A adrenoleucodistrofia ligada ao X (X-ALD) é a doença peroxissomal mais freqüente, com uma incidência de 1:20.000 homens na população geral, sendo identificada em todos os grupos étnicos. O gene envolvido na X-ALD é o gene ABCD1 (ATP-Binding Cassette transporter subfamily D member 1), que codifica uma proteína de membrana peroxissomal, ALDP. Mutações nesse gene são relacionadas ao acúmulo de ácidos graxos de cadeia muito longa (very long chain fatty acids – VLCFA) em todos os tecidos e fluidos corporais, especialmente no sistema nervoso e glândulas adrenais. Até o momento, mais de 1200 mutações já foram descritas neste gene. Três fenótipos principais são claramente identificados entre homens afetados: a forma cerebral (CALD), caracterizada por resposta inflamatória no SNC, a forma não inflamatória, AMN e a insuficiência adrenal isolada, também chamada de Addison-only. Não há correlação entre o tipo de mutação e o fenótipo clínico e uma possível explicação para essa alta variabilidade fenotípica poderia ser a ação de fatores ambientais e genes modificadores. Nesta tese está descrita, provavelmente, a primeira série de casos de pacientes sul-americanos com X-ALD. Foram avaliados aspectos moleculares da X-ALD em uma série de 38 famílias procedentes desde a Argentina até o Amazonas, relacionando-os com dados epidemiológicos e com a avaliação da taxa de sensibilidade e especificidade da análise de VLCFA em mulheres; e foi realizada a busca por potenciais genes modificadores que atuem, por CNV, na variabilidade fenotípica da X-ALD. Encontraram-se 36 mutações diferentes: apenas uma delas recorreu em 3 famílias. Doze destas mutações foram novas: a sua morbidade foi sustentada principalmente pelos graves rearranjos ou códons de parada prematuros por elas produzidos (p.Pro623Leu, p.Glu577X, p.Tyr33_Pro34fsX34, p.Arg538fs, p.Ala232fsX64, p.Trp137fsX57, p.Leu628Glu, p.Ile481Phe, p.Ala95fsX11, p.Gln55X, p.Arg401Gly e p.Ser358fsX42). Quatro situações (ou 10% da série) foram documentadas como mutações de novo. Como era de se esperar, não foi possível determinar nenhuma correlação entre genótipos e fenótipos. Uma das famílias foi identificada a partir de uma menina com CALD e desvio completo da inativação do X. Através da curva de Kaplan-Meyer, descrevemos a idade média de início das três formas principais nos homens: o início do Addison–only foi em média (IC de 95%) aos 7,4 (5,4-9,4) anos, da CALD, aos 10,9 (9,1-12,7) anos, e da AMN, aos 26,4 (20,3-32,5) anos. Descrevemos também a sobrevida média da CALD como de 24,7 (19,8-29,6) anos. Na presente série, 54 dos 87 afetados (ou 62%) apresentavam o fenótipo CALD, uma taxa maior do que a descrita na literatura (de 45 a 57%). Procuramos alguma evidência que vinculasse esse aparente excesso de formas desmielinizantes com a latitude de origem dos casos, à semelhança da esclerose múltipla: nossos resultados foram negativos. Em um subgrupo de famílias foi possível comparar o status genético final de 50 mulheres (heterozigotas versus normais) decorrente da investigação molecular, com os diagnósticos prévios levantados pela investigação bioquímica dos VLCFA. Encontramos uma elevada taxa de casos VLCFA falso-negativos, de 72,5%, muito maior do que a descrita na literatura (20%) e encontramos também dois casos de mulheres com VLCFA falso-positivos. Concluímos que o uso dos VLCFA deve ser evitado no aconselhamento genético. Finalmente, voltamos aos hemizigotos, em busca de genes candidatos a modificadores de fenótipos, através da associação dos mesmos com específicas variações no número de cópias (copy number variation - CNV) em 29 genes selecionados por seu papel na inflamação, metabolismo dos lipídios ou regeneração do sistema nervoso. A estratégia foi investigar CNVs destes genes através da técnica da Multiple Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) em um grupo de 85 pacientes espanhóis e brasileiros: 39 com AMN e 46 com CALD. Conseguimos identificar CNVs em nove destes genes. Interações potenciais entre estes genes foram inferidas a partir da ferramenta da web Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins (STRING) versão 9. A análise das redes criadas identificou três nódulos principais, com a POMC (Proopiomelanocortina) sendo a proteína central. Nós então sugerimos estes genes e a própria POMC como genes candidatos a modificadores do fenótipo X-ALD. / The X-ALD is the most frequent peroxisomal disease with a pan-ethnic incidence of 1:20,000 males in the general population. The gene involved in X-ALD is the ABCD1, which encodes a protein of the peroxisomal membrane, ALDP. Mutations in this gene are related to the accumulation of VLCFA in all tissues and body fluids, especially in the nervous system and adrenal glands. To date, more than 1200 mutations have been described in the gene. Three phenotypes are clearly identified among affected men: the cerebral form (CALD), characterized by inflammation in the CNS, the non-inflammatory form, adrenomyeloneuropathy (AMN), and Addison-only. There is no genotype-phenotype correlation, in spite of the high phenotypic variability observed in affected relatives. This thesis probably describes the first case series of South American patients with X-ALD. We have evaluated the molecular features of X-ALD, correlating them with epidemiological data in a series of 38 South American families. We have also evaluated the sensitivity and specificity of VLCFA in women, and have searched potential modifier genes that may act by CNV in the male phenotypic variability of X-ALD. We found 36 different mutations, only one recurring in three families. Twelve were new mutations: its morbidity was sustained mainly by major rearrangements or stop codons produced by them (p.Pro623Leu, p.Glu577X, p.Tyr33_Pro34fsX34, p.Arg538fs, p.Ala232fsX64, p.Trp137fsX57, p.Leu628Glu, p.Ile481Phe, p.Ala95fsX11, p.Gln55X, p.Arg401Gly and p.Ser358fsX42). Four (or 10% of the series) were documented as de novo mutations. As was expected, no genotype-phenotype correlation was found. One family was identified from a girl with CALD and complete deviation of X inactivation. By Kaplan-Meyer analysis, we have described the onset of the three main forms in men: the mean (95% CI) age at onset of Addison-only was 7.4 (5.4 - 9.4) years, of CALD, 10.9 (9.1 - 12.7) years, and of AMN, 26.4 (20.3 - 32.5) years. We have also estimated the survival of CALD as 24.7 (19.8 to 29.6) years. In this series, 54 of the 87 affected male (or 62%) had the phenotype CALD, a rate higher than that described in the literature (45-57%). We look for any evidence that relates the apparent excess of demyelinating forms with latitude of origin of cases, like multiple sclerosis: the results were negative. In a subgroup of families, the molecular analyses allowed us to compare the genetic status of 50 women (heterozygous versus normal) with the previous biochemical diagnoses raised up by VLCFA. A high rate of false negative VLCFA was disclosed, of 72.5%, significantly greater than the 20% described in literature. We have also found two false positives VLCFA results in females. We conclude that the use of VLCFA should be avoided in genetic counseling. Finally, we turned to hemizygotes, in search of candidate genes that could modify the X-ALD phenotype, chosen by for their role in inflammation, lipid metabolism or in the regeneration of the nervous system. The strategy was to investigate CNVs of these genes through the technique of Multiple Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) in a group of 85 Spanish and Brazilian patients: 39 with AMN and 46 with CALD. We have identified nine CNVs in these genes. Potential interactions between these genes were inferred from the tool Web Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes / Proteins (STRING) version 9. The analysis of network nodes identified three key created, with POMC (proopiomelanocortin) being the core protein. We then suggested they own and POMC genes as candidate genes modifying the phenotype of X-ALD.

