A Adrenoleucodistrofia ligada ao X (X-ALD) é uma doença hereditária dos peroxissomos causada por mutações no gene ABCD1 -ATP-binding cassete (ABC), subfamília D, membro 1- um meio transportador peroxissômico: a proteína da adrenoleucodistrofia (ALDP). Bioquimicamente, a X-ALD é caracterizada pelo acúmulo de ácidos graxos de cadeia muito longa (VLCFA) e pelo impedimento parcial da Q-oxidação destes lipídeos no peroxissomo. O espectro clínico masculino varia desde insuficiência adrenal isolada, mieloneuropatia lentamente progressiva (AMN) a desmilelinização cerebral generalizada. As heterozigotas sintomáticas desenvolvem um quadro degenerativo e lentamente progressivo similar a AMN masculina. Por apresentarem a forma “pura” AMN, as heterozigotas foram escolhidas como modelo de estudo da mieloneuropatia da X-ALD. Estudamos uma coorte de 33 heterozigotas em relação a suas manifestações neurológicas e neurofisiológicas e correlacionamos à idade, duração da doença, tipos e localização das mutações, padrão de inativação do cromossomo X e através de um marcador de dano neuronal: a Enolase (NSE). Métodos: 39 heterozigotas previamente diagnosticadas em nossa instituição foram convidadas a participar e, após o consentimento, 37 realizaram o screening inicial. Quatro foram excluídas por apresentarem outras possíveis causas de mieloneuropatia. Trinta e três foram incluídas no grupo final e avaliadas através de duas escalas clínicas para mielopatia (JOA e SSPROM), de estudos de neurocondução periférica (NCS) e de potenciais evocados somatossensitivos (SEP). O padrão de inativação foi estudado através do ensaio de metilação HUMARA e a NSE medida através de ensaio de eletroquimiluminescência. Os dados foram correlacionados com variáveis demográficas e tipo e posição da mutação. C26:0 e C26:0/C22:0 previamente coletados também foram analisados. Resultados: 33 mulheres (29 sintomáticas) foram avaliadas. Sintomáticas e assintomáticas tinham diferenças significativas (m±dp) em relação à idade (43.9 ± 10.2 VS 24.3 ± 4.6), JOA (14.5 ± 1.7 VS 16.6 ± 0.2) e SSPROM (86.6± 7.9 VS 98.4 ± 1.1) escores (p<0.05). Ambas, JOA (r = -0.68) e SSPROM (r = -0.65) correlacionaram-se com a idade independente do estado sintomático (p = 0.0001, Spearman). Não houve achados importantes nos NCS, exceto pela amplitude do nervo fibular superficial com a idade ao início dos sintomas (rs = 0.55, p = 0.015). De todas heterozigotas, 72% apresentaram latências prolongadas na condução central ascendente dos membros inferiores avaliadas através do P40. SSPROM e P40 foram significativamente correlacionados (rs = -0.47, p = 0.018). Os tipos e posições das mutações e o padrão de lyonização não foram associados ao estado da doença. Os valores de NSE foram diferentes entre as heterozigotas e controles (12.9 ± 7 e 7.2 ± 7 Zg/l p = 0.012, Mann-Whitney U). Os valores dos VLCFA eram diretamente proporcionais ao aumento da idade da paciente no momento da coleta. Discussão: manifestações neurológicas correlacionam-se claramente com a idade e foram bastante comuns na presente coorte. Não houve explicações moleculares sobre porque algumas mulheres são mais afetadas que outras. Ambas, JOA e SSPROM foram capazes de discriminar as assintomáticas das sintomáticas. As escalas, o P40 e a NSE podem ser ferramentas úteis para acompanhar a progressão da doença em futuros estudos. Os achados neurofisiológicos reforçam a idéia prévia de que a doença neurológica nas mulheres acomete predominantemente as vias medulares com padrão ascendente e que o início dos sintomas possa ser simplesmente uma questão de tempo. / X-linked adrenoleukodystrophy (X-ALD) is an inherited peroxisomal disorder caused by mutations in the ABCD1 gene - ATP-binding cassette (ABC) transporter ABCD1, subfamily D, member 1- a peroxisomal half transporter: the adrenoleukodystrophy protein (ALDP). Biochemically, X-ALD is characterized by accumulation of very longchain fatty acids (VLCFA) and partially impaired peroxisomal Q-oxidation. The clinical spectrum in males with X-ALD ranges from isolated adrenocortical insufficiency and slowly progressive myeloneuropathy (AMN) to devastating cerebral demyelination. The symptomatic heterozygotes develop a slowly progressive degenerative picture similar to the male AMN. Due to the “pure” AMN presentation of the heterozygotes, they were chosen as our model of X-ALD myeloneuropathy. We studied a cohort of 33 X-ALD heterozygotes in regards to their neurological and neurophysiological manifestations and correlated them with age, disease duration, types and position of mutations, X inactivation pattern, and the serum concentration of a neuron damage marker: Enolase (NSE). Methods: 39 heterozygotes previously diagnosed in our institution were invited to participate and, after consent, 37 went through the initial screening. Four were excluded due to the presence of other possible causes of myeloneuropathy. Thirty three were evaluated through two clinical scales for myelopathy (JOA and SSPROM); peripheral nerve conduction studies (NCS) and somatosensory evoked potentials (SEP). The inactivation pattern was tested by HUMARA methylation assay, and serum NSE was measured through eletrochemiluminescent assay. The data was correlated with demographic variables and type and position of the mutation. C26:0 and C26:0/C22:0 ratios were also analyzed. Results: 33 women (29 symptomatic) were analyzed. Symptomatic and asymptomatic women presented significantly different m±sd ages (43.9 ± 10.2 vs 24.3 ± 4.6), JOA (14.5 ± 1.7 vs 16.6 ± 0.2) and SSPROM (86.6± 7.9 vs 98.4 ± 1.1) scores (p<0.05). Both JOA (r = -0.68) and SSPROM (r = -0.65) correlated with age, irrespectively of the disease status (p = 0.0001, Spearman). There were no remarkable findings on NCS except for the fibular superficial nerve amplitudes that correlated with age at onset of symptoms among the heterozygotes (rs = 0.55, p = 0.015). Of all heterozygotes, 72% presented delayed latencies in the central ascending conduction studies from the lower limbs: P40. SSPROM and P40 latency were significantly correlated (rs = -0.47, p = 0.018). Types and positions of mutations and inactivation pattern were not associated with the disease status. NSE values were different between heterozygotes and controls (12.9 ± 7 and 7.2 ± 7 Zg/l p = 0.012, Mann-Whitney U). The higher the VLCFA levels and the more skewed the inactivation pattern as the older the women were at the time of the VLCFA sample collection. Discussion: neurologic manifestations clearly correlated to age and were quite common in the present cohort. There were no molecular clues to explain why some women were more affected than others. Both JOA and SSPROM scales were able to discriminate the asymptomatic from the symptomatic heterozygotes. Both scales plus P40 latency and NSE might be useful tools to follow the disease progression in future studies. The neurophysiologic findings supported the previous idea that the neuronal disease in the women has a predominant spinal cord involvement with an ascending pattern and that the beginning of symptoms might be a matter of time.

