Ein Schlüsselbefund der Parkinson-Krankheit auf zellulärer Ebene ist das Auftreten von Protein-Einschlusskörperchen, sogenannten Lewykörperchen. Der Hauptbestandteil dieser Lewykörperchen ist pathologisch aggregiertes, fibrilläres α-Synuklein, ein Protein, welches Einfluss auf präsynaptische Vesikel, Protein- und Enzymfunktionen sowie den Dopaminstoffwechsel und den axonalen Transport hat. Bis heute ungeklärt ist die Ursache der Aggregation des Proteins. Zahlreiche Forschungsaktivitäten werden in diese Richtung unternommen. Die pathologischen Mechanismen, die zur abnormen Aggregation von α-Synuklein führen, bleiben noch weitgehend unbekannt. Ein großer Teil der Literatur unterstützt die Hypothese, dass α-Synuklein bei Punktmutationen oder erhöhter Expression anfällig für Aggregationen ist und damit Neuronen geschädigt werden. Die Einzelheiten dieses sukzessiven Aggregationsprozesses und die Mechanismen, die dabei letztlich den Zelltod verursachen, bleiben unklar. Alterungsprozesse und Umweltfaktoren sind entscheidende Risikofaktoren. Obwohl es immer mehr Hinweise gibt, dass α-Synuklein-Aggregate eine wichtige pathophysiologische Rolle spielen, wird bisher noch unzulänglich verstanden, wie die für die dopaminergen Neurone toxische Wirkung entfaltet wird. Als gesicherter Pathomechanismus der Degeneration der dopaminergen Nervenzellen gilt ein erhöhter oxidativer Stress. Es wird vermutet, dass er zur Aggregation des α-Synukleins beitragen kann. Ziel dieser vorgelegten Arbeit ist es, durch die Verwendung eines geeigneten Zellkulturmodells zur Aufklärung der beschriebenen pathologischen Mechanismen beizutragen. In dieser Studie wurden zwei artifizielle Modellsubstanzen in einer dopaminergen Primärzellkultur eingesetzt, die Pestizide Rotenon und Paraquat, um die pathologischen Verhältnisse in der Substantia nigra zu simulieren. Sie erzeugen oxidativen Stress durch Hemmung der mitochondrialen Atmungskette bzw. Redoxreaktionen mit molekularem Sauerstoff, was zum dopaminergen Zelltod führt. Im Rahmen dieser Studie gelang es, beide Parkinson-Zellkulturmodelle anhand der Lokalisierung, des Aggregationsverhaltens, des Einflusses auf die Mikroglia-Aktivierung sowie des Abbaus von α-Synuklein näher zu charakterisieren. Hierzu wurde α-Synuklein durch Fluoreszenzfärbung, Westernblot und Immunpräzipitation analysiert. Eine kurzzeitige Behandlung mit hoch konzentrierten Toxinen löst eine akute Degeneration dopaminerger Neurone aus, die so nicht der des Idiopathischen Parkinsons entspricht. Beim IPS erfolgt die Degeneration über Jahre hinweg. Um auch den Einfluss der zellulären Alterung auf die α-Synuklein-Aggregation zu zeigen, wurden die in dieser Arbeit verwendeten Zellkulturen über 46 Tage kultiviert und die Pestizid-Konzentration so eingestellt, dass etwa 25-50 % der dopaminergen Neurone absterben. Es konnte gezeigt werden, dass es nach chronischer Behandlung mit dem jeweiligen Pestizid zu den verschiedenen Zeitpunkten Unterschiede in der Lokalisation sowie in der Konformation von α-Synuklein gibt. Die zum Vergleich nur bis zum Tag 11 kultivierten Zellkulturen zeigten nach kurzer Behandlung mit hochkonzentrierter Toxin-Menge eine Ansammlung von α-Synuklein im Soma, aber keine Auswanderung und Lokalisierung in und an den Neuriten, wie es nach chronischer Rotenon-Behandlung beobachtet werden konnte. Bei den Rotenon-behandelten Zellen ist ein Prozess der Verlagerung und Anhäufung des α-Synuklein aus dem Soma in die Neuriten bereits ab einem früheren Zeitpunkt zu beobachten als in den Kontrollen, welche sich aber mit zunehmendem Alter ähnlich verhalten. Außerdem konnte in den Kulturen, besonders bei den Rotenon-behandelten dopaminergen Neuronen, ein punktförmiges Verteilungsmuster und größere Ansammlungen des Proteins in den Neuriten beobachtet werden, was für eine aggregierte Form des α-Synukleins spricht. Diese Aggregate ließen sich