A adrenoleucodistrofia ligada ao X (X-ALD) é a doença peroxissomal mais freqüente, com uma incidência de 1:20.000 homens na população geral, sendo identificada em todos os grupos étnicos. O gene envolvido na X-ALD é o gene ABCD1 (ATP-Binding Cassette transporter subfamily D member 1), que codifica uma proteína de membrana peroxissomal, ALDP. Mutações nesse gene são relacionadas ao acúmulo de ácidos graxos de cadeia muito longa (very long chain fatty acids – VLCFA) em todos os tecidos e fluidos corporais, especialmente no sistema nervoso e glândulas adrenais. Até o momento, mais de 1200 mutações já foram descritas neste gene. Três fenótipos principais são claramente identificados entre homens afetados: a forma cerebral (CALD), caracterizada por resposta inflamatória no SNC, a forma não inflamatória, AMN e a insuficiência adrenal isolada, também chamada de Addison-only. Não há correlação entre o tipo de mutação e o fenótipo clínico e uma possível explicação para essa alta variabilidade fenotípica poderia ser a ação de fatores ambientais e genes modificadores. Nesta tese está descrita, provavelmente, a primeira série de casos de pacientes sul-americanos com X-ALD. Foram avaliados aspectos moleculares da X-ALD em uma série de 38 famílias procedentes desde a Argentina até o Amazonas, relacionando-os com dados epidemiológicos e com a avaliação da taxa de sensibilidade e especificidade da análise de VLCFA em mulheres; e foi realizada a busca por potenciais genes modificadores que atuem, por CNV, na variabilidade fenotípica da X-ALD. Encontraram-se 36 mutações diferentes: apenas uma delas recorreu em 3 famílias. Doze destas mutações foram novas: a sua morbidade foi sustentada principalmente pelos graves rearranjos ou códons de parada prematuros por elas produzidos (p.Pro623Leu, p.Glu577X, p.Tyr33_Pro34fsX34, p.Arg538fs, p.Ala232fsX64, p.Trp137fsX57, p.Leu628Glu, p.Ile481Phe, p.Ala95fsX11, p.Gln55X, p.Arg401Gly e p.Ser358fsX42). Quatro situações (ou 10% da série) foram documentadas como mutações de novo. Como era de se esperar, não foi possível determinar nenhuma correlação entre genótipos e fenótipos. Uma das famílias foi identificada a partir de uma menina com CALD e desvio completo da inativação do X. Através da curva de Kaplan-Meyer, descrevemos a idade média de início das três formas principais nos homens: o início do Addison–only foi em média (IC de 95%) aos 7,4 (5,4-9,4) anos, da CALD, aos 10,9 (9,1-12,7) anos, e da AMN, aos 26,4 (20,3-32,5) anos. Descrevemos também a sobrevida média da CALD como de 24,7 (19,8-29,6) anos. Na presente série, 54 dos 87 afetados (ou 62%) apresentavam o fenótipo CALD, uma taxa maior do que a descrita na literatura (de 45 a 57%). Procuramos alguma evidência que vinculasse esse aparente excesso de formas desmielinizantes com a latitude de origem dos casos, à semelhança da esclerose múltipla: nossos resultados foram negativos. Em um subgrupo de famílias foi possível comparar o status genético final de 50 mulheres (heterozigotas versus normais) decorrente da investigação molecular, com os diagnósticos prévios levantados pela investigação bioquímica dos VLCFA. Encontramos uma elevada taxa de casos VLCFA falso-negativos, de 72,5%, muito maior do que a descrita na literatura (20%) e encontramos também dois casos de mulheres com VLCFA falso-positivos. Concluímos que o uso dos VLCFA deve ser evitado no aconselhamento genético. Finalmente, voltamos aos hemizigotos, em busca de genes candidatos a modificadores de fenótipos, através da associação dos mesmos com específicas variações no número de cópias (copy number variation - CNV) em 29 genes selecionados por seu papel na inflamação, metabolismo dos lipídios ou regeneração do sistema nervoso. A estratégia foi investigar CNVs destes genes através da técnica da Multiple Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) em um grupo de 85 pacientes espanhóis e brasileiros: 39 com AMN e 46 com CALD. Conseguimos identificar CNVs em nove destes genes. Interações potenciais entre estes genes foram inferidas a partir da ferramenta da web Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins (STRING) versão 9. A análise das redes criadas identificou três nódulos principais, com a POMC (Proopiomelanocortina) sendo a proteína central. Nós então sugerimos estes genes e a própria POMC como genes candidatos a modificadores do fenótipo X-ALD. / The X-ALD is the most frequent peroxisomal disease with a pan-ethnic incidence of 1:20,000 males in the general population. The gene involved in X-ALD is the ABCD1, which encodes a protein of the peroxisomal membrane, ALDP. Mutations in this gene are related to the accumulation of VLCFA in all tissues and body fluids, especially in the nervous system and adrenal glands. To date, more than 1200 mutations have been described in the gene. Three phenotypes are clearly identified among affected men: the cerebral form (CALD), characterized by inflammation in the CNS, the non-inflammatory form, adrenomyeloneuropathy (AMN), and Addison-only. There is no genotype-phenotype correlation, in spite of the high phenotypic variability observed in affected relatives. This thesis probably describes the first case series of South American patients with X-ALD. We have evaluated the molecular features of X-ALD, correlating them with epidemiological data in a series of 38 South American