A Adrenoleucodistrofia ligada ao X (X-ALD) é uma doença hereditária dos peroxissomos causada por mutações no gene ABCD1 -ATP-binding cassete (ABC), subfamília D, membro 1- um meio transportador peroxissômico: a proteína da adrenoleucodistrofia (ALDP). Bioquimicamente, a X-ALD é caracterizada pelo acúmulo de ácidos graxos de cadeia muito longa (VLCFA) e pelo impedimento parcial da Q-oxidação destes lipídeos no peroxissomo. O espectro clínico masculino varia desde insuficiência adrenal isolada, mieloneuropatia lentamente progressiva (AMN) a desmilelinização cerebral generalizada. As heterozigotas sintomáticas desenvolvem um quadro degenerativo e lentamente progressivo similar a AMN masculina. Por apresentarem a forma “pura” AMN, as heterozigotas foram escolhidas como modelo de estudo da mieloneuropatia da X-ALD. Estudamos uma coorte de 33 heterozigotas em relação a suas manifestações neurológicas e neurofisiológicas e correlacionamos à idade, duração da doença, tipos e localização das mutações, padrão de inativação do cromossomo X e através de um marcador de dano neuronal: a Enolase (NSE). Métodos: 39 heterozigotas previamente diagnosticadas em nossa instituição foram convidadas a participar e, após o consentimento, 37 realizaram o screening inicial. Quatro foram excluídas por apresentarem outras possíveis causas de mieloneuropatia. Trinta e três foram incluídas no grupo final e avaliadas através de duas escalas clínicas para mielopatia (JOA e SSPROM), de estudos de neurocondução periférica (NCS) e de potenciais evocados somatossensitivos (SEP). O padrão de inativação foi estudado através do ensaio de metilação HUMARA e a NSE medida através de ensaio de eletroquimiluminescência. Os dados foram correlacionados com variáveis demográficas e tipo e posição da mutação. C26:0 e C26:0/C22:0 previamente coletados também foram analisados. Resultados: 33 mulheres (29 sintomáticas) foram avaliadas. Sintomáticas e assintomáticas tinham diferenças significativas (m±dp) em relação à idade (43.9 ± 10.2 VS 24.3 ± 4.6), JOA (14.5 ± 1.7 VS 16.6 ± 0.2) e SSPROM (86.6± 7.9 VS 98.4 ± 1.1) escores (p<0.05). Ambas, JOA (r = -0.68) e SSPROM (r = -0.65) correlacionaram-se com a idade independente do estado sintomático (p = 0.0001, Spearman). Não houve achados importantes nos NCS, exceto pela amplitude do nervo fibular superficial com a idade ao início dos sintomas (rs = 0.55, p = 0.015). De todas heterozigotas, 72% apresentaram latências prolongadas na condução central ascendente dos membros inferiores avaliadas através do P40. SSPROM e P40 foram significativamente correlacionados (rs = -0.47, p = 0.018). Os tipos e posições das mutações e o padrão de lyonização não foram associados ao estado da doença. Os valores de NSE foram diferentes entre as heterozigotas e controles (12.9 ± 7 e 7.2 ± 7 Zg/l p = 0.012, Mann-Whitney U). Os valores dos VLCFA eram diretamente proporcionais ao aumento da idade da paciente no momento da coleta. Discussão: manifestações neurológicas correlacionam-se claramente com a idade e foram bastante comuns na presente coorte. Não houve explicações moleculares sobre porque algumas mulheres são mais afetadas que outras. Ambas, JOA e SSPROM foram capazes de discriminar as assintomáticas das sintomáticas. As escalas, o P40 e a NSE podem ser ferramentas úteis para acompanhar a progressão da doença em futuros estudos. Os achados neurofisiológicos reforçam a idéia prévia de que a doença neurológica nas mulheres acomete predominantemente as vias medulares com padrão ascendente e que o início dos sintomas possa ser simplesmente uma questão de tempo. / X-linked adrenoleukodystrophy (X-ALD) is an inherited peroxisomal disorder caused by mutations in the ABCD1 gene - ATP-binding cassette (ABC) transporter ABCD1, subfamily D, member 1- a peroxisomal half transporter: the adrenoleukodystrophy protein (ALDP). Biochemically, X-ALD is characterized by accumulation of very longchain fatty acids (VLCFA) and partially impaired peroxisomal Q-oxidation. The clinical spectrum in males with X-ALD ranges from isolated adrenocortical insufficiency and slowly progressive myeloneuropathy (AMN) to devastating cerebral demyelination. The symptomatic heterozygotes develop a slowly progressive degenerative picture similar to the male AMN. Due to the “pure” AMN presentation of the heterozygotes, they were chosen as our model of X-ALD myeloneuropathy. We studied a cohort of 33 X-ALD heterozygotes in regards to their neurological and neurophysiological manifestations and correlated them with age, disease duration, types and position of mutations, X inactivation pattern, and the serum concentration of a neuron damage marker: Enolase (NSE). Methods: 39 heterozygotes previously diagnosed in our institution were invited to participate and, after consent, 37 went through the initial screening. Four were excluded due to the presence of other possible causes of myeloneuropathy. Thirty three were evaluated through two clinical scales for myelopathy (JOA and SSPROM); peripheral nerve conduction studies (NCS) and somatosensory evoked potentials (SEP). The inactivation pattern was tested by HUMARA methylation assay, and serum NSE was measured through eletrochemiluminescent assay. The data was correlated with demographic variables and type and position of the mutation. C26:0 and C26:0/C22:0 ratios were also analyzed. Results: 33 women (29 symptomatic) were analyzed. Symptomatic and asymptomatic women presented significantly different m±sd ages (43.9 ± 10.2 vs 24.3 ± 4.6), JOA (14.5 ± 1.7 vs 16.6 ± 0.2) and SSPROM (86.6± 7.9 vs 98.4 ± 1.1) scores (p<0.05). Both JOA (r = -0.68) and SSPROM (r = -0.65) correlated with age, irrespectively of the disease status (p = 0.0001, Spearman). There were no remarkable findings on NCS except for the fibular superficial nerve amplitudes that correlated with age at onset of symptoms among the heterozygotes (rs = 0.55, p = 0.015). Of all heterozygotes, 72% presented delayed latencies in the central ascending conduction studies from the lower limbs: P40. SSPROM and P40 latency were significantly correlated (rs = -0.47, p = 0.018). Types and positions of mutations and inactivation pattern were not associated with the disease status. NSE values were different between heterozygotes and controls (12.9 ± 7 and 7.2 ± 7 Zg/l p = 0.012, Mann-Whitney U). The higher the VLCFA levels and the more skewed the inactivation pattern as the older the women were at the time of the VLCFA sample collection. Discussion: neurologic manifestations clearly correlated to age and were quite common in the present cohort. There were no molecular clues to explain why some women were more affected than others. Both JOA and SSPROM scales were able to discriminate the asymptomatic from the symptomatic heterozygotes. Both scales plus P40 latency and NSE might be useful tools to follow the disease progression in future studies. The neurophysiologic findings supported the previous idea that the neuronal disease in the women has a predominant spinal cord involvement with an ascending pattern and that the beginning of symptoms might be a matter of time.

A Adrenoleucodistrofia ligada ao X (X-ALD) é uma doença hereditária dos peroxissomos causada por mutações no gene ABCD1 -ATP-binding cassete (ABC), subfamília D, membro 1- um meio transportador peroxissômico: a proteína da adrenoleucodistrofia (ALDP). Bioquimicamente, a X-ALD é caracterizada pelo acúmulo de ácidos graxos de cadeia muito longa (VLCFA) e pelo impedimento parcial da Q-oxidação destes lipídeos no peroxissomo. O espectro clínico masculino varia desde insuficiência adrenal isolada, mieloneuropatia lentamente progressiva (AMN) a desmilelinização cerebral generalizada. As heterozigotas sintomáticas desenvolvem um quadro degenerativo e lentamente progressivo similar a AMN masculina. Por apresentarem a forma “pura” AMN, as heterozigotas foram escolhidas como modelo de estudo da mieloneuropatia da X-ALD. Estudamos uma coorte de 33 heterozigotas em relação a suas manifestações neurológicas e neurofisiológicas e correlacionamos à idade, duração da doença, tipos e localização das mutações, padrão de inativação do cromossomo X e através de um marcador de dano neuronal: a Enolase (NSE). Métodos: 39 heterozigotas previamente diagnosticadas em nossa instituição foram convidadas a participar e, após o consentimento, 37 realizaram o screening inicial. Quatro foram excluídas por apresentarem outras possíveis causas de mieloneuropatia. Trinta e três foram incluídas no grupo final e avaliadas através de duas escalas clínicas para mielopatia (JOA e SSPROM), de estudos de neurocondução periférica (NCS) e de potenciais evocados somatossensitivos (SEP). O padrão de inativação foi estudado através do ensaio de metilação HUMARA e a NSE medida através de ensaio de eletroquimiluminescência. Os dados foram correlacionados com variáveis demográficas e tipo e posição da mutação. C26:0 e C26:0/C22:0 previamente coletados também foram analisados. Resultados: 33 mulheres (29 sintomáticas) foram avaliadas. Sintomáticas e assintomáticas tinham diferenças significativas (m±dp) em relação à idade (43.9 ± 10.2 VS 24.3 ± 4.6), JOA (14.5 ± 1.7 VS 16.6 ± 0.2) e SSPROM (86.6± 7.9 VS 98.4 ± 1.1) escores (p<0.05). Ambas, JOA (r = -0.68) e SSPROM (r = -0.65) correlacionaram-se com a idade independente do estado sintomático (p = 0.0001, Spearman). Não houve achados importantes nos NCS, exceto pela amplitude do nervo fibular superficial com a idade ao início dos sintomas (rs = 0.55, p = 0.015). De todas heterozigotas, 72% apresentaram latências prolongadas na condução central ascendente dos membros inferiores avaliadas através do P40. SSPROM e P40 foram significativamente correlacionados (rs = -0.47, p = 0.018). Os tipos e posições das mutações e o padrão de lyonização não foram associados ao estado da doença. Os valores de NSE foram diferentes entre as heterozigotas e controles (12.9 ± 7 e 7.2 ± 7 Zg/l p = 0.012, Mann-Whitney U). Os valores dos VLCFA eram diretamente proporcionais ao aumento da idade da paciente no momento da coleta. Discussão: manifestações neurológicas correlacionam-se claramente com a idade e foram bastante comuns na presente coorte. Não houve explicações moleculares sobre porque algumas mulheres são mais afetadas que outras. Ambas, JOA e SSPROM foram capazes de discriminar as assintomáticas das sintomáticas. As escalas, o P40 e a NSE podem ser ferramentas úteis para acompanhar a progressão da doença em futuros estudos. Os achados neurofisiológicos reforçam a idéia prévia de que a doença neurológica nas mulheres acomete predominantemente as vias medulares com padrão ascendente e que o início dos sintomas possa ser simplesmente uma questão de tempo. / X-linked adrenoleukodystrophy (X-ALD) is an inherited peroxisomal disorder caused by mutations in the ABCD1 gene - ATP-binding cassette (ABC) transporter ABCD1, subfamily D, member 1- a peroxisomal half transporter: the adrenoleukodystrophy protein (ALDP). Biochemically, X-ALD is characterized by accumulation of very longchain fatty acids (VLCFA) and partially impaired peroxisomal Q-oxidation. The clinical spectrum