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The HIV-1 integrase catalyzes the integration of HIV-1 viral DNA (vDNA) into the host cell chromosome in a process, which is essential for viral replication through two independent reactions, 3'-processing (3'-P) and strand transfer (ST), catalyzed by IN. Deciphering the structural determinants of the interaction between integrase and its substrates and the kinetics of this interaction sheds light on the importance of inhibitors targeting the pre-integration IN*vDNA complex. This approach led to the identification of raltegravir (RAL) and elvitegravir (ELV), which turned out to be highly efficient inhibitors of ST. RAL, formerly known under the code MK-0518, is a new anti-HIV drug that obtained clinical approval in the United States under the name IsentressTM on October 12, 2007. ELV is still in clinical trials. However, these compounds nevertheless encounter resistance phenomenon. To date, no experimental data characterizing the RAL structure, structure of the HIV-1 IN and/or interactions of RAL with its targets, has been reported.First, we characterized the structural and conformational properties of RAL in different states ‒ the gas phase, in water solution and the solid state. Second, a detailed study allowed characterisation the RAL recognition by the viral targets ‒ IN and the vDNA, before and after the 3'-P. We found that RAL shows a broad spectrum of conformations and configurations in isolated state and/or associated with the target(s). The best docking poses and scores confirmed that the model representing IN*vDNA complex is a biologically relevant target of RAL. This result is consistent with the commonly accepted mechanism of RAL inhibition.Based on the docking results we suggested that the inhibition process may include, as a first step, the RAL recognition by the processed vDNA bound to a transient intermediate IN state. RAL coupled to vDNA shows an outside orientation of all oxygen atoms, excellent putative chelating agents of Mg2+ cations, which could facilitate the insertion of RAL into the active site. The conformational flexibility of RAL further allows the accommodation/adaptation of the inhibitor in a relatively large binding pocket of IN*vDNA pre-integration complex thus producing various RAL conformation. We believe that such variety of the RAL conformations contributing alternatively to the enzyme residue recognition may impact the selection of the clinically observed alternative resistance pathways to the drug.We also studied the recognition of the HIV-1 IN inhibitors from two different strains, B and CRF02_AG. Our in silico study showed that the sequence variations between CRF02_AG and B strains did not lead to any notable difference in the structural features of the enzyme and did not impact the susceptibility to the IN inhibitors. Our analysis of the resistance mutations effects showed that structure of the wild-type enzyme and mutants is almost identical. However, the resistance mutations significantly altered the specificity of the viral DNA recognition by IN.We performed molecular dynamics simulations of the native and mutated IN with a point mutation R228A localized in the C-terminal domain. The study of targets flexibility opens a very promising way, not only in terms of fundamental research, but also for the application of our concepts to the development of new generations of inhibitors targeting IN.

Le génome des bactéries vivantes n'est pas une entité statique mais au contraire c'est quelque chose très dynamique évoluant avec le temps. Les bactéries évoluent en acquérant par transfert horizontal des gènes du matériel génétique. C'est le cas des EPEC qui ont acquis l'îlot LEE via ce mécanisme. La protéine H-NS joue un rôle important dans la reconnaissance de cet ADN étranger, dans la liaison à cet ADN et dans la répression de son expression quand ce n'est pas en profit du " fitness " de la bactérie. Comme résultat H-NS régule la majorité des gènes associés à la virulence chez les entérobactéries Salmonella, Yersinia et les EPEC. Les EPEC possèdent une protéine paralogue à H-NS et codée dans le premier opéron de leur îlot LEE, il s'agit de la protéine Ler. Une fois exprimée Ler induit l'expression des 4 opérons restant de la région parmi lesquels LEE5. Ler partage une grande homologie avec H-NS surtout au niveau de leurs domaines de reconnaissance de l'ADN. Malgré cette homologie H-NS réprime LEE5 tandis que Ler l'active. De plus si H-NS est un régulateur global agissant sur plus de 500 gènes chez E. coli Ler est une protéine spécifique qui ne va agir que sur un petit nombre de promoteurs tous impliqués dans la virulence L'étude qualitative et quantitative de l'interaction de H-NS et de Ler avec la région promotrice de LEE5 montre qu'elles partagent globalement les mêmes sites de fixation sur des régions étendues en amont et en aval du +1 de la transcription. Ces sites de fixation sont bien définis d'une dizaine de paires de bases. L'affinité de ces sites pour H-NS est variable. Trois sites de haute affinité pour H-NS ont été identifiés. La séquence de ces sites est similaire à celle du site consensus élaboré en étudiant le promoteur proU(Bouffartigues et al - 2007). Des différences dans l'interaction de ces deux protéines avec le promoteur LEE5 résident surtout autour du +1 et des boîtes -10 et -35. Il s'agit de la première étude comparant la fixation de H-NS et de Ler sur des régions étendues de ce promoteur dans le but d'expliquer la régulation différentielle de ces deux protéines paralogues. L'étude de l'expression de LEE5 in vivo nous a permis de proposer que le mécanisme essentiel d'action de Ler est dirigé contre la répression induite par H-NS et que le taux maximum d'expression du promoteur LEE5 wtobservé dans la souche mutante pour hnsen présence de Ler (en comparaison avec la souche double mutante où Ler est absente) n'est pas dû à une activation directe par Ler mais plutôt à une répression par StpA, sensible à la mutation des sites de haute affinité de H-NS.