families. We have also evaluated the sensitivity and specificity of VLCFA in women, and have searched potential modifier genes that may act by CNV in the male phenotypic variability of X-ALD. We found 36 different mutations, only one recurring in three families. Twelve were new mutations: its morbidity was sustained mainly by major rearrangements or stop codons produced by them (p.Pro623Leu, p.Glu577X, p.Tyr33_Pro34fsX34, p.Arg538fs, p.Ala232fsX64, p.Trp137fsX57, p.Leu628Glu, p.Ile481Phe, p.Ala95fsX11, p.Gln55X, p.Arg401Gly and p.Ser358fsX42). Four (or 10% of the series) were documented as de novo mutations. As was expected, no genotype-phenotype correlation was found. One family was identified from a girl with CALD and complete deviation of X inactivation. By Kaplan-Meyer analysis, we have described the onset of the three main forms in men: the mean (95% CI) age at onset of Addison-only was 7.4 (5.4 - 9.4) years, of CALD, 10.9 (9.1 - 12.7) years, and of AMN, 26.4 (20.3 - 32.5) years. We have also estimated the survival of CALD as 24.7 (19.8 to 29.6) years. In this series, 54 of the 87 affected male (or 62%) had the phenotype CALD, a rate higher than that described in the literature (45-57%). We look for any evidence that relates the apparent excess of demyelinating forms with latitude of origin of cases, like multiple sclerosis: the results were negative. In a subgroup of families, the molecular analyses allowed us to compare the genetic status of 50 women (heterozygous versus normal) with the previous biochemical diagnoses raised up by VLCFA. A high rate of false negative VLCFA was disclosed, of 72.5%, significantly greater than the 20% described in literature. We have also found two false positives VLCFA results in females. We conclude that the use of VLCFA should be avoided in genetic counseling. Finally, we turned to hemizygotes, in search of candidate genes that could modify the X-ALD phenotype, chosen by for their role in inflammation, lipid metabolism or in the regeneration of the nervous system. The strategy was to investigate CNVs of these genes through the technique of Multiple Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) in a group of 85 Spanish and Brazilian patients: 39 with AMN and 46 with CALD. We have identified nine CNVs in these genes. Potential interactions between these genes were inferred from the tool Web Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes / Proteins (STRING) version 9. The analysis of network nodes identified three key created, with POMC (proopiomelanocortin) being the core protein. We then suggested they own and POMC genes as candidate genes modifying the phenotype of X-ALD.

A adrenoleucodistrofia ligada ao X (X-ALD) é a doença peroxissomal mais freqüente, com uma incidência de 1:20.000 homens na população geral, sendo identificada em todos os grupos étnicos. O gene envolvido na X-ALD é o gene ABCD1 (ATP-Binding Cassette transporter subfamily D member 1), que codifica uma proteína de membrana peroxissomal, ALDP. Mutações nesse gene são relacionadas ao acúmulo de ácidos graxos de cadeia muito longa (very long chain fatty acids – VLCFA) em todos os tecidos e fluidos corporais, especialmente no sistema nervoso e glândulas adrenais. Até o momento, mais de 1200 mutações já foram descritas neste gene. Três fenótipos principais são claramente identificados entre homens afetados: a forma cerebral (CALD), caracterizada por resposta inflamatória no SNC, a forma não inflamatória, AMN e a insuficiência adrenal isolada, também chamada de Addison-only. Não há correlação entre o tipo de mutação e o fenótipo clínico e uma possível explicação para essa alta variabilidade fenotípica poderia ser a ação de fatores ambientais e genes modificadores. Nesta tese está descrita, provavelmente, a primeira série de casos de pacientes sul-americanos com X-ALD. Foram avaliados aspectos moleculares da X-ALD em uma série de 38 famílias procedentes desde a Argentina até o Amazonas, relacionando-os com dados epidemiológicos e com a avaliação da taxa de sensibilidade e especificidade da análise de VLCFA em mulheres; e foi realizada a busca por potenciais genes modificadores que atuem, por CNV, na variabilidade fenotípica da X-ALD. Encontraram-se 36 mutações diferentes: apenas uma delas recorreu em 3 famílias. Doze destas mutações foram novas: a sua morbidade foi sustentada principalmente pelos graves rearranjos ou códons de parada prematuros por elas produzidos (p.Pro623Leu, p.Glu577X, p.Tyr33_Pro34fsX34, p.Arg538fs, p.Ala232fsX64, p.Trp137fsX57, p.Leu628Glu, p.Ile481Phe, p.Ala95fsX11, p.Gln55X, p.Arg401Gly e p.Ser358fsX42). Quatro situações (ou 10% da série) foram documentadas como mutações de novo. Como era de se esperar, não foi possível determinar nenhuma correlação entre genótipos e fenótipos. Uma das famílias foi identificada a partir de uma menina com CALD e desvio completo da inativação do X. Através da curva de Kaplan-Meyer, descrevemos a idade média de início das três formas principais nos homens: o início do Addison–only foi em média (IC de 95%) aos 7,4 (5,4-9,4) anos, da CALD, aos 10,9 (9,1-12,7) anos, e da AMN, aos 26,4 (20,3-32,5) anos. Descrevemos também a sobrevida média da CALD como de 24,7 (19,8-29,6) anos. Na presente série, 54 dos 87 afetados (ou 62%) apresentavam o fenótipo CALD, uma taxa maior do que a descrita na