durch die Proteo-Aggreosom-Färbung nachweisen. Auch der Nachweis von am Serin 129 phosphoryliertem α-Synuklein in diesen größeren Ansammlungen gilt als Zeichen für eine aggregierte Form. Die Beobachtung, dass α-Synuklein mit zunehmendem Kulturalter aus dem Soma in die Peripherie austritt, konnte bei der chronischen Paraquat-Behandlung so nicht getätigt werden. Unter Paraquat-Behandlung war keine Herauf-Regulierung der Gesamt-α-Synuklein Expression in der Kultur zu beobachten, wie dies sowohl bei Kontrolle als auch bei Rotenon der Fall ist. Wir vermuten im Paraquat-Modell, dass die sich im Soma ansammelnde Form von α-Synuklein durch vermehrte Einschleusung in den Zellkern zur Toxizität beitragen kann. Auch eine Interaktion von α-Synuklein mit der Zellmembran könnte unter Paraquat-Einfluss zum dopaminergen Zelltod beitragen. Durch Immunpräzipitation und Fluoreszenz-Doppelfärbung von α-Synuklein und Ubiquitin konnten wir den Abbau des fehlgefalteten α-Synukleins in der Zelle durch Ubiquitinierung nachweisen. Unter Rotenon ist ab DIV 14 eine starke Kolokalisation von α-Synuklein und Ubiquitin zu erkennen, die im Verlauf der Kultur nachlässt und nur noch in punktförmigen Aggregaten außerhalb der Zelle zu sehen ist. Unter Paraquat zeigte sich während der gesamten Kultivierung Polyubiquitinierung und Kolokalisation der beiden Proteine in der gesamten Zelle. Die Aggregationsform von α-Synuklein scheint das Proteinabbausystem durch Ubiquitinierung zu beeinflussen, da wir davon ausgehen, dass es sich bei der α-Synuklein-Konformation zu verschiedenen Zeitpunkten in den Paraquat-behandelten dopaminergen Neuronen nicht um die Aggregationsform handelt, die wir unter Rotenon beobachten konnten.

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Small extracellular vesicles (small EVs) are endogenous membrane-enclosed nanocarriers released from essentially all cells. They have been shown to carry proteins, lipids, nucleic acids to transmit biological signals throughout the body, including to the brain. Some evidence has suggested that small EVs can cross the blood-brain barrier (BBB), moving from the peripheral circulation to the central nervous system (CNS). The BBB is a dynamic barrier that regulates molecular trafficking between the peripheral circulation and the CNS. As a result, small EVs have attracted attention for their potential as a novel delivery platform for nucleic acid-based therapeutics across the BBB. Silencing RNAs (siRNAs) are a potent drug class but using “naked” siRNA is not feasible due to their short half-life, vulnerability to degradation and low penetration in cells. Despite the excitement for the development of small EV-based therapeutics, their clinical development is hampered by the lack of reliable methods for packing therapeutics into them. Reshke et al. has shown that cells can be genetically engineered to produce customizable small EVs packaged with siRNA against any protein by integrating the siRNA sequence into the pre- miR-451 structure. Mounting evidence has established that in a misfolded state, α-synuclein becomes insoluble and phosphorylated to form intracellular inclusions in neurons (known as Lewy bodies) which leads to Parkinson’s disease (PD) pathogenesis. Given that increased α-synuclein expression causes familial and idiopathic PD, decreasing its synthesis by using siRNA is an attractive therapeutic strategy. Here, we genetically engineered cells to produce small EVs packaged with siRNA against α-synuclein integrated in the pre-miR451 backbone, tested their ability to cross an in vitro BBB, and deliver its cargo to silence endogenous α-synuclein in neuron- like cells. The therapeutic potential of α-synuclein siRNA delivery by these small EVs was demonstrated by the strong mRNA (60-70%) and protein knockdown (43%) of α-synuclein in neuron-like cells. We also demonstrated that approximately