Um grupo especial de indivíduos transplantados renais mantém a função do enxerto estável após a total retirada da terapia imunossupressora, alcançando um estado imunológico chamado de Tolerância operacional. Ainda não há marcadores moleculares e celulares que discriminem a tolerância no transplante humano, e os seus mecanismos estão sendo investigados. O perfil de peptídeos presentes na urina pode trazer informações importantes sobre o estado fisiopatológico renal. Nós investigamos se a tolerância operacional apresenta um perfil diferencial de peptídeos urinários, potencialmente, relevante para diagnóstico deste estado imunológico, assim como para a compreensão de seus mecanismos. Realizamos análises qualitativas do extrato de peptídeos da urina de indivíduos dos diferentes grupos do estudo: saudáveis (SA, n=6), tolerantes operacionais (TO, n=5), rejeição crônica (RC, n=8) e estável sob terapia imunossupressora convencional (EST, n=5), utilizando a abordagem proteômica de Shotgun. Identificamos um total de 15283 diferentes peptídeos em todos os grupos, correspondentes a 646 proteínas distintas, distribuídas nos diferentes grupos: TO = 189, RC = 296, EST = 205 e no grupo SA 219 proteínas. Observamos proteínas exclusivas dos diferentes grupos: TO teve 87 proteínas exclusivas, RC 168, EST 106 e SA 108 proteínas. Apesar das proteínas exclusivas não terem sido compartilhadas por todos os indivíduos do mesmo grupo, a totalidade dos indivíduos de cada grupo apresentou várias dessas proteínas (cada indivíduo apresentou em média 15% das proteínas exclusivas de seu grupo). Das 646 proteínas identificadas, apenas 2,3% foram classificadas pelo Gene ontology como relacionadas ao sistema imune e os compartimentos celulares mais frequentes foram: núcleo 36% e citoplasma 23%. Destacamos algumas proteínas relacionadas à resposta imune, exclusivas de alguns grupos, como no grupo TO, a C-C motif chemokine 24 (CCL24) e Endothelin-1 e no grupo RC, a beta 2 microglobulina. Essas moléculas podem ter relevância nos mecanismos imunológicos desses estados clínicos. A abordagem proteômica aplicada neste trabalho permitiu a identificação de um perfil diferencial de peptídeos na urina de cada grupo diferente de estudo. Os peptídeos urinários diferenciais e suas respectivas proteínas podem ter relevância funcional ou como biomarcadores - em relação ao estado fisiológico e às diferentes evoluções clínicas no transplante renal / A special group of renal transplant recipients maintain stable graft function after the complete withdrawal of immunosuppression, achieving a state called operational tolerance. To date, there are no cellular or molecular biomarkers to discriminate human transplantation tolerance and the underlying mechanisms are being investigated. The profile of urinary peptides may provide important information about different renal physiopathological statuses. We investigated whether operational tolerance displays a differential urinary peptide profile, potentially relevant as biomarkers or for the understanding of mechanisms involved in tolerance. We performed qualitative analysis of peptide urinary extracts in individuals from different study groups: healthy (HI, n=6), operational tolerance (OT, n=5), chronic rejection (CR, n=8) e stable under conventional immunosuppression (Sta, n=5), using Shotgun proteomics. Altogether, we identified 15283 different peptides, corresponding to 646 distinct proteins, distributed in all groups: OT = 189, CR = 296, Sta = 205, and 219 proteins in HI. Several proteins were exclusively detected in specific groups: OT showed 87 exclusive proteins, CR 168, Sta 106 and HI 108 proteins. Although the exclusive proteins were not shared by all individuals from that specific group, all individuals from each group presented several of the group-exclusive proteins (each individual presented an average of 15% of the proteins exclusive to his group). Of the 646 proteins identified, only 2.3% were classified in Gene Ontology as related to the immune system and the most frequent cellular compartments were: 36% from nucleus and 23% cytoplasmic. Of notice, some proteins related to the immune response were also group-exclusive, such as, in OT, a C-C motif chemokine 24 (CCL24) and Endothelin-1, and beta 2 microglobulin in CR. These proteins may display relevant roles in the mechanisms involved in these clinical statuses. In conclusion, the proteomic approach used in this study allowed the identification of a differential urinary peptide profile in each different study groups. The differential urinary peptides and their corresponding proteins may display a relevant role functional or as biomarkers - in the state of homeostasis and in different clinical outcomes in renal transplantation