literatura (de 45 a 57%). Procuramos alguma evidência que vinculasse esse aparente excesso de formas desmielinizantes com a latitude de origem dos casos, à semelhança da esclerose múltipla: nossos resultados foram negativos. Em um subgrupo de famílias foi possível comparar o status genético final de 50 mulheres (heterozigotas versus normais) decorrente da investigação molecular, com os diagnósticos prévios levantados pela investigação bioquímica dos VLCFA. Encontramos uma elevada taxa de casos VLCFA falso-negativos, de 72,5%, muito maior do que a descrita na literatura (20%) e encontramos também dois casos de mulheres com VLCFA falso-positivos. Concluímos que o uso dos VLCFA deve ser evitado no aconselhamento genético. Finalmente, voltamos aos hemizigotos, em busca de genes candidatos a modificadores de fenótipos, através da associação dos mesmos com específicas variações no número de cópias (copy number variation - CNV) em 29 genes selecionados por seu papel na inflamação, metabolismo dos lipídios ou regeneração do sistema nervoso. A estratégia foi investigar CNVs destes genes através da técnica da Multiple Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) em um grupo de 85 pacientes espanhóis e brasileiros: 39 com AMN e 46 com CALD. Conseguimos identificar CNVs em nove destes genes. Interações potenciais entre estes genes foram inferidas a partir da ferramenta da web Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins (STRING) versão 9. A análise das redes criadas identificou três nódulos principais, com a POMC (Proopiomelanocortina) sendo a proteína central. Nós então sugerimos estes genes e a própria POMC como genes candidatos a modificadores do fenótipo X-ALD. / The X-ALD is the most frequent peroxisomal disease with a pan-ethnic incidence of 1:20,000 males in the general population. The gene involved in X-ALD is the ABCD1, which encodes a protein of the peroxisomal membrane, ALDP. Mutations in this gene are related to the accumulation of VLCFA in all tissues and body fluids, especially in the nervous system and adrenal glands. To date, more than 1200 mutations have been described in the gene. Three phenotypes are clearly identified among affected men: the cerebral form (CALD), characterized by inflammation in the CNS, the non-inflammatory form, adrenomyeloneuropathy (AMN), and Addison-only. There is no genotype-phenotype correlation, in spite of the high phenotypic variability observed in affected relatives. This thesis probably describes the first case series of South American patients with X-ALD. We have evaluated the molecular features of X-ALD, correlating them with epidemiological data in a series of 38 South American families. We have also evaluated the sensitivity and specificity of VLCFA in women, and have searched potential modifier genes that may act by CNV in the male phenotypic variability of X-ALD. We found 36 different mutations, only one recurring in three families. Twelve were new mutations: its morbidity was sustained mainly by major rearrangements or stop codons produced by them (p.Pro623Leu, p.Glu577X, p.Tyr33_Pro34fsX34, p.Arg538fs, p.Ala232fsX64, p.Trp137fsX57, p.Leu628Glu, p.Ile481Phe, p.Ala95fsX11, p.Gln55X, p.Arg401Gly and p.Ser358fsX42). Four (or 10% of the series) were documented as de novo mutations. As was expected, no genotype-phenotype correlation was found. One family was identified from a girl with CALD and complete deviation of X inactivation. By Kaplan-Meyer analysis, we have described the onset of the three main forms in men: the mean (95% CI) age at onset of Addison-only was 7.4 (5.4 - 9.4) years, of CALD, 10.9 (9.1 - 12.7) years, and of AMN, 26.4 (20.3 - 32.5) years. We have also estimated the survival of CALD as 24.7 (19.8 to 29.6) years. In this series, 54 of the 87 affected male (or 62%) had the phenotype CALD, a rate higher than that described in the literature (45-57%). We look for any evidence that relates the apparent excess of demyelinating forms with latitude of origin of cases, like multiple sclerosis: the results were negative. In a subgroup of families, the molecular analyses allowed us to compare the genetic status of 50 women (heterozygous versus normal) with the previous biochemical diagnoses raised up by VLCFA. A high rate of false negative VLCFA was disclosed, of 72.5%, significantly greater than the 20% described in literature. We have also found two false positives VLCFA results in females. We conclude that the use of VLCFA should be avoided in genetic counseling. Finally, we turned to hemizygotes, in search of candidate genes that could modify the X-ALD phenotype, chosen by for their role in inflammation, lipid metabolism or in the regeneration of the nervous system. The strategy was to investigate CNVs of these genes through the technique of Multiple Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) in a group of 85 Spanish and Brazilian patients: 39 with AMN and 46 with CALD. We have identified nine CNVs in these genes. Potential interactions between these genes were inferred from the tool Web Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes / Proteins (STRING) version 9. The analysis of network nodes identified three key created, with POMC (proopiomelanocortin) being the core protein. We then suggested they own and POMC genes as candidate genes modifying the phenotype of X-ALD.