at 4% and 2%, respectively of small EVs-derived from human brain endothelial cells (hCMEC/D3) and human embryonic kidney (HEK293T) were transported cross the in vitro BBB model. Interestingly, we observed that small EVs-derived from HEK293T deliver their cargo to induced brain endothelial cells (iBECs) (~74% α-synuclein mRNA reduction) but their rate of transport across BBB was lower and did not reduce α-synuclein mRNA expression in neuron-like cells, seeded on the far side of the BBB. Small EVs- derived from hCMEC/D3 reduced α-synuclein mRNA (40%) in neuron-like cells across the BBB model. This finding suggests that small EVs derived from different cell sources can undergo different intracellular trafficking routes, providing various opportunities to influence the efficiency of delivery and fate of intracellular cargo. Using small EVs-derived from hCMEC/D3, two different routes of administration, a single bolus intravenous (IV) or intra-carotid (ICD) injection, showed small EVs largely accumulated in the liver, spleen, small intestines and kidneys; and only a small amount of small EVs were detected in the brain. These results indicate that human brain endothelial cells may serve as a promising cell source for CNS treatments based on small EVs.

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<p>The proteasome is a multi-subunit protease complex responsible for most of the non-lysosomal protein turnover in eukaryotic cells. This degradation process can be conducted dependent or independent of ubiquitination as different isoforms with different substrate preferences coexist in the cell. Proteasomal activity declines during aging due to a decreased expression of proteasome subunits, complex disassembly, and oxidative stress. This malfunction leads to protein accumulation, subsequent aggregation, and ultimately diseased states. Considering the shared feature of aggregation and accumulation of intrinsically disordered proteins (IDPs) in age-related diseases, and the substrate preference of the 20S isoform for misfolded proteins, enhancing the proteolytic activity of the 20S proteasome has arisen as an attractive strategy to minimize the burden associated with this increased protein load. Recently, we identified the FDA-approved drug miconazole (MO) as a stimulator of the 20S isoform and validated its activity profile in biochemical and cell-based assays. Given its FDA-approved drug status, we considered that to successfully repurpose it, information regarding its binding location within the 20S and network of binding partners, as well as its value in protein homeostasis in age-related diseases are necessary. Herein, we (1) conduct SAR studies to determine MO’s key features responsible for proteasomal activation and obtain molecules with enhanced ability to activate the 20S proteasome; next, using the developed SAR model, we (2) design a diazirine-based photoreactive probe that allows for the identification of MO’s binding partners and location within the 20S proteasome. Lastly, we (3) explore the use of MO to restore the activity of impaired proteasomes by Parkinson’s disease-associated toxic oligomers. This work expands upon previous research avenues by using newer approaches to study this enzymatic complex, and describes methods that can be further used to better establish the role of the 20S proteasome in age-related diseases.</p>