Um grupo especial de indivíduos transplantados renais mantém a função do enxerto estável após a total retirada da terapia imunossupressora, alcançando um estado imunológico chamado de Tolerância operacional. Ainda não há marcadores moleculares e celulares que discriminem a tolerância no transplante humano, e os seus mecanismos estão sendo investigados. O perfil de peptídeos presentes na urina pode trazer informações importantes sobre o estado fisiopatológico renal. Nós investigamos se a tolerância operacional apresenta um perfil diferencial de peptídeos urinários, potencialmente, relevante para diagnóstico deste estado imunológico, assim como para a compreensão de seus mecanismos. Realizamos análises qualitativas do extrato de peptídeos da urina de indivíduos dos diferentes grupos do estudo: saudáveis (SA, n=6), tolerantes operacionais (TO, n=5), rejeição crônica (RC, n=8) e estável sob terapia imunossupressora convencional (EST, n=5), utilizando a abordagem proteômica de Shotgun. Identificamos um total de 15283 diferentes peptídeos em todos os grupos, correspondentes a 646 proteínas distintas, distribuídas nos diferentes grupos: TO = 189, RC = 296, EST = 205 e no grupo SA 219 proteínas. Observamos proteínas exclusivas dos diferentes grupos: TO teve 87 proteínas exclusivas, RC 168, EST 106 e SA 108 proteínas. Apesar das proteínas exclusivas não terem sido compartilhadas por todos os indivíduos do mesmo grupo, a totalidade dos indivíduos de cada grupo apresentou várias dessas proteínas (cada indivíduo apresentou em média 15% das proteínas exclusivas de seu grupo). Das 646 proteínas identificadas, apenas 2,3% foram classificadas pelo Gene ontology como relacionadas ao sistema imune e os compartimentos celulares mais frequentes foram: núcleo 36% e citoplasma 23%. Destacamos algumas proteínas relacionadas à resposta imune, exclusivas de alguns grupos, como no grupo TO, a C-C motif chemokine 24 (CCL24) e Endothelin-1 e no grupo RC, a beta 2 microglobulina. Essas moléculas podem ter relevância nos mecanismos imunológicos desses estados clínicos. A abordagem proteômica aplicada neste trabalho permitiu a identificação de um perfil diferencial de peptídeos na urina de cada grupo diferente de estudo. Os peptídeos urinários diferenciais e suas respectivas proteínas podem ter relevância funcional ou como biomarcadores - em relação ao estado fisiológico e às diferentes evoluções clínicas no transplante renal / A special group of renal transplant recipients maintain stable graft function after the complete withdrawal of immunosuppression, achieving a state called operational tolerance. To date, there are no cellular or molecular biomarkers to discriminate human transplantation tolerance and the underlying mechanisms are being investigated. The profile of urinary peptides may provide important information about different renal physiopathological statuses. We investigated whether operational tolerance displays a differential urinary peptide profile, potentially relevant as biomarkers or for the understanding of mechanisms involved in tolerance. We performed qualitative analysis of peptide urinary extracts in individuals from different study groups: healthy (HI, n=6), operational tolerance (OT, n=5), chronic rejection (CR, n=8) e stable under conventional immunosuppression (Sta, n=5), using Shotgun proteomics. Altogether, we identified 15283 different peptides, corresponding to 646 distinct proteins, distributed in all groups: OT = 189, CR = 296, Sta = 205, and 219 proteins in HI. Several proteins were exclusively detected in specific groups: OT showed 87 exclusive proteins, CR 168, Sta 106 and HI 108 proteins. Although the exclusive proteins were not shared by all individuals from that specific group, all individuals from each group presented several of the group-exclusive proteins (each