A Síndrome de Marfan (SMF) (OMIM# 154700) é a mais comum das doenças genéticas do tecido conjuntivo Herdada de forma autossômica dominante, ela apresenta incidência de 1 em cada 5.000 indivíduos. Apesar de apresentar grande variabilidade clínica inter e intrafamiliar, o fenótipo da SMF possui penetrância completa, e suas manifestações clínicas afetam primariamente os sistemas esquelético, ocular e cardiovascular. Afim de estudar os mecanismos patogênicos da SMF foi desenvolvido um modelo murino, mgΔneoLoxP, que reproduz as manifestações ósseas, cardiovasculares e pulmonares da síndrome. O modelo foi estabelecido nas linhagens isogênicas 129/Sv e C57BL/6, que apresentam diferenças tanto quanto a idade de acometimento quanto a gravidade das alterações, é possível que as diferenças alélicas existentes entre essas linhagens alterem a manifestação fenotípica, ou seja, que existam genes modificadores para a SMF. Assim, objetivo deste projeto é utilizar este modelo experimental para identificar genes modificadores do fenótipo da SMF e tentar entender melhor a arquitetura genética da síndrome. Ao todo foram gerados 82 animais 129xB6 F2 heterozigotos para o alelo mgΔneoLoxP, a analise de ligação utilizando microssatélites e SNPs nos animais com fenótipos mais extremos mostraram ligação sugestiva do fenótipo ósseo com as regiões compreendidas entre as posições 56 cM e 68 cM do cromossomo 3; e 2 cM e 20 cM do cromossomo X; ligação significativa entre as posições 41cM e 49 cM do cromossomo 6; além de mostrar ligação sugestiva do fenótipo cardiovascular do 66 cM ao 70 cM do cromossomo 4; e do 44 cM ao 52 cM do cromossomo 13. Além da variabilidade entre linhagens, os animais 129 apresentam uma grande variabilidade fenotípica interna, o que por se tratar de animais isogênicos causada por fatores aleatórios ou devido a modificações epigenéticas que alterem o nível de expressão de alguns genes e assim o fenótipo. A comparação entre animais 129 leves e graves levou a identificação de 25 genes diferencialmente expressos dos quais 11 apresentavam funções relevantes para a SMF, entretanto foram aferidos os níveis de expressão de 2 destes que não validaram os resultados obtidos devido a uma grande variação observada entre os animais de todos as classes fenotípicas. Também foram identificadas 46 vias que se apresentavam mais frequentes nos conjuntos de genes obtidos entre as duas classes fenotípica de animais heterozigotos contra os animais selvagens. Tanto as vias, quanto os genes identificados através de ligação quanto diferença de expressão mostram uma convergência para as funções dos genes de interesse, sendo que entre eles existem genes já associados com a SMF, controle de ativação de TGF-B e da biogênese das microfibras da matriz extracelular, quanto genes que ainda não foram associados mas são possíveis modificadores do fenótipo, tais como genes envolvidos nos processos de enovelamento e degradação protéico e nos processos de endocitose e exocitose de vesículas, que podem alterar a quantidade de fibrilina-1 truncada disponível e assim o fenótipo / The Marfan syndrome (MFS) (OMIM # 154700) is the most common genetic disorder of the connective tissue and is inherited in a autosomal dominant fashion, it has an incidence of 1 in 5,000 individuals. Despite a great clinical variability being one of the \"trademarks\" of the syndrome, the phenotype of the MFS has complete penetrance and its clinical manifestations primarily affect the skeletal, ocular and cardiovascular systems. In order to study the pathogenic mechanisms of MFS was developed a mouse model, named mgΔneoLoxP, which reproduces the skeletal, cardiovascular and pulmonary manifestations of the syndrome. The model was established in inbred mouse strains 129/Sv and C57BL / 6, which phenotypes differ as to age of onset and severity of manifestation. It is possible that allelic differences between these inbred strains alter the phenotyic manifestation of disease, leading to the conclusion that may exist modifier genes involved in the for MFS. This study inteds to use this experimental model to identify phenotype modifier genes of MFS so a better understand the genetic architecture of the syndrome. Altogether, 82 129xB6 F2 heterozygous animals were generated so that a linkage analysis using microsatellite and SNP could be conducted. The linkage analysis using a selective genotyping procedure showed a suggestive linkage of the skeletal phenotype with regions included between positions 56 cM and 68 cM on chromosome 3, and 2 cM and 20 cM on chromosome X; and a significant linkage between positions 41cM and 49 cM on chromosome 6; also showing suggestive linkage of the cardiovascular phenotype from 66 cM to 70 cM on chromosome 4, and 44 cM to 52 cM on chromosome 13. Besides the variability between strains, 129 animals have a wide inner strain phenotypic variability, which in the case of isogenic animals should be caused by random factors or due to epigenetic modifications that may alter the expression level some genes and thus the phenotype. The comparison between animals of the 129 strain with mild and severe alterations led to the identification of 25 differentially expressed genes of which 11 showed relevant functions to the MFS, however it was only possible to measure the expression levels of two genes using real-time PCR, although those did not validate the results obtained from the expression microarray due to a large expression variation in all phenotypic classes. It was also identified 46 pathways that were more frequent in the gene lists obtained from the comparison between the two phenotypic classes of heterozygous animals against 129 wildtype animals. There is a similarity in the function of genes or pathways of interest found in pathways analysis and genes identified, either by differential expression or linkage analisys, and among them there genes already associated with the MFS, such as in the control activity of TGF-B and biogenesis of microfibers in the extracellular matrix, as also genes that were not associated with MFS but are possible phenotype modifier genes, such as genes involved in protein folding and degradation processes and of endocytosis and exocytosis processes of vesicle, which can change the amount of truncated fibrillin-1 available and thus the phenotype