Parkinson’s disease (PD) is the second-most common neurodegenerative disease after Alzheimer’s disease. With 500,000 individuals currently living with Parkinson’s and nearly 60,000 new cases diagnosed each year, this disease causes significant financial burden on the healthcare system - amassing to annual expenditures totaling 200 billion dollars; predicted to increase through 2050. The disease phenotype is characterized by a combination of a resting tremor, bradykinesia, muscular rigidity, and depression due to dopaminergic neuronal death in the midbrain. The cause of the neurotoxicity has been largely discussed, with strong evidence suggesting that the protein, alpha-Synuclein, is a key factor. Under native conditions, alpha-Synuclein can be found localized at synaptic terminals where it is hypothesized to be involved in vesicle trafficking and recycling. However, its biochemical profile reveals a hydrophobic region that, once subjected to insult, initiates an aggregation cascade. Oligomeric species—products of the aggregation cascade—demonstrate marked neurotoxicity in dopaminergic neurons and illustrate migratory potential to neighboring healthy neurons, thereby contributing to progressive neurodegeneration. The current golden standard for PD diagnostics is a highly qualitative system involving a process-by-elimination with accuracy that is contingent upon physician experience. This, and a lack of standardized clinical testing procedures, lends to a 25% misdiagnosis rate. Even under circumstances of an accurate PD diagnosis, the only treatment options are pharmacologics that have a wide range of adverse side effects and ultimately contribute to systemic metabolic dysfunction. Thus, the research presented in this thesis seeks to overcome these current challenges by providing (1) a quantitative diagnostic platform and (2) a biomolecular therapeutic, towards oligomeric alpha-Synuclein. Aim 1: serves as a proof-of-concept for the use of catalytic nucleic acid moieties, deoxyribozymes and aptamers, to quantify alpha-Synuclein in a novel manner and explore the ability to detect oligomeric cytotoxic species. The cost-effective nature of these sensors allows for continued optimization. Aim 2: serves to establish a potential therapy that can abrogate alpha-synuclein oligomerization and toxicity through use of a modified Protein Disulfide Isomerase (PDI) peptide when introduced to live cells treated to simulate pre-parkinsonian pathology.

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Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), including dementia with Lewy bodies (DLB), account for the majority of dementia cases worldwide. Interestingly, a significant number of patients have clinical and neuropathological features of both AD and PD, i.e., the presence of amyloid deposits and Lewy bodies in the neocortex. The identification of α-synuclein peptides in amyloid plaques in DLB brain led to the hypothesis that both peptides mutually interact with each other to facilitate neurodegeneration. In this article, we report the influence of Aβ(1-42) and pGlu-Aβ(3-42) on the aggregation of α-synuclein in vitro. The aggregation of human recombinant α-synuclein was investigated using thioflavin-T fluorescence assay. Fibrils were investigated by means of antibody conjugated immunogold followed by transmission electron microscopy (TEM). Our data demonstrate a significantly increased aggregation propensity of α-synuclein in the presence of minor concentrations of Aβ(1-42) and pGlu-Aβ(3-42) for the first time, but without effect on toxicity on mouse primary neurons. The analysis of the composition of the fibrils by TEM combined with immunogold labeling of the peptides revealed an interaction of α-synuclein and Aβ in vitro, leading to an accelerated fibril formation. The analysis of kinetic data suggests that significantly enhanced nucleus formation accounts for this effect. Additionally, co-occurrence of α-synuclein and Aβ and pGlu-Aβ, respectively, under pathological conditions was confirmed in vivo by double immunofluorescent labelings in brains of aged transgenic mice with amyloid pathology. These observations imply a cross-talk of the amyloid peptides α-synuclein and Aβ species in neurodegeneration. Such effects might be responsible for the co-occurrence of Lewy bodies and plaques in many dementia cases.

