Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:37Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-09-29. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:31Z : No. of bitstreams: 1 Publico-446a.pdf: 1792710 bytes, checksum: 48eedd8b23b1ea14695c801e876c69f6 (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:31Z : No. of bitstreams: 2 Publico-446a.pdf: 1792710 bytes, checksum: 48eedd8b23b1ea14695c801e876c69f6 (MD5) Publico-446b.pdf: 1757062 bytes, checksum: 386b81cc86e0c7a79177850c1ce35889 (MD5). 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Objetivos: Avaliar a função pulmonar (FP) de pacientes com a SM, relacionar com os aspectos da avaliação clínica, especialmente as possíveis alterações de caixa torácica (ACT) e identificar as manifestações do sistema cardiovascular durante o exame espirométrico (EE). Métodos: De uma amostra inicial de 75 sujeitos, foram avaliados 46 pacientes com SM, sendo 29 do sexo feminino, idade média 20±8 anos, submetidos à avaliação clínica, antropométrica, ecocardiográfica, radiográfica e função pulmonar; 51 sujeitos (33 com SM) foram monitorizados pelo eletrocardiograma (ECG) durante o teste de FP. Estes indivíduos foram pareados e comparados a um grupo controle compostos por indivíduos saudáveis. Resultados: A capacidade vital forçada (CVF) e volume expiratório forçado no primeiro segundo (VEF1) dos pacientes com SM foram significativamente menores quando comparado com o GC (p=0.012 e 0.0006) e quando comparado com o previsto (p=0.04 e 0.003). Nos subgrupos baseados nas ACT observamos diferenças entre pacientes com SM com duas ACT combinadas (pectus + escoliose) quando comparados com o GC (p=0.012 e 0.002) e nos pacientes sem ACT (p=0.05 e 0.06). Alguns aspectos da avaliação clínica (relação envergadura/altura e relação da cirtometria axilar/xifóide), comportamento cardiovascular (Índice de massa do ventrículo esquerdo-IMVE, g/m2 e diâmetro da Aorta – Ao, mm) e FP (VEF1/CVF,%) apresentaram correlação moderada. Não foi observada diferença na análise de arritmia durante o esforço para o EE. Conclusões: A FP encontrou-se reduzida nos pacientes com SM e a presença de deformidades da caixa torácica parece contribuir com esta redução. Alguns aspectos clínicos, cardiovasculares e FP estão associados na SM. Apesar das alterações aparentes na estrutura do sistema cardiovascular desta população jovem, o esforço durante a avaliação da função pulmonar parece ser seguro em relação às alterações no ECG. / Background: Marfan syndrome (MS) is a dominant autosomal connective tissue disease that impacts multiple systems, such as the musculoskeletal, ocular, cardiovascular, pulmonary, tegumentary and neurological. This mutation may produces impairment in the connective tissue which causes modifications in the vascular viscoelastic properties, tegumentary elasticity, bone calcification matrix and pulmonary parenchyma. Purpose: To evaluate pulmonary function test (PFT) in patients with MS and relate it to clinical evaluation aspects, especially possible thoracic cage abnormalities (TCA), and the occurrence of cardiac arrhythmias during the spirometric exam (SE). Method: From a sample of 75 subjects, we evaluate 46 MS patients, 29 female and aged 20±0,51 years, who was underwent clinical, anthropometric, echocardiographic, radiographic and PF evaluation; 51 subjects (33 with MS) had their electrocardiography information evaluated during PFT. These individuals were matched and compared to a healthy control group (CG). Results: Forced vital capacity (FVC) and forced expiratory volume in the first second (FEV1) in the patients with MS were significantly lower in comparison to the CG (p=0.012 and p=0.0006) and predicted values (p=0.04 and p=0.003). Subgroup analysis based on TCA revealed differences between patients with MS with two combined abnormalities (pectus + scoliosis) in comparison to both the CG (p=0.012 and p=0.002) and patients without abnormalities (p=0.05 and p=0.006). Some aspects from clinical evaluation (Arm span to height ratio,m and axillary to xiphoid perimetry ratio,cm), cardiovascular behavior (Left ventricular mass Index-LVMI, g/m2 and Aortic Diameter- Ao,mm) and PF (FEV1/FVC%) has demonstrated a moderate correlation. There were no differences regarding the occurrence of arrhythmia during exertion on the SE. Conclusion: PF is reduced in patients with MS, and deformities in the thoracic cage appear to contribute to this reduction. Some aspects clinical, cardiovascular and PF are associated in MS. Despite the apparent structural alterations in the cardiovascular system in this young population, exertion during the spirometric exam appears to be safe in relation to electrocardiography modifications. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

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A Síndrome de Marfan (SMF) é uma doença de caráter autossômico dominante que acomete o tecido conjuntivo. As principais manifestações clínicas afetam o sistema cardiovascular, ótico e ósseo. A SMF é causada por mutações no gene FBN1, que codifica a proteína extracelular fibrilina-1, componente principal das microfibrilas, que formam as fibras elásticas. Estudos mostraram que mutações no gene da fibrilina-1 levam a um aumento indiscriminado do TGF-Β ativo na matriz, que resulta nos principais fenótipos da doença. O Sistema Renina Angiotensina (RAS) tem como produto principal a Angiotensina II (Ang-II), envolvida na regulação da massa óssea e da atividade do TGF-Β. Estratégias terapêuticas para a SMF utilizando fármacos que agem no RAS têm sido alvos de estudos em modelos animais. Em camundongos, Ramipril, inibidor da ACE (Angiotensin-converting enzyme inhibitor, ACEi), aumenta a transcrição do gene Fbn1 em 35% e melhora a cifose, característica do fenótipo ósseo no modelo animal mgΔloxPneo. O mecanismo de ação do Ramipril no sistema ósseo ainda não está totalmente elucidado, sendo que pode agir por diminuição na produção de Ang-II e consequente diminuição nos níveis de TGF-Β, ou pela inibição de degradação da bradicinina (BK) pela Ang-II. A bradicinina ativa diretamente seu receptor B2R, que induz ações fisiológicas opostas às da Ang-II. O objetivo deste trabalho foi avaliar e compreender os mecanismos gerais da patogênese óssea do modelo murino mgΔloxPneo para a SMF. Para tanto, foi