A Síndrome de Marfan (SMF) (OMIM# 154700) é a mais comum das doenças genéticas do tecido conjuntivo Herdada de forma autossômica dominante, ela apresenta incidência de 1 em cada 5.000 indivíduos. Apesar de apresentar grande variabilidade clínica inter e intrafamiliar, o fenótipo da SMF possui penetrância completa, e suas manifestações clínicas afetam primariamente os sistemas esquelético, ocular e cardiovascular. Afim de estudar os mecanismos patogênicos da SMF foi desenvolvido um modelo murino, mgΔneoLoxP, que reproduz as manifestações ósseas, cardiovasculares e pulmonares da síndrome. O modelo foi estabelecido nas linhagens isogênicas 129/Sv e C57BL/6, que apresentam diferenças tanto quanto a idade de acometimento quanto a gravidade das alterações, é possível que as diferenças alélicas existentes entre essas linhagens alterem a manifestação fenotípica, ou seja, que existam genes modificadores para a SMF. Assim, objetivo deste projeto é utilizar este modelo experimental para identificar genes modificadores do fenótipo da SMF e tentar entender melhor a arquitetura genética da síndrome. Ao todo foram gerados 82 animais 129xB6 F2 heterozigotos para o alelo mgΔneoLoxP, a analise de ligação utilizando microssatélites e SNPs nos animais com fenótipos mais extremos mostraram ligação sugestiva do fenótipo ósseo com as regiões compreendidas entre as posições 56 cM e 68 cM do cromossomo 3; e 2 cM e 20 cM do cromossomo X; ligação significativa entre as posições 41cM e 49 cM do cromossomo 6; além de mostrar ligação sugestiva do fenótipo cardiovascular do 66 cM ao 70 cM do cromossomo 4; e do 44 cM ao 52 cM do cromossomo 13. Além da variabilidade entre linhagens, os animais 129 apresentam uma grande variabilidade fenotípica interna, o que por se tratar de animais isogênicos causada por fatores aleatórios ou devido a modificações epigenéticas que alterem o nível de expressão de alguns genes e assim o fenótipo. A comparação entre animais 129 leves e graves levou a identificação de 25 genes diferencialmente expressos dos quais 11 apresentavam funções relevantes para a SMF, entretanto foram aferidos os níveis de expressão de 2 destes que não validaram os resultados obtidos devido a uma grande variação observada entre os animais de todos as classes fenotípicas. Também foram identificadas 46 vias que se apresentavam mais frequentes nos conjuntos de genes obtidos entre as duas classes fenotípica de animais heterozigotos contra os animais selvagens. Tanto as vias, quanto os genes identificados através de ligação quanto diferença de expressão mostram uma convergência para as funções dos genes de interesse, sendo que entre eles existem genes já associados com a SMF, controle de ativação de TGF-B e da biogênese das microfibras da matriz extracelular, quanto genes que ainda não foram associados mas são possíveis modificadores do fenótipo, tais como genes envolvidos nos processos de enovelamento e degradação protéico e nos processos de endocitose e exocitose de vesículas, que podem alterar a quantidade de fibrilina-1 truncada disponível e assim o fenótipo / The Marfan syndrome (MFS) (OMIM # 154700) is the most common genetic disorder of the connective tissue and is inherited in a autosomal dominant fashion, it has an incidence of 1 in 5,000 individuals. Despite a great clinical variability being one of the \"trademarks\" of the syndrome, the phenotype of the MFS has complete penetrance and its clinical manifestations primarily affect the skeletal, ocular and cardiovascular systems. In order to study the pathogenic mechanisms of MFS was developed a mouse model, named mgΔneoLoxP, which reproduces the skeletal, cardiovascular and pulmonary manifestations of the syndrome. The model was established in inbred mouse strains 129/Sv and C57BL / 6, which phenotypes differ as to age of onset and severity of manifestation. It is possible that allelic differences between these inbred strains alter the phenotyic manifestation of disease, leading to the conclusion that may exist modifier genes involved in the for MFS. This study inteds to use this experimental model to identify phenotype modifier genes of MFS so a better understand the genetic architecture of the syndrome. Altogether, 82 129xB6 F2 heterozygous animals were generated so that a linkage analysis using microsatellite and SNP could be conducted. The linkage analysis using a selective genotyping procedure showed a suggestive linkage of the skeletal phenotype with regions included between positions 56 cM and 68 cM on chromosome 3, and 2 cM and 20 cM on chromosome X; and a significant linkage between positions 41cM and 49 cM on chromosome 6; also showing suggestive linkage of the cardiovascular phenotype from 66 cM to 70 cM on chromosome 4, and 44 cM to 52 cM on chromosome 13. Besides the variability between strains, 129 animals have a wide inner strain phenotypic variability, which in the case of isogenic animals should be caused by random factors or due to epigenetic modifications that may alter the expression level some genes and thus the phenotype. The comparison between animals of the 129 strain with mild and severe alterations led to the identification of 25 differentially expressed genes of which 11 showed relevant functions to the MFS, however it was only possible to measure the expression levels of two genes using real-time PCR, although those did not validate the results obtained from the expression microarray due to a large expression variation in all phenotypic classes. It was also identified 46 pathways that were more frequent in the gene lists obtained from the comparison between the two phenotypic classes of heterozygous animals against 129 wildtype animals. There is a similarity in the function of genes or pathways of interest found in pathways analysis and genes identified, either by differential expression or linkage analisys, and among them there genes already associated with the MFS, such as in the control activity of TGF-B and biogenesis of microfibers in the extracellular matrix, as also genes that were not associated with MFS but are possible phenotype modifier genes, such as genes involved in protein folding and degradation processes and of endocytosis and exocytosis processes of vesicle, which can change the amount of truncated fibrillin-1 available and thus the phenotype