individual presented an average of 15% of the proteins exclusive to his group). Of the 646 proteins identified, only 2.3% were classified in Gene Ontology as related to the immune system and the most frequent cellular compartments were: 36% from nucleus and 23% cytoplasmic. Of notice, some proteins related to the immune response were also group-exclusive, such as, in OT, a C-C motif chemokine 24 (CCL24) and Endothelin-1, and beta 2 microglobulin in CR. These proteins may display relevant roles in the mechanisms involved in these clinical statuses. In conclusion, the proteomic approach used in this study allowed the identification of a differential urinary peptide profile in each different study groups. The differential urinary peptides and their corresponding proteins may display a relevant role functional or as biomarkers - in the state of homeostasis and in different clinical outcomes in renal transplantation

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A indução de tolerância imunológica ao aloenxerto, no contexto clínico, permanece um grande desafio para pesquisa científica de tradução. A retirada da imunossupressão em indivíduos transplantados leva à rejeição do enxerto, na grande maioria dos casos. Entretanto, um grupo muito raro de indivíduos transplantados, chamados de tolerantes operacionais (TO), consegue manter a função estável do enxerto após a retirada dos imunossupressores. O estudo desses indivíduos pode contribuir para melhor compreensão dos mecanismos envolvidos na tolerância ao enxerto em humanos, assim como, para a determinação de biomarcadores desse estado de homeostase. Nosso objetivo foi determinar se o estado de tolerância operacional no transplante renal induz um perfil diferencial do componente humoral da resposta imune. Para tal, analisamos o perfil de reatividade de autoanticorpos dirigidos a peptídeos da proteína de choque térmico 60 (HSP60), de alo e autoanticorpos dirigidos às moléculas HLA, o repertório do receptor de células B (BCR) e o perfil funcional de células B supressoras CD19+CD24hiCD38hi (Bregs), comparativamente, nos indivíduos com: TO (n=5), Rejeição Crônica (RC, n=13), função estável do enxerto usando doses habituais de imunossupressores (Est, n=19) e nos indivíduos saudáveis (Sau, n=11). Não observamos um perfil diferencial claro de alo/autorreatividade de anticorpos dirigidos aos peptídeos da HSP60, nem às moléculas HLA, que diferenciasse os grupos do estudo. O estado de tolerância operacional apresentou uma diversidade do repertório do receptor de células B similar à observada em Sau e Est, enquanto o grupo RC teve uma menor diversidade desse repertório. Além disso, o grupo TO apresentou uma expansão de clones linfócitos B com expressão de 2 tamanhos distintos de CDR3 (de 16aa, família VH3 isotipo IgM, e de 5aa, família VH1 isotipo IgG), diferenciando-os dos grupos Sau, RC e Est (p<0,01 e p<0,05; e p<0,01, respectivamente para VH3M e VH1G). Os números de células B com fenótipo imunorregulador CD19+CD24hiCD38hi (Bregs) circulantes, no grupo TO e Sau, foram similares, enquanto o grupo RC apresentou menores números (p<0,05). Funcionalmente, após estímulo via CD40, o grupo TO teve capacidade de gerar células Breg ativadas para STAT3 semelhante ao grupo Sau, enquanto na rejeição crônica esta capacidade foi menor (p<0,05). Concluímos que o estado de tolerância operacional envolve, principalmente, a manutenção do perfil do componente imune humoral, similar ao apresentado por indivíduos saudáveis, em contraste com o estado de rejeição crônica. Além disso, o estado de tolerância foi o único que apresentou expansões expressivas de determinados tamanhos de CDR3, se destacando de todos os grupos. A expansão diferencial desses clones de células B pode ter uma relevância funcional no estado de tolerância operacional, além de potencial valor para o diagnóstico desse estado. Esses dados, em conjunto, nos indicam que a preservação do componente humoral da resposta imune desempenha um papel importante neste estado de homeostase no transplante humano / Operational tolerance in human kidney transplantation: repertoire of B lymphocytes and alo and autoantibodies Sta individuals (p<0.01 and p<0.05; and p<0.01, respectively for VH3M and VH1G). The circulating B cell numbers with the suppressive phenotype