analisado o fenótipo ósseo dos animais mgΔloxPneo e selvagens controle e tratados com Ramipril. Foi verificado que, além da cifose, os animais mutantes apresentaram pior estrutura óssea. O tratamento melhorou a cifose, porém não alterou a qualidade óssea dos animais mutantes. Portanto, o efeito benéfico do Ramipril na cifose dos animais mgΔloxPneo não se deve a uma melhora da estrutura óssea, e pode estar relacionado à integridade do ligamento que sustenta a coluna vertebral. Com o intuito de testar a hipótese de que a sinalização pelo receptor B2R da BK possa estar envolvida no desenvolvimento do fenótipo ósseo dos animais mgΔloxPneo, foram gerados animais mgΔloxPneo e knockout para o receptor B2R. Os resultados mostram que o receptor B2R não interfere no desenvolvimento da cifose, sendo apenas o genótipo para Fbn1 o fator determinante para a manifestação desse fenótipo. Foi realizada a análise de RNA-seq para verificar genes e vias diferencialmente expressas que possam explicar o mecanismo de desenvolvimento do fenótipo ósseo dos animais mgΔloxPneo. Foram encontradas vias como da adesão focal, interação receptor-meio extracelular (MEC), junção ocludente, reparação por excisão de nucleotídeo e de reparação missmatch, que podem explicar alterações no metabolismo de células ósseas. Além disso, foram encontradas diferenças de expressão de genes relacionados ao metabolismo muscular esquelético, o que está de acordo com a hipótese de regulação parácrina entre o tecido muscular e ósseo, levando a uma pior estrutura óssea / Marfan syndrome (MFS) is an autosomal dominant disease that affects the connective tissue. The main clinical manifestations affect the cardiovascular, optical and bone systems. MFS is caused by mutations in the FBN1 gene, that encodes the extracellular protein fibrillin-1, a major component of microfibrils, which form elastic fibers. Studies have shown that mutations in the fibrillin-1 gene lead to an indiscriminate increase in active TGF-Β in the matrix, which results in the major phenotypes of the disease. The Renin Angiotensin System (RAS) has as its main product Angiotensin II (Ang-II), involved in bone mass regulation and TGF-Β activity. Therapeutic strategies using drugs targeting the RAS have been studied in animal models. Ramipril, an ACE inhibitor (Angiotensin-converting enzyme inhibitor, ACEi), increase Fbn1 gene expression in 35% and improve kyphosis index in the mgΔloxPneo mouse model for SMF. Its mechanism of action in bone tissue is not completely elucidated, and it may act by decreasing Ang-II production and consequent reduction in TGF-Β levels, or by inhibiting degradation of bradykinin (BK) by Ang II. BK directly activates its B2R receptor, which induces opposite physiological actions to Ang-II. This study aims to evaluate and understand the general mechanisms of bone pathogenesis in the mgΔloxPneo mouse model. We analyzed the bone phenotype of mgΔloxPneo and wildtype animals treated, or not, with Ramipril by measuring the kyphosis index (KI), micro computed tomography (μCT) and Real-time PCR (RT-PCR). We found that mutant animals showed a greater degree of kyphosis and an altered bone structure. Ramipril improved kyphosis but did not alter bone quality of mutant animals, while in wild type animals Ramipril decreased bone structure without altering KI. Therefore, the beneficial effect of Ramipril on mgΔloxPneo animals\' kyphosis is not due to an improvement in bone structure. In order to test the hypothesis where signaling through BK B2R receptor may be involved in the development of bone phenotype of mgΔloxPneo animals, a mouse model with the mgΔloxPneo mutation and knockout for B2R receptor was generated. The analysis of these animals show that the B2R receptor does not interfere with the development of kyphosis, with Fbn1 genotype as sole determinant for this phenotype manifestation. RNA-seq analysis was performed to verify differential expression of genes and altered cellular pathways, which could reveal mechanisms of bone phenotype development in mgΔloxPneo animals. Altered pathways found included focal adhesion, receptor- extracellular matrix (ECM) interaction, tight junction, nucleotide excision repair and missmatch repair, which may explain changes in bone cells metabolism. In addition, there were differences in gene expression related to skeletal muscle metabolism, which is in agreement with the paracrine regulation of bone and muscle tissue, leading to worst bone structure

A Síndrome de Marfan (SMF) é uma doença de tecido conjuntivo, com caráter autossômico dominante, que acomete cerca de 1 em 5.000 indivíduos. As principais manifestações clínicas incluem aneurismas e rompimento da aorta, crescimento excessivo dos ossos, escoliose e deformidades torácicas. Mutações no gene FBN1, que codifica a proteína de matriz extracelular fibrilina-1, foram relacionadas à doença, fazendo com que essa fosse classificada no grupo das fibrilinopatias. Mais de 500 mutações já foram identificadas e, com exceção de um pequeno grupo de mutações recorrentes, as mutações são únicas, sendo encontradas em famílias isoladas. A doença caracteriza-se pela grande variabilidade tanto intra quanto interfamilial, não sendo possível fazer uma correlação precisa entre genótipo e fenótipo. Este trabalho visa discutir os mecanismos responsáveis pela variabilidade clínica inter e intra familiar da SMF através da caracterização qualitativa e quantitativa da variabilidade fenotípica observada no modelo murino para SMF MGΔloxPneo . Neste sentido, caracterizamos o modelo mgΔloxPneo em duas linhagens de camundongos diferentes, C57BL/6 e 129/Sv. Os animais mutantes de ambas as linhagens apresentaram deficiência na deposição de microfibrilas, cifose de coluna, enfisema pulmonar e degeneração da parede aórtica. Contudo, a idade de início dos sinais fenotípicos mostrou-se mais tardia em animais da linhagem C57BL/6 em comparação com os animais 129/Sv, indicando a presença de genes modificadores entre as duas linhagens. Além disso, caracterizamos uma grande variabilidade fenotípica entre os animais 129/Sv mutantes, o que é sugestivo do envolvimento de fatores epigenéticos na gravidade da doença. Finalmente, demonstramos uma forte correlação negativa entre os níveis globais de transcrição do gene Fbn1 e a gravidade do fenótipo. Esses resultados