Orientador: Carmen Sílvia Bertuzzo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-27T06:53:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rezende_LucianaMontes_M.pdf: 2160530 bytes, checksum: b9f9b53af213aa35b20cf6a49d746a91 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: O Câncer de Mama (CM) é a forma de neoplasia mais diagnosticada e a principal causa de morte por câncer em várias regiões do mundo, sendo a maior parte CM esporádico. O estilo de vida reprodutivo representa importante fator de risco relacionado à exposição ao estrógeno durante a vida, visto que o hormônio é responsável por estimular a proliferação celular mamária. Por outro lado, a enzima metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR) regula o balanço celular entre a metilação e a síntese de ácidos nucléicos. Polimorfismos nos genes dos receptores de estrógeno (ESR1 e ESR2) e do metabolismo do folato (MTHFR) têm sido associados ao risco de CM em diferentes populações. Objetivos: Avaliar a associação entre CM esporádico e os polimorfismos c.2014G>A (ESR1), c.1730G>A (ESR2), c.677C>T e c.1298A>C (MTHFR), incluindo as variáveis clínicas. Material e Métodos: Foram selecionadas 253 amostras de DNA de mulheres com CM esporádico do Laboratório de Genética Molecular do Câncer (FCM-Unicamp) e 257 controles femininos com idade superior a 50 anos e sem história familiar para CM ou câncer de ovário. As amostras foram genotipadas por RFLP-PCR. Foram incluídas variáveis clínicas relacionadas ao indivíduo, aos tumores e ao estilo de vida reprodutivo. Para a análise estatística, foi utilizado o software SPSS vs21.0, empregado o teste ?2 para a distribuição dos polimorfismos e, quando observada diferença no percentual destes, foi calculado a Razão de Prevalência. Resultados: Não foi observada diferença significativa entre os grupos em relação à ocorrência de CM para os polimorfismos: c.2014G>A (p=0,281), c.1730G>A (p=0,241), c.677C>T (p=0,443) e c.1298A>C (p=0,805). Ao associar os genótipos às variáveis clínicas, o alelo A (c.2014G>A) foi menos prevalente em tumores com expressão do receptor de estrógeno (RE positivos) (OR=0,469; 95% IC=0,262 ¿ 0,841) e mais prevalente no estadio 0 em relação aos demais (OR=3,911; 95% IC=1,394 ¿ 10,97), enquanto no genótipo GA teve expressão diminuída de RE e no GG, maior expressão de receptor de estrógeno (RP). Para o c.1730G>A, o genótipo GA foi mais prevalente entre as mulheres que amamentaram (OR=2,257; 95% IC=1,254 ¿ 4,061), menos prevalente em hipertensão arterial sistêmica (HAS) (OR=0,578; 95% IC=0,339 ¿ 0,987) e conferiu proteção do estadio 0 em relação aos demais (OR=4,383; 95% IC=1,606 ¿ 11,96). Na análise do haplótipo c.2014G>A/c.1730G>A, GG/GG foi menos prevalente entre as mulheres que amamentaram (OR=0,525; 95% IC=0,298 ¿ 0,924) e teve maior expressão de RP. Para os polimorfismos no MTHFR, o genótipo CC (c.677C>T) representou um fator de risco para metástases a distância (OR=5,311; 95% IC=1,124 ¿ 25,09) e teve menor expressão de RE, enquanto o genótipo AA (c.1298A>C) foi menos prevalente no estadio 0 em relação aos demais (OR=0,034; 95% IC=0,067 ¿ 0,669) e apresentou maior expressão de RE. Na análise do haplótipo c.677C>T/c.1298A>C, o CC/AA foi associado ao uso de contraceptivo hormonal (OR=3,671; 95% IC=1,344 ¿ 10,03) e HAS (OR=1,979; 95% IC=1,036 ¿ 3,782); e o CT/AC foi menos prevalente no carcinoma invasivo de tipo não especial (NST) (OR=0,032; 95% IC=0,243 ¿ 0,918) e conferiu proteção do estadio 0 em relação aos demais (OR=3,476; 95% IC=1,341 ¿ 10,47). Conclusões: Os polimorfismos parecem não alterar o risco para o desenvolvimento de CM esporádico, no entanto, podem estar associados à sua gravidade / Abstract: The Breast Cancer (BC) is the most frequently diagnosed form of cancer and the main cause of cancer death in worldwide. The reproductive lifestyle is an important risk factor related to exposure to estrogen during the life, being the hormone is responsible for stimulating cell proliferation in the breast. On the other hand, the enzyme methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) regulates cell balance between synthesis and methylation of nucleic acids. Polymorphisms in the genes of the estrogen receptor (ESR1 and ESR2) and folate metabolism (MTHFR) have been associated with risk of breast cancer in different populations. Objectives: To evaluate the association between sporadic BC and c.2014G>A (ESR1), c.1730G>A (ESR2), c.677C>T and c.1298A>C (MTHFR) polymorphisms, including the risk factor and the association with clinical variables. Material and methods: We enrolled 253 DNA samples from women with sporadic BC from Molecular Genetics of Cancer Laboratory (FCM/Unicamp) and 257 female controls over the age of 50 and without family history of BC or ovarian cancer. The samples were genotyped by PCR-RFLP. Clinical variables were included related to the individual, to tumors and reproductive lifestyle. For statistical analysis, SPSS software vs21.0 was used, the ?2 test was applied for the distribution of polymorphisms and when significant differences was observed, we calculated the odds ratio. Results: There was no significant difference between the groups in the occurrence of BC for the polymorphisms: c.2014G>A (p=0.281), c.1730G>A (p=0.241), c.677C>T (p=0.043) and c.1298A>C (p=0.805). By associating genotypes to clinical variables, the A allele (c.2014G>A) was less prevalent in tumors with positive ER (OR=0.469; 95% CI=0.262 to 0.841) and more prevalent in stage 0 compared to the other (OR=3.911; 95% CI=1.394 to 10.97), while the GA genotype had lower expression of ER and GG, most PR expression. For c.1730G>A, the GA genotype was more prevalent among women who breastfed (OR=2.257; 95% CI=1.254 to 4.061), less prevalent in hypertension (OR=0.578; 95% CI=0.339 to 0.987) and conferred protection to stage 0 in relation to others (OR=4.383; 95% CI=1.606 to 11.96). In the haplotype analysis c.2014G>A/c.1730G>A, GG/GG was less prevalent among those who breastfed (OR=0.525; 95% CI=0.298 to 0.924) and had higher PR expression. For polymorphisms in MTHFR, the CC genotype (c.677C>T) was a risk factor for distant metastasis (OR=5.311; 95% CI=1.124 to 25.09) and had lower expression of SR, while the genotype AA (c.1298A>C) was less prevalent in stage 0 in relation to others (OR=0.034; 95% CI=0.067 to 0.669) and showed a higher expression of ER. In the haplotype analysis for c.677C>T and c.1298A>C, the CC/AA combination was associated with hormonal contraceptive use (OR=3.671, 95% CI=1.344 to 10.03) and hypertension (OR=1.979; 95 % CI=1.036 to 3.782). The CT/AC was less prevalent in invasive carcinoma NST (OR=0.032; 95% CI=0.243 to 0.918) and conferred protection to stage 0 in relation to others (OR=3.476; 95% CI=1.341 to 10.47). Conclusions: The polymorphisms analyzed do not appear to alter the risk for developing sporadic BC, however, may be associated with its severity / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestra em Ciências Médicas

