT3, NANOG and OCT4 was assessed by immunohistochemistry in ACT, fetal and postnatal adrenal cortices. The mRNA expression of NR0B1, NR5A1, STAT3, NANOG and POU5F1 (OCT4) was assessed by qPCR in ACT. Gain or loss of NR0B1 and NR5A1 genomic material was assessed by MLPA in ACT. In vitro, NANOG expression (qPCR) was evaluated in H295 adrenal cells before and after inhibition of the Wnt/Beta-catenin pathway with PNU-74654. Results: In the adrenal glands at 20 and 25 gestational weeks, intense staining of SF1, DAX1, SOX2 and OCT4 was detected in the subcapsular region and a diffuse pattern mild to moderate staining of STAT3 and NANOG. After 31 weeks and in the postnatal period, intense SF1 staining persisted, but the staining of DAX1, STAT3, NANOG and OCT4 decreased or disappeared. In the ACT, the nuclear staining of SF1 was positive in 67% of pediatric samples and in 19% of adult samples. Gain of NR5A1 genomic material was observed in 71% of pediatric ACT and 33% of adult ACT. However, hypoexpression of NR5A1 mRNA was observed in 84% of pediatric ACT. No gain of genomic material or increase in mRNA expression of NR0B1 was observed in pediatric ACT. However, in 45% of these tumors nuclear staining was detected. In adult ACT, there was an increase in NR0B1 mRNA expression in 89% of the samples. No STAT3 staining was found in pediatric and adult ACT. However, in adult ACT, the STAT3 mRNA expression was significantly higher in adenomas than in carcinomas. In turn, the nuclear marking of OCT4 was significantly associated with the occurrence of metastases in pediatric patients. In the TACs with the p.S45P mutation in the Beta-catenin gene significantly increased NANOG mRNA expression was detected. In addition, after in vitro inhibition of the Wnt / Beta-catenin pathway in adrenal tumor cells there was a significant reduction in NANOG mRNA expression. Conclusion: There is a temporal pattern in the expression of SF1, DAX1, STAT3, NANOG and OCT4 during the development of the fetal adrenal cortex, but only SF1 expression remains at the end of gestation and after birth. Pediatric ACT show gain in NR5A1 gene material, increase in its protein expression but an apparent paradoxical reduction of mRNA. Nuclear staining of OCT4 is associated with more aggressive tumor phenotype in pediatric patients. There appears to be an interaction between the Wnt/Beta-catenin pathway and stem cells via NANOG, in adrenocortical tumorigenesis.