corroboram a hipótese de que o nível de expressão da proteína normal está relacionado com a gravidade do quadro clínico da SMF em humanos. Com base nisso, o trabalho também visa o estudo de novas estratégias terapêuticas para a SMF nesse mesmo modelo. / The Marfan syndrome (MFS) is an autosomal dominant disease of connective tissue, which affects 1 in 5,000 individuals. The main clinical manifestations include aneurysms and aortic disruption, excessive growth of bones, scoliosis and thoracic deformities. Mutations in the FBN1 gene, which encodes the fibrillin-1 protein, were genetically linked to the MFS, classifying this disease in the fibrilinopathies group. Over 500 mutations have been identified and, except for a small group of recurrent mutations, the mutations are unique, being found in unrelated families. The disease is characterized by a wide clinical variability both within and between families, and it is not possible to make a precise genotypephenotype correlation. This work concerns the analysis of the mechanisms associated with the clinical variability present within and between MFS families, by qualitative and quantitative characterization of the phenotypic variability observed in the mgΔloxPneo model for MFS. We characterize the model mgΔloxPneo, in two different mouse strains, the C57BL/6 and the 129/Sv strain. Mutant animals from both strains present defective microfibrillar deposition, emphysema, deterioration of aortic wall and kyphosis. However, the onset of a clinical phenotypes is earlier in the 129/Sv than in C57BL/6 background, indicating the existence of genetic modifiers of MFS between these two mouse strains. In addition, we characterized a wide clinical variability within the 129/Sv heterozygotes, suggesting involvement of epigenetic factors in disease severity. Finally, we show a strong negative correlation between overall levels of Fbn1 expression and the severity of the phenotypes. These results corroborated with studies, using animal models, as well with MFS patients, where the levels of normal fibrillin-1 seem to have the potential to modulate the clinical severity of the disease. In addition, the study also aims to evaluate new treatment possibilities for MFS in this same model.

A Síndrome de Marfan (SMF) (OMIM# 154700) é a mais comum das doenças genéticas do tecido conjuntivo Herdada de forma autossômica dominante, ela apresenta incidência de 1 em cada 5.000 indivíduos. Apesar de apresentar grande variabilidade clínica inter e intrafamiliar, o fenótipo da SMF possui penetrância completa, e suas manifestações clínicas afetam primariamente os sistemas esquelético, ocular e cardiovascular. Afim de estudar os mecanismos patogênicos da SMF foi desenvolvido um modelo murino, mgΔneoLoxP, que reproduz as manifestações ósseas, cardiovasculares e pulmonares da síndrome. O modelo foi estabelecido nas linhagens isogênicas 129/Sv e C57BL/6, que apresentam diferenças tanto quanto a idade de acometimento quanto a gravidade das alterações, é possível que as diferenças alélicas existentes entre essas linhagens alterem a manifestação fenotípica, ou seja, que existam genes modificadores para a SMF. Assim, objetivo deste projeto é utilizar este modelo experimental para identificar genes modificadores do fenótipo da SMF e tentar entender melhor a arquitetura genética da síndrome. Ao todo foram gerados 82 animais 129xB6 F2 heterozigotos para o alelo mgΔneoLoxP, a analise de ligação utilizando microssatélites e SNPs nos animais com fenótipos mais extremos mostraram ligação sugestiva do fenótipo ósseo com as regiões compreendidas entre as posições 56 cM e 68 cM do cromossomo 3; e 2 cM e 20 cM do cromossomo X; ligação significativa entre as posições 41cM e 49 cM do cromossomo 6; além de mostrar ligação sugestiva do fenótipo cardiovascular do 66 cM ao 70 cM do cromossomo 4; e do 44 cM ao 52 cM do cromossomo 13. Além da variabilidade entre linhagens, os animais 129 apresentam uma grande variabilidade fenotípica interna, o que por se tratar de animais isogênicos causada por fatores aleatórios ou devido a modificações epigenéticas que alterem o nível de expressão de alguns genes e assim o fenótipo. A comparação entre animais 129 leves e graves levou a identificação de 25 genes diferencialmente expressos dos quais 11 apresentavam funções relevantes para a SMF, entretanto foram aferidos os níveis de expressão de 2 destes que não validaram os resultados obtidos devido a uma grande variação observada entre os animais de todos as classes fenotípicas. Também foram identificadas 46 vias que se apresentavam mais frequentes nos conjuntos de genes obtidos entre as duas classes fenotípica de animais heterozigotos contra os animais selvagens. Tanto as vias, quanto os genes identificados através de ligação quanto diferença de expressão mostram uma convergência para as funções dos genes de interesse, sendo que entre eles existem genes já associados com a SMF, controle de ativação de TGF-B e da biogênese das microfibras da matriz extracelular, quanto genes que ainda não foram associados mas são possíveis modificadores do fenótipo, tais como genes envolvidos nos processos de enovelamento e degradação protéico e nos processos de endocitose e exocitose de vesículas, que podem alterar a quantidade de fibrilina-1 truncada disponível e assim o fenótipo / The Marfan syndrome (MFS) (OMIM # 154700) is the most common genetic disorder of the connective tissue and is inherited in a autosomal dominant fashion, it has an incidence of 1 in 5,000 individuals. Despite a great clinical variability being one of the \"trademarks\" of the syndrome, the phenotype of the MFS has complete penetrance and its clinical manifestations primarily affect the skeletal, ocular and cardiovascular systems. In order to study the pathogenic mechanisms of MFS was developed a mouse model, named mgΔneoLoxP, which reproduces the skeletal, cardiovascular and pulmonary manifestations of the syndrome. The model was established in inbred mouse strains 129/Sv and C57BL / 6, which phenotypes differ as to age of onset and severity of manifestation. It is possible that allelic differences between these inbred strains alter the phenotyic manifestation of disease, leading to the conclusion that may exist modifier genes involved in the for MFS. This study inteds to use this experimental