Orientador: Carmen Silvia Bertuzzo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-23T02:22:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Furgeri_DanielaTenorio_D.pdf: 7382335 bytes, checksum: edfcfca14ac645a69fd4e8e2d2777246 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A fibrose cística (FC) é uma doença autossômica recessiva com características de doença complexa. Complicações clínicas parece ser fator decisivo para o prognóstico dos pacientes. Os polimorfismos nos genes ADRA2A e TCF7L2 são importantes para elucidar parte da variabilidade encontrada nas características clínicas de doenças inflamatórias, incluindo a FC, que tem a Diabetes Mellitus como uma importante co-morbidade. Os objetivos deste estudo foram determinar a frequência do polimorfismo rs12255372 no gene TCF7L2 e sua associação com Diabetes Mellitus em pacientes com fibrose cística, e investigar a associação de 27 variáveis clínicas da FC com os polimorfismos rs553668 e rs10885122 do gene ADRA2A. Em nosso estudo, 145 pacientes foram avaliados em relação ao genótipo do polimorfismo rs12255372 no gene TCF7L2 e 176 pacientes foram avaliados em relação à associação dos polimorfismos rs553668 e rs10885122 no gene ADRA2A com 27 variáveis clínicas da FC. Todos os pacientes em atendimento no Ambulatório de Pediatria da Faculdade de Ciências Médicas da UNICAMP foram confirmados como tendo fibrose cística por dois testes de suor alterados (valor de sódio e de cloro superior a 60 mmol / L) e por análise de diferencial do epitélio da membrana do intestino através da dosagem de CFTR pela câmara Ussing. A identificação das mutações do gene CFTR foi realizada no laboratório de Genética Molecular da FCM/Unicamp. O rastreio do polimorfismo rs12255372 foi feito através da técnica de PCR associada à digestão enzimática específica. O rastreio dos polimorfismos rs553668 e rs10885122 no gene ADRA2A foi feito por PCR ARMS. Uma comparação genotípica foi realizada com as 27 variáveis clínicas, da FC considerando as mutações do gene CFTR. Encontramos associações clínicas, sem considerar as mutações no gene CFTR, com as variáveis categóricas: raça [para o polimorfismo rs553668 (p = 0,002), grupo haplotípico (p = 0,014)], íleo Meconial [para o polimorfismo rs553668 (p = 0,030) Quando consideradas as duas mutações no gene CFTR, encontramos associações com as variáveis íleo meconial (p = 0,0012) e IMC [para o polimorfismo rs553668 (p = 0,014)]. A associação com dados numéricos, sem considerar as mutações no gene CFTR, foi positiva para a idade ao diagnóstico [para o polimorfismo rs553668 (p = 0,022)]. Considerando as duas mutações no gene CFTR, a associação com dados numéricos foi positiva para o Escore de Bhalla [para o polimorfismo rs553668 (p = 0,014)], Escore de Shwachman-Kulczycki [para o polimorfismo rs553668 (p = 0,008) e haplótipos (p = 0,050)]. Os polimorfismos rs553668 e rs10885122 no gene ADRA2A parecem ser moduladores da gravidade da FC em nossa amostra. Em nossa amostra, não houve associação entre o polimorfismo rs12255372 no gene TCF7L2 e a Diabetes Mellitus / Abstract: Cystic fibrosis (CF) is an autosomal recessive disease with characteristics of complex disease. Clinical complications appear to be a decisive factor in the prognosis of patients. The ADRA2A and TCF7L2 gene polymorphisms are important to elucidate part of the variability encountered in clinical characteristics in inflammatory diseases, including CF, which has diabetes-associated as an important comorbidity. The aims of this study ware to determine the frequency of polymorphism rs12255372 in the TCF7L2 gene and its association with Diabetes Mellitus in Cystic Fibrosis patients and to investigate the association of 27 CF clinical variables with ADRA2A polymorphisms. In our study, 145 patients were evaluated in relation to the genotype of the rs12255372 polymorphism in the TCF7L2 gene. 176 patients were evaluated in relation to associate rs553668 and rs10885122 polymorphisms in the ADRA2A gene with 27 CF clinical variables. All patients in attendance at the Pediatric Clinic at the Faculty of Medical Sciences, UNICAMP, were confirmed as having cystic fibrosis by two altered sweat tests (sodium and chlorine value greater than 60 mmol/L) and by analysis of differential membrane epithelium of the intestine by the dosage of active CFTR through the Ussing chamber. The identification of CFTR gene mutations was performed in the laboratory of Molecular Genetics, FCM/Unicamp. The rs12255372 polymorphism was screening by PCR method associated with specific enzymatic digestion. The rs553668 and rs10885122 polymorphisms in ADRA2A gene were screening by ARMS-PCR. A genotypic comparison was performed with 27 CF clinical variables, considering CFTR mutations. We found clinical associations, without considering the mutations in the CFTR gene, with categorical variables: race [for polymorphism rs553668 (p = 0.002), haplotype group (p = 0.014)], meconium ileus [for polymorphism rs553668 (p = 0.030). Considering the two mutations in the CFTR gene, we find associations with categorical variables meconium ileus (p = 0.0012) and BMI [for polymorphism rs553668 (p = 0.014)]. The association with numerical data, without considering the mutations in the CFTR gene, was positive for age at diagnosis [for polymorphism rs553668 (p = 0.022)]. Considering the two mutations in the CFTR gene, the association with numerical data was positive for Bhalla score [for polymorphism rs553668 (p = 0.014)], Shwachman-Kulczycki score [for polymorphism rs553668 (p = 0.008) and haplotypes (p = 0.050)]. Polymorphisms rs553668 and rs10885122 in ADRA2A gene appear to be modulators of CF severity in our sample. In our sample, there was no association between the polymorphism rs12255372 in the TCF7L2 gene and Diabetes Mellitus / Doutorado / Clinica Medica / Doutora em Clínica Médica