Parkinson ist eine neurodegenerative Erkrankung mit motorischen sowie nicht-motorischen Einschränkungen für die betroffenen Personen. Es wird von einer multifaktoriellen Ätiologie ausgegangen, bei der es zur Entstehung von Lewy-Körperchen kommt. Ein Hauptbestandteil dieser Körperchen ist das in Aggregaten vorliegende Protein Alpha-Synuclein (α-syn). Derartige neurodegenerative Erkrankungen wie Parkinson, Demenz mit Lewy-Körperchen sowie Multisystematrophie sind als Synucleinopathien zusammengefasst. Der durch die α-syn-Pathologie mögliche Einfluss auf die adulte Neurogenese wurde als mögliche Ursache oder zumindest als Beitrag zu den Gedächtnisstörungen genannt, die sowohl bei Patienten als auch in Tiermodellen der Parkinson-Krankheit und der Demenz mit Lewy-Körperchen (DLB) beobachtet werden. Im adulten Gehirn findet die Neurogenese einerseits in der subgranulären Zone (SGZ) des hippocampalen Gyrus dendatus (GD) und andererseits in der suventrikulären Zone des lateralen Ventrikels statt. Da Parkinson bei Tieren nicht hinreichend charakterisiert ist, ist die Verwendung eines geeigneten transgenen Mausmodells unerlässlich. Mäuse, die das Wildtyp-α-Syn unter dem Thy1-Promotor überexprimieren (Thy1-α-syn, Linie 61), zeigen frühe kognitive Defizite zusammen mit mehreren anderen charakteristischen motorischen und nicht-motorischen Symptomen. Ziel dieser Arbeit war es, die neuralen Vorläuferzellen (NVZ), Neurone und Astrogliazellen im adulten Hippocampus in der Wildtyp-Maus und dem Mausmodell Thy1-α-syn, Linie 61 zu charakterisieren, quantifizieren und zwischen dem Wildtyp und dem Mausmodell zu vergleichen. In dieser Studie wurde ein signifikanter Anstieg in der Anzahl der frühen Vorläuferzellen, d. h. der Pax6+/PCNA+ Zellen, im GD der Thy1-α-syn-Mäuse, sowohl im Alter von 6 und 16 Monaten, ermittelt. Die Anzahl der NVZ, d. h. der PCNA+ Zellen, ist in den 16, jedoch nicht in den 6, Monate alten Tieren im Vergleich zum WT signifikant erhöht. Während die Anzahl der späten Vorläuferzellen und Neurone, d. h. der Tbr2+/PCNA+ und NeuN+ Zellen, im GD der Thy1-α-syn-Mäuse im Vergleich zu den Kontrolltieren in beiden Altersgruppen nicht signifikant verändert war. Die stärkste Expression von phosphoryliertem α-syn konnte in den Regionen CA1 und CA3 gezeigt werden. Die Messung der GFAP-Pixelintensität ergab einen signifikanten Anstieg in den Hippocampusregionen CA1, SGZ, in der Molekularschicht und der polymorphzelligen Schicht in Thy1-α-syn-Mäusen im Vergleich zu den Kontrolltieren sowohl in den 6 und 16 Monate alten Tieren. Beim Vergleich der Verhältnisse von CA1 zur SGZ, Molekularschicht und polymorphzelligen Schicht zeigte sich jedoch kein Unterschied GFAP-Pixelintensität zwischen den Thy1-α-syn-Mäusen und den Kontrolltieren in beiden Altersgruppen, was auf eine Allgemeine, nicht ortsgebundene, Astrogliose in den Thy1-α-syn-Mäusen hinweist. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen eine Steigerung in der Anzahl der frühen neuralen Vorläuferzellen im adulten Hypocampus in einem Thy1-α-syn-überexprimierenden Mausmodell. Sie bilden die Grundlage für weitere Untersuchungen zur Pathogenese der PD im Tiermodell sowie zur Entdeckung wirksamer therapeutischer Maßnahmen gegen die kognitive Dysfunktion bei Morbus Parkinson und DLB.:1. Einleitung 2. Literaturübersicht 2.1 Alpha-Synuclein 2.1.1 Eigenschafften des Proteins 2.1.2 Synucleinopathien 2.2 Parkinson 2.2.1 Definition 2.2.2 Epidemiologie 2.2.3 Einteilung 2.2.4 Symptome 2.2.5 Pathogenese 2.2.6 Diagnostik 2.2.7 Therapie 2.3 Hippocampus 2.4 Neurogenese 2.4.1 Neurogenese im adulten Hippocampus 2.4.2 Neurogenese im Zusammenhang mit Synucleinopathien 2.5 Immunhistochemische Marker 2.5.1 PCNA und Ki67 2.5.2 Pax6 2.5.3 Nestin 2.5.4 Tbr2 2.5.5 NeuN und Tbr1 2.5.6 GFAP 2.6 Mausmodell 3. Publikation 3.1 Eigenanteil der Publikation 3.2 Publikation mit dem Titel: “Alpha-Synuclein Pathology Coincides With Increased Number of Early Stage Neural Progenitors in the Adult Hippocampus” 4. Diskussion 5. Zusammenfassung 6. Summary 7. Literaturverzeichnis 8. Danksagung