in males with X-ALD ranges from isolated adrenocortical insufficiency and slowly progressive myeloneuropathy (AMN) to devastating cerebral demyelination. The symptomatic heterozygotes develop a slowly progressive degenerative picture similar to the male AMN. Due to the “pure” AMN presentation of the heterozygotes, they were chosen as our model of X-ALD myeloneuropathy. We studied a cohort of 33 X-ALD heterozygotes in regards to their neurological and neurophysiological manifestations and correlated them with age, disease duration, types and position of mutations, X inactivation pattern, and the serum concentration of a neuron damage marker: Enolase (NSE). Methods: 39 heterozygotes previously diagnosed in our institution were invited to participate and, after consent, 37 went through the initial screening. Four were excluded due to the presence of other possible causes of myeloneuropathy. Thirty three were evaluated through two clinical scales for myelopathy (JOA and SSPROM); peripheral nerve conduction studies (NCS) and somatosensory evoked potentials (SEP). The inactivation pattern was tested by HUMARA methylation assay, and serum NSE was measured through eletrochemiluminescent assay. The data was correlated with demographic variables and type and position of the mutation. C26:0 and C26:0/C22:0 ratios were also analyzed. Results: 33 women (29 symptomatic) were analyzed. Symptomatic and asymptomatic women presented significantly different m±sd ages (43.9 ± 10.2 vs 24.3 ± 4.6), JOA (14.5 ± 1.7 vs 16.6 ± 0.2) and SSPROM (86.6± 7.9 vs 98.4 ± 1.1) scores (p<0.05). Both JOA (r = -0.68) and SSPROM (r = -0.65) correlated with age, irrespectively of the disease status (p = 0.0001, Spearman). There were no remarkable findings on NCS except for the fibular superficial nerve amplitudes that correlated with age at onset of symptoms among the heterozygotes (rs = 0.55, p = 0.015). Of all heterozygotes, 72% presented delayed latencies in the central ascending conduction studies from the lower limbs: P40. SSPROM and P40 latency were significantly correlated (rs = -0.47, p = 0.018). Types and positions of mutations and inactivation pattern were not associated with the disease status. NSE values were different between heterozygotes and controls (12.9 ± 7 and 7.2 ± 7 Zg/l p = 0.012, Mann-Whitney U). The higher the VLCFA levels and the more skewed the inactivation pattern as the older the women were at the time of the VLCFA sample collection. Discussion: neurologic manifestations clearly correlated to age and were quite common in the present cohort. There were no molecular clues to explain why some women were more affected than others. Both JOA and SSPROM scales were able to discriminate the asymptomatic from the symptomatic heterozygotes. Both scales plus P40 latency and NSE might be useful tools to follow the disease progression in future studies. The neurophysiologic findings supported the previous idea that the neuronal disease in the women has a predominant spinal cord involvement with an ascending pattern and that the beginning of symptoms might be a matter of time.

A adrenoleucodistrofia ligada ao X (X-ALD) é a doença peroxissomal mais freqüente, com uma incidência de 1:20.000 homens na população geral, sendo identificada em todos os grupos étnicos. O gene envolvido na X-ALD é o gene ABCD1 (ATP-Binding Cassette transporter subfamily D member 1), que codifica uma proteína de membrana peroxissomal, ALDP. Mutações nesse gene são relacionadas ao acúmulo de ácidos graxos de cadeia muito longa (very long chain fatty acids – VLCFA) em todos os tecidos e fluidos corporais, especialmente no sistema nervoso e glândulas adrenais. Até o momento, mais de 1200 mutações já foram descritas neste gene. Três fenótipos principais são claramente identificados entre homens afetados: a forma cerebral (CALD), caracterizada por resposta inflamatória no SNC, a forma não inflamatória, AMN e a insuficiência adrenal isolada, também chamada de Addison-only. Não há correlação entre o tipo de mutação e o fenótipo clínico e uma possível explicação para essa alta variabilidade fenotípica poderia ser a ação de fatores ambientais e genes modificadores. Nesta tese está descrita, provavelmente, a primeira série de casos de pacientes sul-americanos com X-ALD. Foram avaliados aspectos moleculares da X-ALD em uma série de 38 famílias procedentes desde a Argentina até o Amazonas, relacionando-os com dados epidemiológicos e com a avaliação da taxa de sensibilidade e especificidade da análise de VLCFA em mulheres; e foi realizada a busca por potenciais genes modificadores que atuem, por CNV, na variabilidade fenotípica da X-ALD. Encontraram-se 36 mutações diferentes: apenas uma delas recorreu em 3 famílias. Doze destas mutações foram novas: a sua morbidade foi sustentada principalmente pelos graves rearranjos ou códons de parada prematuros por elas produzidos (p.Pro623Leu, p.Glu577X, p.Tyr33_Pro34fsX34, p.Arg538fs, p.Ala232fsX64, p.Trp137fsX57, p.Leu628Glu, p.Ile481Phe, p.Ala95fsX11, p.Gln55X, p.Arg401Gly e p.Ser358fsX42). Quatro situações (ou 10% da série) foram documentadas como mutações de novo. Como era de se esperar, não foi possível determinar nenhuma correlação entre genótipos e fenótipos. Uma das famílias foi identificada a partir de uma menina com CALD e desvio completo da inativação do X. Através da curva de Kaplan-Meyer, descrevemos a idade média de início das três formas principais nos homens: o início do Addison–only foi em média (IC de 95%) aos 7,4 (5,4-9,4) anos, da CALD, aos 10,9 (9,1-12,7) anos, e da AMN, aos 26,4 (20,3-32,5) anos. Descrevemos também a sobrevida média da CALD como de 24,7 (19,8-29,6) anos. Na presente série, 54 dos 87 afetados (ou 62%) apresentavam o fenótipo CALD, uma taxa maior do que a descrita na literatura (de 45 a 57%). Procuramos alguma evidência que vinculasse esse aparente excesso de formas desmielinizantes com a latitude de origem dos casos, à semelhança da esclerose múltipla: nossos resultados foram negativos. Em um subgrupo de famílias foi possível comparar o status genético final de 50 mulheres (heterozigotas versus normais) decorrente da investigação molecular, com os diagnósticos prévios levantados pela investigação bioquímica dos VLCFA. Encontramos uma elevada taxa de casos VLCFA falso-negativos, de 72,5%, muito maior do que a descrita na literatura (20%) e encontramos também dois casos de mulheres com VLCFA falso-positivos. Concluímos que o uso dos VLCFA deve ser evitado no aconselhamento genético. Finalmente, voltamos aos hemizigotos, em busca de genes candidatos a modificadores de fenótipos, através da associação dos mesmos com específicas variações no número de cópias (copy number variation - CNV) em 29 genes selecionados por seu papel na inflamação, metabolismo dos lipídios ou regeneração do sistema nervoso. A estratégia foi investigar CNVs destes genes através da técnica da Multiple Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) em um grupo de 85 pacientes espanhóis e brasileiros: 39 com AMN e 46 com CALD. Conseguimos identificar CNVs em nove destes genes. Interações potenciais entre estes genes foram inferidas a partir da ferramenta da web Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins (STRING) versão 9. A análise das redes criadas identificou três nódulos principais, com a POMC (Proopiomelanocortina) sendo a proteína central. Nós então sugerimos estes genes e a própria POMC como genes candidatos a modificadores do fenótipo X-ALD. / The X-ALD is the most frequent peroxisomal disease with a pan-ethnic incidence of 1:20,000 males in the general population. The gene involved in X-ALD is the ABCD1, which encodes a protein of the peroxisomal membrane, ALDP. Mutations in this gene are related to the accumulation of VLCFA in all tissues and body fluids, especially in the nervous system and adrenal glands. To date, more than 1200 mutations have been described in the gene. Three phenotypes are clearly identified among affected men: the cerebral form (CALD), characterized by inflammation in the CNS, the non-inflammatory form, adrenomyeloneuropathy (AMN), and Addison-only. There is no genotype-phenotype correlation, in spite of the high phenotypic variability observed in affected relatives. This thesis probably describes the first case series of South American patients with X-ALD. We have evaluated the molecular features of X-ALD, correlating them with epidemiological data in a series of 38 South American families. We have also evaluated the sensitivity and specificity of VLCFA in women, and have searched potential modifier genes that may act by CNV in the male phenotypic variability of X-ALD. We found 36 different mutations, only one recurring in three families. Twelve were new mutations: its morbidity was sustained mainly by major rearrangements or stop codons produced by them (p.Pro623Leu, p.Glu577X, p.Tyr33_Pro34fsX34, p.Arg538fs, p.Ala232fsX64, p.Trp137fsX57, p.Leu628Glu, p.Ile481Phe, p.Ala95fsX11, p.Gln55X, p.Arg401Gly and p.Ser358fsX42). Four (or 10% of the series) were documented as de novo mutations. As was expected, no genotype-phenotype correlation was found. One family was identified from a girl with CALD and complete deviation of X inactivation. By Kaplan-Meyer analysis, we have described the onset of the three main forms in men: the mean (95% CI) age at onset of Addison-only was 7.4 (5.4 - 9.4) years, of CALD, 10.9 (9.1 - 12.7) years, and of AMN, 26.4 (20.3 - 32.5) years. We have also estimated the survival of CALD as 24.7 (19.8 to 29.6) years. In this series, 54 of the 87 affected male (or 62%) had the phenotype CALD, a rate higher than that described in the literature (45-57%). We look for any evidence that relates the apparent excess of demyelinating forms with latitude of origin of cases, like multiple sclerosis: the results were negative. In a subgroup of families, the molecular analyses allowed us to compare the genetic status of 50 women (heterozygous versus normal) with the previous biochemical diagnoses raised up by VLCFA. A high rate of false negative VLCFA was disclosed, of 72.5%, significantly greater than the 20% described in literature. We have also found two false positives VLCFA results in females. We conclude that the use of VLCFA should be avoided in genetic counseling. Finally, we turned to hemizygotes, in search of candidate genes that could modify the X-ALD phenotype, chosen by for their role in inflammation, lipid metabolism or in the regeneration of the nervous system. The strategy was to investigate CNVs of these genes through the technique of Multiple Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) in a group of 85 Spanish and Brazilian patients: 39 with AMN and 46 with CALD. We have identified nine CNVs in these genes. Potential interactions between these genes were inferred from the tool Web Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes / Proteins (STRING) version 9. The analysis of network nodes identified three key created, with POMC (proopiomelanocortin) being the core protein. We then suggested they own and POMC genes as candidate genes modifying the phenotype of X-ALD.