CD19+CD24hiCD38hi (Bregs) were similar between the OT and HI groups, while CR presented lower numbers (p<0.05). In addition, the OT group exhibited a similar capacity of generate activated cells for STAT3 to HI, whereas the CR group exhibited an impaired capacity (p<0.05). We conclude that the operational tolerance state involves the maintenance of the B cell compartment profile similar to the one observed in healthy individuals, in contrast with chronic rejection. In addition, the state of operational tolerance was the only one exhibiting expressive expansions of specific CDR3 lengths, which differentiated OT from all other groups. This indicates that the expansion of B cell populations expressing specific CDR3 lengths could play a relevant role in operational tolerance and may be potential biomarkers for OT. Taken together, we suggest that the preservation of the B cell component of the immune response can play an important role in this homeostatic state in human transplantation

A indução de tolerância imunológica ao aloenxerto, no contexto clínico, permanece um grande desafio para pesquisa científica de tradução. A retirada da imunossupressão em indivíduos transplantados leva à rejeição do enxerto, na grande maioria dos casos. Entretanto, um grupo muito raro de indivíduos transplantados, chamados de tolerantes operacionais (TO), consegue manter a função estável do enxerto após a retirada dos imunossupressores. O estudo desses indivíduos pode contribuir para melhor compreensão dos mecanismos envolvidos na tolerância ao enxerto em humanos, assim como, para a determinação de biomarcadores desse estado de homeostase. Nosso objetivo foi determinar se o estado de tolerância operacional no transplante renal induz um perfil diferencial do componente humoral da resposta imune. Para tal, analisamos o perfil de reatividade de autoanticorpos dirigidos a peptídeos da proteína de choque térmico 60 (HSP60), de alo e autoanticorpos dirigidos às moléculas HLA, o repertório do receptor de células B (BCR) e o perfil funcional de células B supressoras CD19+CD24hiCD38hi (Bregs), comparativamente, nos indivíduos com: TO (n=5), Rejeição Crônica (RC, n=13), função estável do enxerto usando doses habituais de imunossupressores (Est, n=19) e nos indivíduos saudáveis (Sau, n=11). Não observamos um perfil diferencial claro de alo/autorreatividade de anticorpos dirigidos aos peptídeos da HSP60, nem às moléculas HLA, que diferenciasse os grupos do estudo. O estado de tolerância operacional apresentou uma diversidade do repertório do receptor de células B similar à observada em Sau e Est, enquanto o grupo RC teve uma menor diversidade desse repertório. Além disso, o grupo TO apresentou uma expansão de clones linfócitos B com expressão de 2 tamanhos distintos de CDR3 (de 16aa, família VH3 isotipo IgM, e de 5aa, família VH1 isotipo IgG), diferenciando-os dos grupos Sau, RC e Est (p<0,01 e p<0,05; e p<0,01, respectivamente para VH3M e VH1G). Os números de células B com fenótipo imunorregulador CD19+CD24hiCD38hi (Bregs) circulantes, no grupo TO e Sau, foram similares, enquanto o grupo RC apresentou menores números (p<0,05). Funcionalmente, após estímulo via CD40, o grupo TO teve capacidade de gerar células Breg ativadas para STAT3 semelhante ao grupo Sau, enquanto na rejeição crônica esta capacidade foi menor (p<0,05). Concluímos que o estado de tolerância operacional envolve, principalmente, a manutenção do perfil do componente imune humoral, similar ao apresentado por indivíduos saudáveis, em contraste com o estado de rejeição crônica. Além disso, o estado de tolerância foi o único que apresentou expansões expressivas de determinados tamanhos de CDR3, se destacando de todos os grupos. A expansão diferencial desses clones de células B pode ter uma relevância funcional no estado de tolerância operacional, além de potencial valor para o diagnóstico desse estado. Esses dados, em conjunto, nos indicam que a preservação do componente humoral da resposta imune desempenha um papel importante neste estado de homeostase no transplante humano / Operational tolerance in human kidney transplantation: repertoire of B lymphocytes and alo and autoantibodies Sta individuals (p<0.01 and p<0.05; and p<0.01, respectively for VH3M and VH1G). The circulating B cell numbers