model to identify phenotype modifier genes of MFS so a better understand the genetic architecture of the syndrome. Altogether, 82 129xB6 F2 heterozygous animals were generated so that a linkage analysis using microsatellite and SNP could be conducted. The linkage analysis using a selective genotyping procedure showed a suggestive linkage of the skeletal phenotype with regions included between positions 56 cM and 68 cM on chromosome 3, and 2 cM and 20 cM on chromosome X; and a significant linkage between positions 41cM and 49 cM on chromosome 6; also showing suggestive linkage of the cardiovascular phenotype from 66 cM to 70 cM on chromosome 4, and 44 cM to 52 cM on chromosome 13. Besides the variability between strains, 129 animals have a wide inner strain phenotypic variability, which in the case of isogenic animals should be caused by random factors or due to epigenetic modifications that may alter the expression level some genes and thus the phenotype. The comparison between animals of the 129 strain with mild and severe alterations led to the identification of 25 differentially expressed genes of which 11 showed relevant functions to the MFS, however it was only possible to measure the expression levels of two genes using real-time PCR, although those did not validate the results obtained from the expression microarray due to a large expression variation in all phenotypic classes. It was also identified 46 pathways that were more frequent in the gene lists obtained from the comparison between the two phenotypic classes of heterozygous animals against 129 wildtype animals. There is a similarity in the function of genes or pathways of interest found in pathways analysis and genes identified, either by differential expression or linkage analisys, and among them there genes already associated with the MFS, such as in the control activity of TGF-B and biogenesis of microfibers in the extracellular matrix, as also genes that were not associated with MFS but are possible phenotype modifier genes, such as genes involved in protein folding and degradation processes and of endocytosis and exocytosis processes of vesicle, which can change the amount of truncated fibrillin-1 available and thus the phenotype

A Síndrome de Marfan (SMF) é uma doença de tecido conjuntivo, com caráter autossômico dominante, que acomete cerca de 1 em 5.000 indivíduos. As principais manifestações clínicas incluem aneurismas e rompimento da aorta, crescimento excessivo dos ossos, escoliose e deformidades torácicas. Mutações no gene FBN1, que codifica a proteína de matriz extracelular fibrilina-1, foram relacionadas à doença, fazendo com que essa fosse classificada no grupo das fibrilinopatias. Mais de 500 mutações já foram identificadas e, com exceção de um pequeno grupo de mutações recorrentes, as mutações são únicas, sendo encontradas em famílias isoladas. A doença caracteriza-se pela grande variabilidade tanto intra quanto interfamilial, não sendo possível fazer uma correlação precisa entre genótipo e fenótipo. Este trabalho visa discutir os mecanismos responsáveis pela variabilidade clínica inter e intra familiar da SMF através da caracterização qualitativa e quantitativa da variabilidade fenotípica observada no modelo murino para SMF MGΔloxPneo . Neste sentido, caracterizamos o modelo mgΔloxPneo em duas linhagens de camundongos diferentes, C57BL/6 e 129/Sv. Os animais mutantes de ambas as linhagens apresentaram deficiência na deposição de microfibrilas, cifose de coluna, enfisema pulmonar e degeneração da parede aórtica. Contudo, a idade de início dos sinais fenotípicos mostrou-se mais tardia em animais da linhagem C57BL/6 em comparação com os animais 129/Sv, indicando a presença de genes modificadores entre as duas linhagens. Além disso, caracterizamos uma grande variabilidade fenotípica entre os animais 129/Sv mutantes, o que é sugestivo do envolvimento de fatores epigenéticos na gravidade da doença. Finalmente, demonstramos uma forte correlação negativa entre os níveis globais de transcrição do gene Fbn1 e a gravidade do fenótipo. Esses resultados corroboram a hipótese de que o nível de expressão da proteína normal está relacionado com a gravidade do quadro clínico da SMF em humanos. Com base nisso, o trabalho também visa o estudo de novas estratégias terapêuticas para a SMF nesse mesmo modelo. / The Marfan syndrome (MFS) is an autosomal dominant disease of connective tissue, which affects 1 in 5,000 individuals. The main clinical manifestations include aneurysms and aortic disruption, excessive growth of bones, scoliosis and thoracic deformities. Mutations in the FBN1 gene, which encodes the fibrillin-1 protein, were genetically linked to the MFS, classifying this disease in the fibrilinopathies group. Over 500 mutations have been identified and, except for a small group of recurrent mutations, the mutations are unique, being found in unrelated families. The disease is characterized by a wide clinical variability both within and between families, and it is not possible to make a precise genotypephenotype correlation. This work concerns the analysis of the mechanisms associated with the clinical variability present within and between MFS families, by qualitative and quantitative characterization of the phenotypic variability observed in the mgΔloxPneo model for MFS. We characterize the model mgΔloxPneo, in two different mouse strains, the C57BL/6 and the 129/Sv strain. Mutant animals from both strains present defective microfibrillar deposition, emphysema, deterioration of aortic wall and kyphosis. However, the onset of a clinical phenotypes is earlier in the 129/Sv than in C57BL/6 background, indicating the existence of genetic modifiers of MFS between these two mouse strains. In addition, we characterized a wide clinical variability within the 129/Sv heterozygotes, suggesting involvement of epigenetic factors in disease severity. Finally, we show a strong negative correlation between overall levels of Fbn1 expression and the severity of the phenotypes. These results corroborated with studies, using animal models, as well with MFS patients, where the levels of normal fibrillin-1 seem to have the potential to modulate the clinical severity of the disease. In addition, the study also aims to evaluate new treatment possibilities for MFS in this same model.