As doenças peroxissomais são um grupo de doenças metabólicas geneticamente heterogêneas que compartilham disfunções peroxissomais. Estas disfunções estão associadas a mudanças fundamentais e até mesmo fatais no desenvolvimento neurológico humano. Embora os sintomas neurológicos e as anormalidades cerebrais sejam características dos pacientes com doenças peroxissomais, muito pouco se sabe sobre os mecanismos envolvidos nos danos teciduais destas enfermidades. O principal objetivo deste estudo foi investigar parâmetros de estresse oxidativo em pacientes com enfermidades peroxissomais, como adrenoleucodistrofia ligada ao X (X-ALD) e Espectro Zellweger (ZSD). X-ALD é uma doença peroxissomal bioquimicamente caracterizada pelo acúmulo de ácidos graxos de cadeia muito longa (VLCFA) em diferentes tecidos e fluidos biológicos e clinicamente caracterizada pela desmielinização central e periférica e pela insuficiência adrenal. Sete tipos de formas clínicas já foram descritas, sendo as mais comuns as formas cerebral infantil (cALD), adrenomieloneuropatia (AMN) e assintomática. Um considerável número de heterozigotas (HTZ) para X-ALD desenvolve sintomas neurológicos como o envolvimento da medula espinhal que se assemelha aos das formas mais amenas de AMN. A terapia recomendada para X-ALD consiste no uso da mistura gliceroltrioleato/glieroltrierucato conhecida como óleo de Lorenzo (OL) combinada a uma dieta pobre em VLCFA. No presente estudo, nós inicialmente avaliamos o curso bioquímico de pacientes com X-ALD com as formas cALD e assintomática tratados com OL e dieta restrita em VLCFA. Observamos que a concentração plasmática do ácido hexacosanóico (C26:0) e a razão entre os ácidos hexacosanóico/docosanóico (C26:0/C22:0) estavam significativamente reduzidas nos plasmas dos pacientes cALD e assintomáticos durante o tratamento quando comparado ao diagnóstico. Somente nos pacientes assintomáticos sob tratamento com OL o nível plasmático de C26:0 atingiu os valores de referência. Também, no presente estudo, objetivamos determinar e comparar o dano oxidativo a lipídios (espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico, TBA-RS) e as defesas antioxidantes teciduais (status antioxidante total, TAS) no plasma de pacientes com diferentes formas clínicas (cALD, AMN e assintomáticos). Foi demonstrado que pacientes sintomáticos e assintomáticos com X-ALD apresentaram um aumento significativo da medida de TBA-RS no plasma. Ainda, a determinação de TBA-RS mostrou-se mais aumentada em AMN quando comparada as formas cALD e assintomática. Também observamos que o TAS estava diminuído em pacientes sintomáticos e não em assintomáticos com X-ALD. Subseqüentemente, buscamos avaliar parâmetros de estresse oxidativo em plasma de HTZ para X-ALD para verificar se o dano oxidativo ocorre nestes indivíduos. Foi observado que HTZ para X-ALD apresentaram um aumento significativo da medida de TBA-RS, bem como uma diminuição da reatividade antioxidante total (TAR). ZSD são doenças progressivas caracterizadas pela perda de múltiplas funções metabólicas peroxissomais, sintomas neurológicos e anormalidades cerebrais. Ainda, muito pouco é sabido sobre os mecanismos envolvidos nos danos teciduais dessas enfermidades. Foi observado um aumento significativo na determinação de TBA-RS, assim como uma diminuição no conteúdo total de tióis em plasma de pacientes afetados por ZSD. Ao contrário, a medida de TAS não se mostrou alterada no plasma de indivíduos com ZSD, comparativamente aos controles. Em suma, nossos principais resultados mostram que: a) tratamento com OL em pacientes assintomáticos com X-ALD mostra uma boa resposta bioquímica e é importante recomendá-lo para este grupo de pacientes; b) lipoperoxidação parece ocorrer em formas clínicas sintomáticas (cALD, AMN) e assintomáticas (HTZ e assintomáticos) de X-ALD; c) estresse oxidativo ocorre em cALD, AMN e HTZ para X-ALD, provavelmente contribuindo para a fisiopatologia destas formas clínicas; d) pacientes assintomáticos com X-ALD parecem estar protegidos contra o estresse oxidativo devido a suas defesas antioxidantes normais, sugerindo que outros fatores além do dano oxidativo possam ser responsáveis pela gravidade dos sintomas na X-ALD; e) lipoperoxidação e oxidação protéica podem estar envolvidas na fisiopatologia das doenças do Espectro Zellweger; f) pode ser presumido que os antioxidantes possam ser usados como uma terapia adjuvante em pacientes afetados por doenças peroxissomais. / Peroxisomal disorders are a group of genetically heterogeneous metabolic diseases that shares peroxissomal dysfunctions. These defects functions are associated with major, and often fatal, changes in human neurological development. Although neurological symptoms and brain abnormalities are characteristic of patients with peroxissomal disorders, very little is known about the pathomechanisms involved in the tissue damage of these disorders. The main objective of the present study was to investigate oxidative stress parameters in patients with peroxissomal disorders like Xlinked adrenoleukodystrophy (X-ALD) and Zellweger spectrum disorders (ZSD). XALD is a peroxisomal disease biochemically characterized by the accumulation of very long chain fatty acids (VLCFA) in different tissues and in biological fluids and clinically characterized by central and peripheral demyelination and adrenal insufficiency. Seven clinical variants have been described, being the childhood cerebral form (CCER), adrenomyeloneuropathy (AMN) and asymptomatic the most common clinical forms. A considerable number of heterozygotes (HTZ) for X-ALD develop neurological symptoms like spinal cord involvement resembling milder forms of AMN. The recommended therapy consists of the use of the glyceroltrioleate/glyceroltrierucate mixture known as Lorenzo's Oil (LO), combined with a VLCFA-poor diet. In the present study we initially evaluated the biochemical course of patients with CCER and asymptomatic clinical forms of X-ALD treated with LO associated with a VLCFArestricted diet. We observed that hexacosanoic acid (C26:0) plasma concentrations and hexacosanoic/docosanoic ratio (C26:0/C22:0) were significantly reduced in CCER and asymptomatic patients during treatment when compared with patients at diagnosis. Only in asymptomatic patients under LO treatment, C26:0 plasma level was achieved the reference values. Also, in the present study, we aimed to determine and compare the lipid oxidative damage (thiobarbituric acid-reactive substances, TBA-RS) and the tissue antioxidant defenses (total antioxidant status, TAS) in plasma from patients with various clinical forms of X-ALD (CCER and AMN and asymptomatic). It was demonstrated that symptomatic and asymptomatic X-ALD patients presented a significant increase of plasma TBA-RS measurement. Furthermore, TBA-RS determination was higher in AMN, as compared to CCER and asymptomatic patients. We also observed that TAS was decreased in symptomatic but not in asymptomatic XALD patients. Subsequently, we aimed to evaluate parameters of oxidative stress in plasma of X-ALD female carriers in order to verify whether oxidative damage occurs in these individuals. It was observed that HTZ for X-ALD presented a significant increase of TBA-RS measurement, as well as a decrease of total antioxidant reactivity (TAR). ZSD are progressive disorders characterized by loss of multiple peroxissomal metabolic functions, neurological symptoms and brain abnormalities. Furthermore, very little is known about the pathomechanisms involved in the tissue damage of these disorders It was observed a significant increase of plasma TBA-RS measurement, as well as a decrease of total thiol content in plasma from patients affected by ZSD. In contrast, TAS measurement was not changed in plasma of ZSD patients, as compared to controls. In summary, our main results show that: a) LO treatment in asymptomatic X-ALD patients shows a good biochemical response and it is important to recommend LO treatment to this group of patients; b) lipid peroxidation seems to occur in symptomatic (CCER and AMN) and asymptomatic (HTZ and asymptomatic) clinical forms of XALD; c) oxidative stress occurs in CCER, AMN and HTZ for X-ALD, probably contributing to the pathophysiology of this clinical forms; d) asymptomatics patients seem to be protected against oxidative stress because of their normal antioxidant defenses, suggesting that other factors besides oxidative damage may be responsible for the severity of the symptoms in X-ALD; e) lipid peroxidation and protein oxidation may be involved in the pathophysiology of the Zellweger spectrum disorders; f) it may be presumed that antioxidant might be used as an adjuvant therapy for patients affected by peroxissomal disorders.