with the suppressive phenotype CD19+CD24hiCD38hi (Bregs) were similar between the OT and HI groups, while CR presented lower numbers (p<0.05). In addition, the OT group exhibited a similar capacity of generate activated cells for STAT3 to HI, whereas the CR group exhibited an impaired capacity (p<0.05). We conclude that the operational tolerance state involves the maintenance of the B cell compartment profile similar to the one observed in healthy individuals, in contrast with chronic rejection. In addition, the state of operational tolerance was the only one exhibiting expressive expansions of specific CDR3 lengths, which differentiated OT from all other groups. This indicates that the expansion of B cell populations expressing specific CDR3 lengths could play a relevant role in operational tolerance and may be potential biomarkers for OT. Taken together, we suggest that the preservation of the B cell component of the immune response can play an important role in this homeostatic state in human transplantation

La greffe cardiaque est le traitement ultime de l’insuffisance cardiaque. Le rejet aigu pose plusieurs problématiques, en particulier sa survenue imprévisible même sous traitement immunosuppresseur, et un diagnostic histologique qui nécessite des biopsies endomyocardiques (BEM) invasives répétées, et qui souffre de nombreuses limites. Le besoin de critères diagnostiques et prédictifs, idéalement non invasifs, nous a conduits à étudier le rejet aigu de greffe cardiaque sur le plan moléculaire. Nous avons caractérisé les profils d’expression génique (PEG) myocardiques et sanguins lors de différentes phases du rejet cellulaire (RC) et du rejet médié par les anticorps (RMA), par analyse sans a priori des transcriptomes sur puce à ADN. Par une première étude des PEG myocardiques menée sur une collection historique de BEM, nous avons montré la modification des PEG tissulaires lors du RC. Pour le même grade histologique, deux profils de RC aux degrés d’activation immunitaire différents ont été identifiés. De plus, les PEG myocardiques étaient modifiés dès un mois avant la survenue d’un RC, quand l’analyse histologique ne montrait encore aucune anomalie. Par une seconde étude conduite sur une collection prospective de BEM et échantillons sanguins, nous avons confirmé les résultats de la première étude, et de plus montré l’existence de modulations des PEG également dans le sang périphérique, aussi bien pendant un épisode de RC qu’un mois avant. Enfin pour la première fois la modulation tissulaire et périphérique des PEG a été montrée dans le RMA en transplantation cardiaque. L’existence de voies modulées dans les deux types de rejet devrait conduire à la recherche de biomarqueurs. / Heart transplantation is the last treatment in case of terminal heart failure. Acute rejection after heart transplantation raises several issues due to its occurrence despite immunosuppressive therapies and the requirement of invasive and repeated endomyocardial biopsies (EMB) that have several histological grading limitations. The need of non-invasive diagnostic and predictive criteria led us to study the acute rejection of cardiac allograft using a molecular approach. We characterized myocardial and peripheral blood gene expression profiles (GEP) during acute cellular rejection (CR) and antibody-mediated rejection (AMR) by mean of microarray analyses. By a retrospective study conducted on a historical EMB collection, we first showed a strong immunologic modulation during CR. For the same CR histological grading, two transcriptional profiles were identified according to the inflammation level. Moreover, myocardial GEP modifications were observed one month before the occurrence of CR, while histological characteristics showed no abnormality. A second study conducted on a prospective collection of both EMB and peripheral blood samples confirmed the results obtained on EMB and showed peripheral blood GEP modulations during both CR and even one month earlier. Finally, we have also shown for the first time in heart transplantation, myocardial and peripheral GEP modulations in AMR. Identification of modulated pathways in both types of rejection should allow for the determination of rejection biomarkers.

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