A Síndrome de Marfan (SMF) (OMIM# 154700) é a mais comum das doenças genéticas do tecido conjuntivo Herdada de forma autossômica dominante, ela apresenta incidência de 1 em cada 5.000 indivíduos. Apesar de apresentar grande variabilidade clínica inter e intrafamiliar, o fenótipo da SMF possui penetrância completa, e suas manifestações clínicas afetam primariamente os sistemas esquelético, ocular e cardiovascular. Afim de estudar os mecanismos patogênicos da SMF foi desenvolvido um modelo murino, mgΔneoLoxP, que reproduz as manifestações ósseas, cardiovasculares e pulmonares da síndrome. O modelo foi estabelecido nas linhagens isogênicas 129/Sv e C57BL/6, que apresentam diferenças tanto quanto a idade de acometimento quanto a gravidade das alterações, é possível que as diferenças alélicas existentes entre essas linhagens alterem a manifestação fenotípica, ou seja, que existam genes modificadores para a SMF. Assim, objetivo deste projeto é utilizar este modelo experimental para identificar genes modificadores do fenótipo da SMF e tentar entender melhor a arquitetura genética da síndrome. Ao todo foram gerados 82 animais 129xB6 F2 heterozigotos para o alelo mgΔneoLoxP, a analise de ligação utilizando microssatélites e SNPs nos animais com fenótipos mais extremos mostraram ligação sugestiva do fenótipo ósseo com as regiões compreendidas entre as posições 56 cM e 68 cM do cromossomo 3; e 2 cM e 20 cM do cromossomo X; ligação significativa entre as posições 41cM e 49 cM do cromossomo 6; além de mostrar ligação sugestiva do fenótipo cardiovascular do 66 cM ao 70 cM do cromossomo 4; e do 44 cM ao 52 cM do cromossomo 13. Além da variabilidade entre linhagens, os animais 129 apresentam uma grande variabilidade fenotípica interna, o que por se tratar de animais isogênicos causada por fatores aleatórios ou devido a modificações epigenéticas que alterem o nível de expressão de alguns genes e assim o fenótipo. A comparação entre animais 129 leves e graves levou a identificação de 25 genes diferencialmente expressos dos quais 11 apresentavam funções relevantes para a SMF, entretanto foram aferidos os níveis de expressão de 2 destes que não validaram os resultados obtidos devido a uma grande variação observada entre os animais de todos as classes fenotípicas. Também foram identificadas 46 vias que se apresentavam mais frequentes nos conjuntos de genes obtidos entre as duas classes fenotípica de animais heterozigotos contra os animais selvagens. Tanto as vias, quanto os genes identificados através de ligação quanto diferença de expressão mostram uma convergência para as funções dos genes de interesse, sendo que entre eles existem genes já associados com a SMF, controle de ativação de TGF-B e da biogênese das microfibras da matriz extracelular, quanto genes que ainda não foram associados mas são possíveis modificadores do fenótipo, tais como genes envolvidos nos processos de enovelamento e degradação protéico e nos processos de endocitose e exocitose de vesículas, que podem alterar a quantidade de fibrilina-1 truncada disponível e assim o fenótipo / The Marfan syndrome (MFS) (OMIM # 154700) is the most common genetic disorder of the connective tissue and is inherited in a autosomal dominant fashion, it has an incidence of 1 in 5,000 individuals. Despite a great clinical variability being one of the \"trademarks\" of the syndrome, the phenotype of the MFS has complete penetrance and its clinical manifestations primarily affect the skeletal, ocular and cardiovascular systems. In order to study the pathogenic mechanisms of MFS was developed a mouse model, named mgΔneoLoxP, which reproduces the skeletal, cardiovascular and pulmonary manifestations of the syndrome. The model was established in inbred mouse strains 129/Sv and C57BL / 6, which phenotypes differ as to age of onset and severity of manifestation. It is possible that allelic differences between these inbred strains alter the phenotyic manifestation of disease, leading to the conclusion that may exist modifier genes involved in the for MFS. This study inteds to use this experimental model to identify phenotype modifier genes of MFS so a better understand the genetic architecture of the syndrome. Altogether, 82 129xB6 F2 heterozygous animals were generated so that a linkage analysis using microsatellite and SNP could be conducted. The linkage analysis using a selective genotyping procedure showed a suggestive linkage of the skeletal phenotype with regions included between positions 56 cM and 68 cM on chromosome 3, and 2 cM and 20 cM on chromosome X; and a significant linkage between positions 41cM and 49 cM on chromosome 6; also showing suggestive linkage of the cardiovascular phenotype from 66 cM to 70 cM on chromosome 4, and 44 cM to 52 cM on chromosome 13. Besides the variability between strains, 129 animals have a wide inner strain phenotypic variability, which in the case of isogenic animals should be caused by random factors or due to epigenetic modifications that may alter the expression level some genes and thus the phenotype. The comparison between animals of the 129 strain with mild and severe alterations led to the identification of 25 differentially expressed genes of which 11 showed relevant functions to the MFS, however it was only possible to measure the expression levels of two genes using real-time PCR, although those did not validate the results obtained from the expression microarray due to a large expression variation in all phenotypic classes. It was also identified 46 pathways that were more frequent in the gene lists obtained from the comparison between the two phenotypic classes of heterozygous animals against 129 wildtype animals. There is a similarity in the function of genes or pathways of interest found in pathways analysis and genes identified, either by differential expression or linkage analisys, and among them there genes already associated with the MFS, such as in the control activity of TGF-B and biogenesis of microfibers in the extracellular matrix, as also genes that were not associated with MFS but are possible phenotype modifier genes, such as genes involved in protein folding and degradation processes and of endocytosis and exocytosis processes of vesicle, which can change the amount of truncated fibrillin-1 available and thus the phenotype