As doenças peroxissomais são um grupo de doenças metabólicas geneticamente heterogêneas que compartilham disfunções peroxissomais. Estas disfunções estão associadas a mudanças fundamentais e até mesmo fatais no desenvolvimento neurológico humano. Embora os sintomas neurológicos e as anormalidades cerebrais sejam características dos pacientes com doenças peroxissomais, muito pouco se sabe sobre os mecanismos envolvidos nos danos teciduais destas enfermidades. O principal objetivo deste estudo foi investigar parâmetros de estresse oxidativo em pacientes com enfermidades peroxissomais, como adrenoleucodistrofia ligada ao X (X-ALD) e Espectro Zellweger (ZSD). X-ALD é uma doença peroxissomal bioquimicamente caracterizada pelo acúmulo de ácidos graxos de cadeia muito longa (VLCFA) em diferentes tecidos e fluidos biológicos e clinicamente caracterizada pela desmielinização central e periférica e pela insuficiência adrenal. Sete tipos de formas clínicas já foram descritas, sendo as mais comuns as formas cerebral infantil (cALD), adrenomieloneuropatia (AMN) e assintomática. Um considerável número de heterozigotas (HTZ) para X-ALD desenvolve sintomas neurológicos como o envolvimento da medula espinhal que se assemelha aos das formas mais amenas de AMN. A terapia recomendada para X-ALD consiste no uso da mistura gliceroltrioleato/glieroltrierucato conhecida como óleo de Lorenzo (OL) combinada a uma dieta pobre em VLCFA. No presente estudo, nós inicialmente avaliamos o curso bioquímico de pacientes com X-ALD com as formas cALD e assintomática tratados com OL e dieta restrita em VLCFA. Observamos que a concentração plasmática do ácido hexacosanóico (C26:0) e a razão entre os ácidos hexacosanóico/docosanóico (C26:0/C22:0) estavam significativamente reduzidas nos plasmas dos pacientes cALD e assintomáticos durante o tratamento quando comparado ao diagnóstico. Somente nos pacientes assintomáticos sob tratamento com OL o nível plasmático de C26:0 atingiu os valores de referência. Também, no presente estudo, objetivamos determinar e comparar o dano oxidativo a lipídios (espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico, TBA-RS) e as defesas antioxidantes teciduais (status antioxidante total, TAS) no plasma de pacientes com diferentes formas clínicas (cALD, AMN e assintomáticos). Foi demonstrado que pacientes sintomáticos e assintomáticos com X-ALD apresentaram um aumento significativo da medida de TBA-RS no plasma. Ainda, a determinação de TBA-RS mostrou-se mais aumentada em AMN quando comparada as formas cALD e assintomática. Também observamos que o TAS estava diminuído em pacientes sintomáticos e não em assintomáticos com X-ALD. Subseqüentemente, buscamos avaliar parâmetros de estresse oxidativo em plasma de HTZ para X-ALD para verificar se o dano oxidativo ocorre nestes indivíduos. Foi observado que HTZ para X-ALD apresentaram um aumento significativo da medida de TBA-RS, bem como uma diminuição da reatividade antioxidante total (TAR). ZSD são doenças progressivas caracterizadas pela perda de múltiplas funções metabólicas peroxissomais, sintomas neurológicos e anormalidades cerebrais. Ainda, muito pouco é sabido sobre os mecanismos envolvidos nos danos teciduais dessas enfermidades. Foi observado um aumento significativo na determinação de TBA-RS, assim como uma diminuição no conteúdo total de tióis em plasma de pacientes afetados por ZSD. Ao contrário, a medida de TAS não se mostrou alterada no plasma de indivíduos com ZSD, comparativamente aos controles. Em suma, nossos principais resultados mostram que: a) tratamento com OL em pacientes assintomáticos com X-ALD mostra uma boa resposta bioquímica e é importante recomendá-lo para este grupo de pacientes; b) lipoperoxidação parece ocorrer em formas clínicas sintomáticas (cALD, AMN) e assintomáticas (HTZ e assintomáticos) de X-ALD; c) estresse oxidativo ocorre em cALD, AMN e HTZ para X-ALD, provavelmente contribuindo para a fisiopatologia destas formas clínicas; d) pacientes assintomáticos com X-ALD parecem estar protegidos contra o estresse oxidativo devido a suas defesas antioxidantes normais, sugerindo que outros fatores além do dano oxidativo possam ser responsáveis pela gravidade dos sintomas na X-ALD; e) lipoperoxidação e oxidação protéica podem estar envolvidas na fisiopatologia das doenças do Espectro Zellweger; f) pode ser presumido que os antioxidantes possam ser usados como uma terapia adjuvante em pacientes afetados por doenças peroxissomais. / Peroxisomal disorders are a group of genetically heterogeneous metabolic diseases that shares peroxissomal dysfunctions. These defects functions are associated with major, and often fatal, changes in human neurological development. Although neurological symptoms and brain abnormalities are characteristic of patients with peroxissomal disorders, very little is known about the pathomechanisms involved in the tissue damage of these disorders. The main objective of the present study was to investigate oxidative stress parameters in patients with peroxissomal disorders like Xlinked adrenoleukodystrophy (X-ALD) and Zellweger spectrum disorders (ZSD). XALD is a peroxisomal disease biochemically characterized by the accumulation of very long chain fatty acids (VLCFA) in different tissues and in biological fluids and clinically characterized by central and peripheral demyelination and adrenal insufficiency. Seven clinical variants have been described, being the childhood cerebral form (CCER), adrenomyeloneuropathy (AMN) and asymptomatic the most common clinical forms. A considerable number of heterozygotes (HTZ) for X-ALD develop neurological symptoms like spinal cord involvement resembling milder forms of AMN. The recommended therapy consists of the use of the glyceroltrioleate/glyceroltrierucate mixture known as Lorenzo's Oil (LO), combined with a VLCFA-poor diet. In the present study we initially evaluated the biochemical course of patients with CCER and asymptomatic clinical forms of X-ALD treated with LO associated with a VLCFArestricted diet. We observed that hexacosanoic acid (C26:0) plasma concentrations and hexacosanoic/docosanoic ratio (C26:0/C22:0) were significantly reduced in CCER and asymptomatic patients during treatment when compared with patients at diagnosis. Only in asymptomatic patients under LO treatment, C26:0 plasma level was achieved the reference values. Also, in the present study, we aimed to determine and compare the lipid oxidative damage (thiobarbituric acid-reactive substances, TBA-RS) and the tissue antioxidant defenses (total antioxidant status, TAS) in plasma from patients with various clinical forms of X-ALD (CCER and AMN and asymptomatic). It was demonstrated that symptomatic and asymptomatic X-ALD patients presented a significant increase of plasma TBA-RS measurement. Furthermore, TBA-RS determination was higher in AMN, as compared to CCER and asymptomatic patients. We also observed that TAS was decreased in symptomatic but not in asymptomatic XALD patients. Subsequently, we aimed to evaluate parameters of oxidative stress in plasma of X-ALD female carriers in order to verify whether oxidative damage occurs in these individuals. It was observed that HTZ for X-ALD presented a significant increase of TBA-RS measurement, as well as a decrease of total antioxidant reactivity (TAR). ZSD are progressive disorders characterized by loss of multiple peroxissomal metabolic functions, neurological symptoms and brain abnormalities. Furthermore, very little is known about the pathomechanisms involved in the tissue damage of these disorders It was observed a significant increase of plasma TBA-RS measurement, as well as a decrease of total thiol content in plasma from patients affected by ZSD. In contrast, TAS measurement was not changed in plasma of ZSD patients, as compared to controls. In summary, our main results show that: a) LO treatment in asymptomatic X-ALD patients shows a good biochemical response and it is important to recommend LO treatment to this group of patients; b) lipid peroxidation seems to occur in symptomatic (CCER and AMN) and asymptomatic (HTZ and asymptomatic) clinical forms of XALD; c) oxidative stress occurs in CCER, AMN and HTZ for X-ALD, probably contributing to the pathophysiology of this clinical forms; d) asymptomatics patients seem to be protected against oxidative stress because of their normal antioxidant defenses, suggesting that other factors besides oxidative damage may be responsible for the severity of the symptoms in X-ALD; e) lipid peroxidation and protein oxidation may be involved in the pathophysiology of the Zellweger spectrum disorders; f) it may be presumed that antioxidant might be used as an adjuvant therapy for patients affected by peroxissomal disorders.