A Síndrome de Marfan (SMF) é uma doença de caráter autossômico dominante que acomete o tecido conjuntivo. As principais manifestações clínicas afetam o sistema cardiovascular, ótico e ósseo. A SMF é causada por mutações no gene FBN1, que codifica a proteína extracelular fibrilina-1, componente principal das microfibrilas, que formam as fibras elásticas. Estudos mostraram que mutações no gene da fibrilina-1 levam a um aumento indiscriminado do TGF-Β ativo na matriz, que resulta nos principais fenótipos da doença. O Sistema Renina Angiotensina (RAS) tem como produto principal a Angiotensina II (Ang-II), envolvida na regulação da massa óssea e da atividade do TGF-Β. Estratégias terapêuticas para a SMF utilizando fármacos que agem no RAS têm sido alvos de estudos em modelos animais. Em camundongos, Ramipril, inibidor da ACE (Angiotensin-converting enzyme inhibitor, ACEi), aumenta a transcrição do gene Fbn1 em 35% e melhora a cifose, característica do fenótipo ósseo no modelo animal mgΔloxPneo. O mecanismo de ação do Ramipril no sistema ósseo ainda não está totalmente elucidado, sendo que pode agir por diminuição na produção de Ang-II e consequente diminuição nos níveis de TGF-Β, ou pela inibição de degradação da bradicinina (BK) pela Ang-II. A bradicinina ativa diretamente seu receptor B2R, que induz ações fisiológicas opostas às da Ang-II. O objetivo deste trabalho foi avaliar e compreender os mecanismos gerais da patogênese óssea do modelo murino mgΔloxPneo para a SMF. Para tanto, foi analisado o fenótipo ósseo dos animais mgΔloxPneo e selvagens controle e tratados com Ramipril. Foi verificado que, além da cifose, os animais mutantes apresentaram pior estrutura óssea. O tratamento melhorou a cifose, porém não alterou a qualidade óssea dos animais mutantes. Portanto, o efeito benéfico do Ramipril na cifose dos animais mgΔloxPneo não se deve a uma melhora da estrutura óssea, e pode estar relacionado à integridade do ligamento que sustenta a coluna vertebral. Com o intuito de testar a hipótese de que a sinalização pelo receptor B2R da BK possa estar envolvida no desenvolvimento do fenótipo ósseo dos animais mgΔloxPneo, foram gerados animais mgΔloxPneo e knockout para o receptor B2R. Os resultados mostram que o receptor B2R não interfere no desenvolvimento da cifose, sendo apenas o genótipo para Fbn1 o fator determinante para a manifestação desse fenótipo. Foi realizada a análise de RNA-seq para verificar genes e vias diferencialmente expressas que possam explicar o mecanismo de desenvolvimento do fenótipo ósseo dos animais mgΔloxPneo. Foram encontradas vias como da adesão focal, interação receptor-meio extracelular (MEC), junção ocludente, reparação por excisão de nucleotídeo e de reparação missmatch, que podem explicar alterações no metabolismo de células ósseas. Além disso, foram encontradas diferenças de expressão de genes relacionados ao metabolismo muscular esquelético, o que está de acordo com a hipótese de regulação parácrina entre o tecido muscular e ósseo, levando a uma pior estrutura óssea / Marfan syndrome (MFS) is an autosomal dominant disease that affects the connective tissue. The main clinical manifestations affect the cardiovascular, optical and bone systems. MFS is caused by mutations in the FBN1 gene, that encodes the extracellular protein fibrillin-1, a major component of microfibrils, which form elastic fibers. Studies have shown that mutations in the fibrillin-1 gene lead to an indiscriminate increase in active TGF-Β in the matrix, which results in the major phenotypes of the disease. The Renin Angiotensin System (RAS) has as its main product Angiotensin II (Ang-II), involved in bone mass regulation and TGF-Β activity. Therapeutic strategies using drugs targeting the RAS have been studied in animal models. Ramipril, an ACE inhibitor (Angiotensin-converting enzyme inhibitor, ACEi), increase Fbn1 gene expression in 35% and improve kyphosis index in the mgΔloxPneo mouse model for SMF. Its mechanism of action in bone tissue is not completely elucidated, and it may act by decreasing Ang-II production and consequent reduction in TGF-Β levels, or by inhibiting degradation of bradykinin (BK) by Ang II. BK directly activates its B2R receptor, which induces opposite physiological actions to Ang-II. This study aims to evaluate and understand the general mechanisms of bone pathogenesis in the mgΔloxPneo mouse model. We analyzed the bone phenotype of mgΔloxPneo and wildtype animals treated, or not, with Ramipril by measuring the kyphosis index (KI), micro computed tomography (μCT) and Real-time PCR (RT-PCR). We found that mutant animals showed a greater degree of kyphosis and an altered bone structure. Ramipril improved kyphosis but did not alter bone quality of mutant animals, while in wild type animals Ramipril decreased bone structure without altering KI. Therefore, the beneficial effect of Ramipril on mgΔloxPneo animals\' kyphosis is not due to an improvement in bone structure. In order to test the hypothesis where signaling through BK B2R receptor may be involved in the development of bone phenotype of mgΔloxPneo animals, a mouse model with the mgΔloxPneo mutation and knockout for B2R receptor was generated. The analysis of these animals show that the B2R receptor does not interfere with the development of kyphosis, with Fbn1 genotype as sole determinant for this phenotype manifestation. RNA-seq analysis was performed to verify differential expression of genes and altered cellular pathways, which could reveal mechanisms of bone phenotype development in mgΔloxPneo animals. Altered pathways found included focal adhesion, receptor- extracellular matrix (ECM) interaction, tight junction, nucleotide excision repair and missmatch repair, which may explain changes in bone cells metabolism. In addition, there were differences in gene expression related to skeletal muscle metabolism, which is in agreement with the paracrine regulation of bone and muscle tissue, leading to worst bone structure