Resumo: OBJETIVO: o padrão-ouro em exames de imagem para avaliar a adrenoleucodistrofia ligada ao X é o escore de Loes, baseado na localização, alterações de sinais e grau de atrofia. Os objetivos deste estudo foram avaliar como os parâmetros do tensor de difusão correlacionam com o escore de Loes e avaliar se poderiam indicar alterações estruturais precoces. PACIENTES E MÉTODOS: as medidas do tensor de difusão foram obtidas em 9 locais pré-estabelecidos da substância branca, bilateralmente, em 30 exames de 14 pacientes com adrenoleucodistrofia ligada ao X. Os escores individuais de fração de anisotropia e difusibilidades média, radial e axial foram obtidos como uma simples soma das 18 medidas e estatisticamente correlacionadas com o escore de Loes correspondente. Um grupo controle de 28 pacientes masculinos foi avaliado para estabelecer escores do tensor de difusão pareados por idade. Análises estatísticas intra e interobservador foram feitas. RESULTADOS: os escores do tensor de difusão apresentam forte correlação com o escore de Loes segundo o coeficiente de Pearson (r), com valores de -0,86; 0,89; 0,89 e 0,84 para escores de fração de anisotropia e difusibilidades média, radial e axial (p < 0,01). A análise estatística intra e interobservador dos escores dos tensores de difusão para pacientes com adrenoleucodistrofia e no grupo controle indicam um método robusto. A análise da mudança nas medidas do tensor de difusão no estágio inicial da doença indica que os valores de difusibilidades média e radial podem ajudar a predizer a progressão da doença. CONCLUSÃO: os escores de parâmetros do tensor de difusão poderiam ser usados como um adjunto ao escore de Loes, auxiliando no monitoramento da doença e alertando uma possível progressão do escore de Loes na faixa de interesse para decisões terapêuticas.

A adrenoleucodistrofia ligada ao X (X-ALD) é a doença peroxissomal mais freqüente, com uma incidência de 1:20.000 homens na população geral, sendo identificada em todos os grupos étnicos. O gene envolvido na X-ALD é o gene ABCD1 (ATP-Binding Cassette transporter subfamily D member 1), que codifica uma proteína de membrana peroxissomal, ALDP. Mutações nesse gene são relacionadas ao acúmulo de ácidos graxos de cadeia muito longa (very long chain fatty acids – VLCFA) em todos os tecidos e fluidos corporais, especialmente no sistema nervoso e glândulas adrenais. Até o momento, mais de 1200 mutações já foram descritas neste gene. Três fenótipos principais são claramente identificados entre homens afetados: a forma cerebral (CALD), caracterizada por resposta inflamatória no SNC, a forma não inflamatória, AMN e a insuficiência adrenal isolada, também chamada de Addison-only. Não há correlação entre o tipo de mutação e o fenótipo clínico e uma possível explicação para essa alta variabilidade fenotípica poderia ser a ação de fatores ambientais e genes modificadores. Nesta tese está descrita, provavelmente, a primeira série de casos de pacientes sul-americanos com X-ALD. Foram avaliados aspectos moleculares da X-ALD em uma série de 38 famílias procedentes desde a Argentina até o Amazonas, relacionando-os com dados epidemiológicos e com a avaliação da taxa de sensibilidade e especificidade da análise de VLCFA em mulheres; e foi realizada a busca por potenciais genes modificadores que atuem, por CNV, na variabilidade fenotípica da X-ALD. Encontraram-se 36 mutações diferentes: apenas uma delas recorreu em 3 famílias. Doze destas mutações foram novas: a sua morbidade foi sustentada principalmente pelos graves rearranjos ou códons de parada prematuros por elas produzidos (p.Pro623Leu, p.Glu577X, p.Tyr33_Pro34fsX34, p.Arg538fs, p.Ala232fsX64, p.Trp137fsX57, p.Leu628Glu, p.Ile481Phe, p.Ala95fsX11, p.Gln55X, p.Arg401Gly e p.Ser358fsX42). Quatro situações (ou 10% da série) foram documentadas como mutações de novo. Como era de se esperar, não foi possível determinar nenhuma correlação entre genótipos e fenótipos. Uma das famílias foi identificada a partir de uma menina com CALD e desvio completo da inativação do X. Através da curva de Kaplan-Meyer, descrevemos a idade média de início das três formas principais nos homens: o início do Addison–only foi em média (IC de 95%) aos 7,4 (5,4-9,4) anos, da CALD, aos 10,9 (9,1-12,7) anos, e da AMN, aos 26,4 (20,3-32,5) anos. Descrevemos também a sobrevida média da CALD como de 24,7 (19,8-29,6) anos. Na presente série, 54 dos 87 afetados (ou 62%) apresentavam o fenótipo CALD, uma taxa maior do que a descrita na literatura (de 45 a 57%). Procuramos alguma evidência que vinculasse esse aparente excesso de formas desmielinizantes com a latitude de origem dos casos, à semelhança da esclerose múltipla: nossos resultados foram negativos. Em um subgrupo de famílias foi possível comparar o status genético final de 50 mulheres (heterozigotas versus normais) decorrente da investigação molecular, com os diagnósticos prévios levantados pela investigação bioquímica dos VLCFA. Encontramos uma elevada taxa de casos VLCFA falso-negativos, de 72,5%, muito maior do que a descrita na literatura (20%) e encontramos também dois casos de mulheres com VLCFA falso-positivos. Concluímos que o uso dos VLCFA deve ser evitado no aconselhamento genético. Finalmente, voltamos aos hemizigotos, em busca de genes candidatos a modificadores de fenótipos, através da associação dos mesmos com específicas variações no número de cópias (copy number variation - CNV) em 29 genes selecionados por seu papel na inflamação, metabolismo dos lipídios ou regeneração do sistema nervoso. A estratégia foi investigar CNVs destes genes através da técnica da Multiple Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) em um grupo de 85 pacientes espanhóis e brasileiros: 39 com AMN e 46 com CALD. Conseguimos identificar CNVs em nove destes genes. Interações potenciais entre estes genes foram inferidas a partir da ferramenta da web Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins (STRING) versão 9. A análise das redes criadas identificou três nódulos principais, com a POMC (Proopiomelanocortina) sendo a proteína central. Nós então sugerimos estes genes e a própria POMC como genes candidatos a modificadores do fenótipo X-ALD. / The X-ALD is the most frequent peroxisomal disease with a pan-ethnic incidence of 1:20,000 males in the general population. The gene involved in X-ALD is the ABCD1, which encodes a protein of the peroxisomal membrane, ALDP. Mutations in this gene are related to the accumulation of VLCFA in all tissues and body fluids, especially in the nervous system and adrenal glands. To date, more than 1200 mutations have been described in the gene. Three phenotypes are clearly identified among affected men: the cerebral form (CALD), characterized by inflammation in the CNS, the non-inflammatory form, adrenomyeloneuropathy (AMN), and Addison-only. There is no genotype-phenotype correlation, in spite of the high phenotypic variability observed in affected relatives. This thesis probably describes the first case series of South American patients with X-ALD. We have evaluated the molecular features of X-ALD, correlating them with epidemiological data in a series of 38 South American families. We have also evaluated the sensitivity and specificity of VLCFA in women, and have searched potential modifier genes that may act by CNV in the male phenotypic variability of X-ALD. We found 36 different mutations, only one recurring in three families. Twelve were new mutations: its morbidity was sustained mainly by major rearrangements or stop codons produced by them (p.Pro623Leu, p.Glu577X, p.Tyr33_Pro34fsX34, p.Arg538fs, p.Ala232fsX64, p.Trp137fsX57, p.Leu628Glu, p.Ile481Phe, p.Ala95fsX11, p.Gln55X, p.Arg401Gly and p.Ser358fsX42). Four (or 10% of the series) were documented as de novo mutations. As was expected, no genotype-phenotype correlation was found. One family was identified from a girl with CALD and complete deviation of X inactivation. By Kaplan-Meyer analysis, we have described the onset of the three main forms in men: the mean (95% CI) age at onset of Addison-only was 7.4 (5.4 - 9.4) years, of CALD, 10.9 (9.1 - 12.7) years, and of AMN, 26.4 (20.3 - 32.5) years. We have also estimated the survival of CALD as 24.7 (19.8 to 29.6) years. In this series, 54 of the 87 affected male (or 62%) had the phenotype CALD, a rate higher than that described in the literature (45-57%). We look for any evidence that relates the apparent excess of demyelinating forms with latitude of origin of cases, like multiple sclerosis: the results were negative. In a subgroup of families, the molecular analyses allowed us to compare the genetic status of 50 women (heterozygous versus normal) with the previous biochemical diagnoses raised up by VLCFA. A high rate of false negative VLCFA was disclosed, of 72.5%, significantly greater than the 20% described in literature. We have also found two false positives VLCFA results in females. We conclude that the use of VLCFA should be avoided in genetic counseling. Finally, we turned to hemizygotes, in search of candidate genes that could modify the X-ALD phenotype, chosen by for their role in inflammation, lipid metabolism or in the regeneration of the nervous system. The strategy was to investigate CNVs of these genes through the technique of Multiple Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) in a group of 85 Spanish and Brazilian patients: 39 with AMN and 46 with CALD. We have identified nine CNVs in these genes. Potential interactions between these genes were inferred from the tool Web Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes / Proteins (STRING) version 9. The analysis of network nodes identified three key created, with POMC (proopiomelanocortin) being the core protein. We then suggested they own and POMC genes as candidate genes modifying the phenotype of X-ALD.

A adrenoleucodistrofia ligada ao X (X-ALD) é a doença peroxissomal mais freqüente, com uma incidência de 1:20.000 homens na população geral, sendo identificada em todos os grupos étnicos. O gene envolvido na X-ALD é o gene ABCD1 (ATP-Binding Cassette transporter subfamily D member 1), que codifica uma proteína de membrana peroxissomal, ALDP. Mutações nesse gene são relacionadas ao acúmulo de ácidos graxos de cadeia muito longa (very long chain fatty acids – VLCFA) em todos os tecidos e fluidos corporais, especialmente no sistema nervoso e glândulas adrenais. Até o momento, mais de 1200 mutações já foram descritas neste gene. Três fenótipos principais são claramente identificados entre homens afetados: a forma cerebral (CALD), caracterizada por resposta inflamatória no SNC, a forma não inflamatória, AMN e a insuficiência adrenal isolada, também chamada de Addison-only. Não há correlação entre o tipo de mutação e o fenótipo clínico e uma possível explicação para essa alta variabilidade fenotípica poderia ser a ação de fatores ambientais e genes modificadores. Nesta tese está descrita, provavelmente, a primeira série de casos de pacientes sul-americanos com X-ALD. Foram avaliados aspectos moleculares da X-ALD em uma série de 38 famílias procedentes desde a Argentina até o Amazonas, relacionando-os com dados epidemiológicos e com a avaliação da taxa de sensibilidade e especificidade da análise de VLCFA em mulheres; e foi realizada a busca por potenciais genes modificadores que atuem, por CNV, na variabilidade fenotípica da X-ALD. Encontraram-se 36 mutações diferentes: apenas uma delas recorreu em 3 famílias. Doze destas mutações foram novas: a sua morbidade foi sustentada principalmente pelos graves rearranjos ou códons de parada prematuros por elas produzidos (p.Pro623Leu, p.Glu577X, p.Tyr33_Pro34fsX34, p.Arg538fs, p.Ala232fsX64, p.Trp137fsX57, p.Leu628Glu, p.Ile481Phe, p.Ala95fsX11, p.Gln55X, p.Arg401Gly e p.Ser358fsX42). Quatro situações (ou 10% da série) foram documentadas como mutações de novo. Como era de se esperar, não foi possível determinar nenhuma correlação entre genótipos e fenótipos. Uma das famílias foi identificada a partir de uma menina com CALD e desvio completo da inativação do X. Através da curva de Kaplan-Meyer, descrevemos a idade média de início das três formas principais nos homens: o início do Addison–only foi em média (IC de 95%) aos 7,4 (5,4-9,4) anos, da CALD, aos 10,9 (9,1-12,7) anos, e da AMN, aos 26,4 (20,3-32,5) anos. Descrevemos também a sobrevida média da CALD como de 24,7 (19,8-29,6) anos. Na presente série, 54 dos 87 afetados (ou 62%) apresentavam o fenótipo CALD, uma taxa maior do que a descrita na literatura (de 45 a 57%). Procuramos alguma evidência que vinculasse esse aparente excesso de formas desmielinizantes com a latitude de origem dos casos, à semelhança da esclerose múltipla: nossos resultados foram negativos. Em um subgrupo de famílias foi possível comparar o status genético final de 50 mulheres (heterozigotas versus normais) decorrente da investigação molecular, com os diagnósticos prévios levantados pela investigação bioquímica dos VLCFA. Encontramos uma elevada taxa de casos VLCFA falso-negativos, de 72,5%, muito maior do que a descrita na literatura (20%) e encontramos também dois casos de mulheres com VLCFA falso-positivos. Concluímos que o uso dos VLCFA deve ser evitado no aconselhamento genético. Finalmente, voltamos aos hemizigotos, em busca de genes candidatos a modificadores de fenótipos, através da associação dos mesmos com específicas variações no número de cópias (copy number variation - CNV) em 29 genes selecionados por seu papel na inflamação, metabolismo dos lipídios ou regeneração do sistema nervoso. A estratégia foi investigar CNVs destes genes através da técnica da Multiple Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) em um grupo de 85 pacientes espanhóis e brasileiros: 39 com AMN e 46 com CALD. Conseguimos identificar CNVs em nove destes genes. Interações potenciais entre estes genes foram inferidas a partir da ferramenta da web Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins (STRING) versão 9. A análise das redes criadas identificou três nódulos principais, com a POMC (Proopiomelanocortina) sendo a proteína central. Nós então sugerimos estes genes e a própria POMC como genes candidatos a modificadores do fenótipo X-ALD. / The X-ALD is the most frequent peroxisomal disease with a pan-ethnic incidence of 1:20,000 males in the general population. The gene involved in X-ALD is the ABCD1, which encodes a protein of the peroxisomal membrane, ALDP. Mutations in this gene are related to the accumulation of VLCFA in all tissues and body fluids, especially in the nervous system and adrenal glands. To date, more than 1200 mutations have been described in the gene. Three phenotypes are clearly identified among affected men: the cerebral form (CALD), characterized by inflammation in the CNS, the non-inflammatory form, adrenomyeloneuropathy (AMN), and Addison-only. There is no genotype-phenotype correlation, in spite of the high phenotypic variability observed in affected relatives. This thesis probably describes the first case series of South American patients with X-ALD. We have evaluated the molecular features of X-ALD, correlating them with epidemiological data in a series of 38 South American families. We have also evaluated the sensitivity and specificity of VLCFA in women, and have searched potential modifier genes that may act by CNV in the male phenotypic variability of X-ALD. We found 36 different mutations, only one recurring in three families. Twelve were new mutations: its morbidity was sustained mainly by major rearrangements or stop codons produced by them (p.Pro623Leu, p.Glu577X, p.Tyr33_Pro34fsX34, p.Arg538fs, p.Ala232fsX64, p.Trp137fsX57, p.Leu628Glu, p.Ile481Phe, p.Ala95fsX11, p.Gln55X, p.Arg401Gly and p.Ser358fsX42). Four (or 10% of the series) were documented as de novo mutations. As was expected, no genotype-phenotype correlation was found. One family was identified from a girl with CALD and complete deviation of X inactivation. By Kaplan-Meyer analysis, we have described the onset of the three main forms in men: the mean (95% CI) age at onset of Addison-only was 7.4 (5.4 - 9.4) years, of CALD, 10.9 (9.1 - 12.7) years, and of AMN, 26.4 (20.3 - 32.5) years. We have also estimated the survival of CALD as 24.7 (19.8 to 29.6) years. In this series, 54 of the 87 affected male (or 62%) had the phenotype CALD, a rate higher than that described in the literature (45-57%). We look for any evidence that relates the apparent excess of demyelinating forms with latitude of origin of cases, like multiple sclerosis: the results were negative. In a subgroup of families, the molecular analyses allowed us to compare the genetic status of 50 women (heterozygous versus normal) with the previous biochemical diagnoses raised up by VLCFA. A high rate of false negative VLCFA was disclosed, of 72.5%, significantly greater than the 20% described in literature. We have also found two false positives VLCFA results in females. We conclude that the use of VLCFA should be avoided in genetic counseling. Finally, we turned to hemizygotes, in search of candidate genes that could modify the X-ALD phenotype, chosen by for their role in inflammation, lipid metabolism or in the regeneration of the nervous system. The strategy was to investigate CNVs of these genes through the technique of Multiple Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) in a group of 85 Spanish and Brazilian patients: 39 with AMN and 46 with CALD. We have identified nine CNVs in these genes. Potential interactions between these genes were inferred from the tool Web Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes / Proteins (STRING) version 9. The analysis of network nodes identified three key created, with POMC (proopiomelanocortin) being the core protein. We then suggested they own and POMC genes as candidate genes modifying the phenotype of X-ALD.

As doenças peroxissomais são um grupo de doenças metabólicas geneticamente heterogêneas que compartilham disfunções peroxissomais. Estas disfunções estão associadas a mudanças fundamentais e até mesmo fatais no desenvolvimento neurológico humano. Embora os sintomas neurológicos e as anormalidades cerebrais sejam características dos pacientes com doenças peroxissomais, muito pouco se sabe sobre os mecanismos envolvidos nos danos teciduais destas enfermidades. O principal objetivo deste estudo foi investigar parâmetros de estresse oxidativo em pacientes com enfermidades peroxissomais, como adrenoleucodistrofia ligada ao X (X-ALD) e Espectro Zellweger (ZSD). X-ALD é uma doença peroxissomal bioquimicamente caracterizada pelo acúmulo de ácidos graxos de cadeia muito longa (VLCFA) em diferentes tecidos e fluidos biológicos e clinicamente caracterizada pela desmielinização central e periférica e pela insuficiência adrenal. Sete tipos de formas clínicas já foram descritas, sendo as mais comuns as formas cerebral infantil (cALD), adrenomieloneuropatia (AMN) e assintomática. Um considerável número de heterozigotas (HTZ) para X-ALD desenvolve sintomas neurológicos como o envolvimento da medula espinhal que se assemelha aos das formas mais amenas de AMN. A terapia recomendada para X-ALD consiste no uso da mistura gliceroltrioleato/glieroltrierucato conhecida como óleo de Lorenzo (OL) combinada a uma dieta pobre em VLCFA. No presente estudo, nós inicialmente avaliamos o curso bioquímico de pacientes com X-ALD com as formas cALD e assintomática tratados com OL e dieta restrita em VLCFA. Observamos que a concentração plasmática do ácido hexacosanóico (C26:0) e a razão entre os ácidos hexacosanóico/docosanóico (C26:0/C22:0) estavam significativamente reduzidas nos plasmas dos pacientes cALD e assintomáticos durante o tratamento quando comparado ao diagnóstico. Somente nos pacientes assintomáticos sob tratamento com OL o nível plasmático de C26:0 atingiu os valores de referência. Também, no presente estudo, objetivamos determinar e comparar o dano oxidativo a lipídios (espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico, TBA-RS) e as defesas antioxidantes teciduais (status antioxidante total, TAS) no plasma de pacientes com diferentes formas clínicas (cALD, AMN e assintomáticos). Foi demonstrado que pacientes sintomáticos e assintomáticos com X-ALD apresentaram um aumento significativo da medida de TBA-RS no plasma. Ainda, a determinação de TBA-RS mostrou-se mais aumentada em AMN quando comparada as formas cALD e assintomática. Também observamos que o TAS estava diminuído em pacientes sintomáticos e não em assintomáticos com X-ALD. Subseqüentemente, buscamos avaliar parâmetros de estresse oxidativo em plasma de HTZ para X-ALD para verificar se o dano oxidativo ocorre nestes indivíduos. Foi observado que HTZ para X-ALD apresentaram um aumento significativo da medida de TBA-RS, bem como uma diminuição da reatividade antioxidante total (TAR). ZSD são doenças progressivas caracterizadas pela perda de múltiplas funções metabólicas peroxissomais, sintomas neurológicos e anormalidades cerebrais. Ainda, muito pouco é sabido sobre os mecanismos envolvidos nos danos teciduais dessas enfermidades. Foi observado um aumento significativo na determinação de TBA-RS, assim como uma diminuição no conteúdo total de tióis em plasma de pacientes afetados por ZSD. Ao contrário, a medida de TAS não se mostrou alterada no plasma de indivíduos com ZSD, comparativamente aos controles. Em suma, nossos principais resultados mostram que: a) tratamento com OL em pacientes assintomáticos com X-ALD mostra uma boa resposta bioquímica e é importante recomendá-lo para este grupo de pacientes; b) lipoperoxidação parece ocorrer em formas clínicas sintomáticas (cALD, AMN) e assintomáticas (HTZ e assintomáticos) de X-ALD; c) estresse oxidativo ocorre em cALD, AMN e HTZ para X-ALD, provavelmente contribuindo para a fisiopatologia destas formas clínicas; d) pacientes assintomáticos com X-ALD parecem estar protegidos contra o estresse oxidativo devido a suas defesas antioxidantes normais, sugerindo que outros fatores além do dano oxidativo possam ser responsáveis pela gravidade dos sintomas na X-ALD; e) lipoperoxidação e oxidação protéica podem estar envolvidas na fisiopatologia das doenças do Espectro Zellweger; f) pode ser presumido que os antioxidantes possam ser usados como uma terapia adjuvante em pacientes afetados por doenças peroxissomais. / Peroxisomal disorders are a group of genetically heterogeneous metabolic diseases that shares peroxissomal dysfunctions. These defects functions are associated with major, and often fatal, changes in human neurological development. Although neurological symptoms and brain abnormalities are characteristic of patients with peroxissomal disorders, very little is known about the pathomechanisms involved in the tissue damage of these disorders. The main objective of the present study was to investigate oxidative stress parameters in patients with peroxissomal disorders like Xlinked adrenoleukodystrophy (X-ALD) and Zellweger spectrum disorders (ZSD). XALD is a peroxisomal disease biochemically characterized by the accumulation of very long chain fatty acids (VLCFA) in different tissues and in biological fluids and clinically characterized by central and peripheral demyelination and adrenal insufficiency. Seven clinical variants have been described, being the childhood cerebral form (CCER), adrenomyeloneuropathy (AMN) and asymptomatic the most common clinical forms. A considerable number of heterozygotes (HTZ) for X-ALD develop neurological symptoms like spinal cord involvement resembling milder forms of AMN. The recommended therapy consists of the use of the glyceroltrioleate/glyceroltrierucate mixture known as Lorenzo's Oil (LO), combined with a VLCFA-poor diet. In the present study we initially evaluated the biochemical course of patients with CCER and asymptomatic clinical forms of X-ALD treated with LO associated with a VLCFArestricted diet. We observed that hexacosanoic acid (C26:0) plasma concentrations and hexacosanoic/docosanoic ratio (C26:0/C22:0) were significantly reduced in CCER and asymptomatic patients during treatment when compared with patients at diagnosis. Only in asymptomatic patients under LO treatment, C26:0 plasma level was achieved the reference values. Also, in the present study, we aimed to determine and compare the lipid oxidative damage (thiobarbituric acid-reactive substances, TBA-RS) and the tissue antioxidant defenses (total antioxidant status, TAS) in plasma from patients with various clinical forms of X-ALD (CCER and AMN and asymptomatic). It was demonstrated that symptomatic and asymptomatic X-ALD patients presented a significant increase of plasma TBA-RS measurement. Furthermore, TBA-RS determination was higher in AMN, as compared to CCER and asymptomatic patients. We also observed that TAS was decreased in symptomatic but not in asymptomatic XALD patients. Subsequently, we aimed to evaluate parameters of oxidative stress in plasma of X-ALD female carriers in order to verify whether oxidative damage occurs in these individuals. It was observed that HTZ for X-ALD presented a significant increase of TBA-RS measurement, as well as a decrease of total antioxidant reactivity (TAR). ZSD are progressive disorders characterized by loss of multiple peroxissomal metabolic functions, neurological symptoms and brain abnormalities. Furthermore, very little is known about the pathomechanisms involved in the tissue damage of these disorders It was observed a significant increase of plasma TBA-RS measurement, as well as a decrease of total thiol content in plasma from patients affected by ZSD. In contrast, TAS measurement was not changed in plasma of ZSD patients, as compared to controls. In summary, our main results show that: a) LO treatment in asymptomatic X-ALD patients shows a good biochemical response and it is important to recommend LO treatment to this group of patients; b) lipid peroxidation seems to occur in symptomatic (CCER and AMN) and asymptomatic (HTZ and asymptomatic) clinical forms of XALD; c) oxidative stress occurs in CCER, AMN and HTZ for X-ALD, probably contributing to the pathophysiology of this clinical forms; d) asymptomatics patients seem to be protected against oxidative stress because of their normal antioxidant defenses, suggesting that other factors besides oxidative damage may be responsible for the severity of the symptoms in X-ALD; e) lipid peroxidation and protein oxidation may be involved in the pathophysiology of the Zellweger spectrum disorders; f) it may be presumed that antioxidant might be used as an adjuvant therapy for patients affected by peroxissomal disorders.