A Síndrome de Marfan (MFS) é uma doença autossômica dominante do tecido conjuntivo, que acomete principalmente os sistemas esquelético, ocular e cardiovascular. O fenótipo cardiovascular, em especial o aneurisma de aorta, é responsável pela maior parte da morbi-mortalidade. MFS é resultante da mutação da fibrilina-1, uma glicoproteína que além de ser um dos principais componentes estruturais da matriz extracelular, tem como função a regulação da atividade do TGF-Beta, por meio de seu sequestro mecânico na matriz extracelular. No entanto, os mecanismos pelos quais a mutação da fibrilina-1 determina aneurismas de aorta torácica com elevada variabilidade fenotípica são ainda pouco elucidados. Um alvo central na fisiopatologia do aneurisma são células musculares lisas vasculares (VSMC), que constituem a maior porção da camada média da aorta. Por meio do controle do tônus contrátil da aorta, da estrutura do citoesqueleto e da interação com a matriz extracelular controlam a estrutura da aorta e a resposta a estímulos patológicos. Mutações que geram perda de função no aparato contrátil de VSMCs prejudicam força contrátil e respostas mecanoadaptativas. No entanto, o papel da VSMC na MFS foi pouco estudado. Neste estudo, investigamos se alterações do fenótipo de VSMCs correlacionam-se a prejuízos na geração de força e alterações em respostas biomecânicas em VSMC cultivadas a partir de aortas obtidas de camundongos com ou sem a mutação mgDeltalpn para MFS na fase inicial (3 meses) e tardia (6 meses). Aos 3 meses de evolução, detectamos importantes alterações fenotípicas nas MFS-VSMC, com maior proliferação celular e redução de alguns marcadores de diferenciação (calponina-1), porém aumento de outros (alfa-actina e SM22). Ao mesmo tempo, ocorreu mudança morfológica, com aumento da área da célula e perda do formato fusiforme. Tais alterações foram consistentes com transição para fenótipo mesenquimal, que foi confirmada pela expressão de vários marcadores. Marcadores de estresse do retículo endoplasmático (RE) aumentaram em MFS-VSMC vs. WT (wild-type) -VSMC condição basal, sem aumento pós estiramento mecânico. Correção da matriz de fibrilina-1 defeituosa em MFS-VSMC promoveu reversão de alguns aspectos do fenótipo, mas não do estresse do RE. MFS-VSMC mostra perfil protêomico divergente de WT-VSMC, em particular menor expressão de proteínas regulatórias do citoesqueleto. Importante, MFSVSMC têm reduzida capacidade de gerar força de tração quando semeadas em substrato com rigidez fisiológica e geram momento contrátil in vitro, no entanto, sem perda na capacidade de adesão. Importante, MFS-VSMC têm forte atenuação da resposta de tração a aumentos da rigidez do substrato. Em paralelo, MFS-VSMC exibem menor densidade em fibras de estresse de actina em relação às WT-VSMC. A maioria destas alterações não foram observadas aos 6 meses de evolução da doença. Os dados indicam que na fase precoce da doença, MSF-VSMC exibem mudanças fenotípicas que vão além de uma simples modulação fenotípica, com aspectos de transição mesenquimal e reduzida capacidade de geração de força tensional associada não à adesão celular, porém à menor capacidade de geração de fibras de estresse de actina. Estes mecanismos, descritos pela primeira vez, contribuir para elucidar a fisiopatologia da MFS, com alguns aspectos comuns, porém outros distintos de outras modalidades de aneurisma de aorta / Marfan Syndrome (MFS) is an autosomal dominant connective tissue disease affecting to variable extents the musculoskeletal, ocular and cardiovascular systems. Cardiovascular phenotype and in particular thoracic aorta aneurysm/dissection (TAAD), is responsible for the bulk of disease morbimortality. MFS is due to mutations in fibrillin-1, one of the main structural proteins of the extracellular matrix (ECM), which in addition regulates TGF-Beta activity by means of its physical retention in the ECM. However, mechanisms by which fibrillin-1 mutation determines TAAD with elevated phenotypic variability are yet poorly understood. Vascular smooth muscle cells (VSMC), the main component of aortic medial layer, are central targets of aneurysm pathophysiology in general. By exerting regulation of contractile tone, cytoskeletal structure and ECM interaction, VSMC control aortic structure and response to pathologic stimuli. Mutations that promote loss of VSMC contractile apparatus impair contractile function and mechanoadaptative responses and associate with distinct types of TAAD. However, the role of VSMC mechanobiology in MFS pathophysiology is poorly known. In this study, we investigated whether VSMC loss of force-generating capacity occurs in MFS and whether it associates with specific changes in cell phenotype. Biomechanical VSMC responses were assessed in cells cultured from aortas collected from mice with the mgDeltalpn MFS mutation at early (3-monthold mice, the main focus of our study) and advanced (6-month-old mice) stages of disease evolution. At 3 months of disease evolution, we detected important phenotypic alterations in MFS-VSMC, with enhanced expression of markers for cellular proliferation and lower expression of some differentiation markers (calponin-1), but, increase in others (SM alfaactin and SM22). In parallel, there were important morphologic changes, with increased VSMC area and loss of its fusiform shape. Such alterations are consistent with a transition towards a mesenchymal-like phenotype, which was confirmed through the expression of several markers. Endoplasmic reticulum (ER) stress markers increased in MFS-VSMC vs. WT (wild-type)-VSMC in basal condition, without augmentation after cyclic mechanical stretching. Replacement of defective fibrillin-1 ECM from MFS-VSMC with a normal fibroblast-derived ECM promoted reversion of some aspects of the phenotype but not of ER stress. MFS-VSMC exhibited a proteomic profile divergent from that of WT-VSMC, particularly with respect to the lower expression of cytoskeleton regulatory proteins. Importantly, MFS-VSMC displayed a lower traction force-generating capacity when seeded in ECM under physiological stiffness and generated an impaired contractile moment in this situation. In particular, MFS-VSMC depicted a strong attenuation of the traction force response to enhanced ECM stiffening. These defects did not occur as a result of lower adhesion structure and decreased adhesion capacity of MFS-VSMC. In parallel, MFS-VSMC exhibited lower density of actin stress fiber vs. WT-VSMC. With 6 months of disease evolution, several of these alterations were not detectable. Both WTVSMC and MFS-VSMC showed reduced capacity of force generation, without evidence of cell senescence. In summary, starting already in the early stages of disease evolution, MSF-VSMC display important phenotypic changes which go beyond a simple reversible phenotypic modulation, with some aspects suggesting a transition mesenchymal-like phenotype, accompanied by reduced force-generating capacity not linked to loss of cell adhesion properties but rather to impaired organization of action stress fibers. These mechanisms, described for the first time, contribute to elucidate MFS pathophysiology, depicting both some aspects in common with the pathophysiology of other types of aortic aneurysm and some aspects peculiar to MFS

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:59Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-05-26. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:40Z : No. of bitstreams: 1 Publico-068.pdf: 848593 bytes, checksum: faea7296d3b3e87c6a1212049c181df8 (MD5) / Introdução: A Síndrome de Marfan (SM) é uma doença de herança autossômica dominante decorrente de mutações no gene da fibrilina 1 no cromossomo 15, e pode apresentar manifestações esqueléticas, oculares, cardiovasculares entre outras. A velocidade de onda de pulso(VOP) é utilizada como um índice da elasticidade e rigidez arterial e está relacionada as propriedades elásticas da parede vascular. A pratica de exercício é limitada para esta população. Objetivo: Avaliar o efeito agudo de exercício submáximo em pacientes portadores de SM sem dilatação da aorta ou no máximo com dilatação leve deste vaso e o comportamento das variáveis fisiológicas. Casuística e Método: A VOP e variáveis fisiológicas foram avaliadas antes e após a realização de um esforço submáximo em 33 pacientes com SM e 18 controles. Resultados: A VOP no grupo com SM foi de 8,51±0,58 m/s no repouso e de 9,10±0,63 m/s ao final do exercício (p=0,002) e no grupo controle de 8,07±0,35 m/s no repouso e 8,98±0,56 m/s ao final (p=0,004). A análise comparativa da VOP entre os grupos controle e os pacientes com SM no repouso (p=0,519) e ao final do esforço (p=0,866) não se mostrou diferente. Os valores finais da freqüência cardíaca do grupo controle ficaram 10% acima dos indivíduos com SM (p = 0,01). A pressão arterial sistólica final foi superior no grupo controle (p=0,02). O lactato não se mostrou diferente e o tempo de exercício foi superior no grupo controle(p=0,01). Conclusão: O comportamento da distensibilidade aórtica foi semelhante, nos pacientes com SM sem ou com dilatação leve da aorta, ao grupo controle. Todavia as respostas cronotrópicas e pressóricas foram inferiores. / Purpose: Marfan syndrome is a dominant autosomal disease provoked by mutations of gene of fibrillin 1, chromosome 15, and may exhibit skeletal, ocular, cardiovascular and other manifestations. Pulse wave velocity (PWV) is used as a measure of arterial elasticity and rigidity and is related to the elastic properties of the vascular wall. As the practice of exercise is limited in this population, it was of our interest to analyze the acute effect of moderate to intensive exercise on patients with Marfan syndrome with either no dilatation of the aorta or a maximum of mild dilatation of this vessel. Methods: PWV and physiological variables were evaluated before and after the performance of sub-maximal exercise in 33 patients with Marfan syndrome and 18 controls. Results: PWV in the group with Marfan syndrome was 8.51±0.58 m/s at rest and 9.10±0.63 m/s at the end of the exercise (p=0.002); in the control group, PWV was 8.07±0.35 m/s at rest and 8.98±0.56 m/s at the end of exercise (p=0.004). The comparative analysis between groups regarding PWV at rest (p=0.519) and at the end of exercise (p=0.866) revealed no statistically significant differences. The final heart rate values in the control group were 10% higher than values in the group with Marfan syndrome (p = 0.01). Final systolic arterial pressure was higher in the control group (p=0.02). There was no difference in lactate between groups. Exercise time was greater in the control group (p=0.01). Conclusions: The behavior of aortic distensibility was similar in the patients with Marfan syndrome without or with mild dilatation of the aorta to that of the control group. The chronotropic and pressure responses were lower in patients than in control group. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações