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Ethanol causes neurotoxicity via several mechanisms at different points in the cycle of dependence, including neuroinflammation and oxidative stress during ethanol exposure as well as excitotoxicity during ethanol withdrawal. The primary therapeutic implication is that ethanol-induced neurotoxicity requires multifunctional pharmacotherapies which reduce all mechanisms. Using an innovative pharmacological high throughput screening method on a large plant extract library we discovered flavonoids with alpha7 nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) activity. In addition to their well-known anti-inflammatory and antioxidant properties, this novel activity means they can potentially reduce excitotoxicity and therefore makes them ideal for inhibition of ethanol-induced neurotoxicity. Rhamnetin, the candidate compound, was first found to inhibit lipopolysaccharide induced inflammation in immortalized BV2 microglia, in part, via alpha7 nAChRs. We then established an in vitro model of ethanol induced-neurotoxicity using organotypic hippocampal slice cultures which incorporated both neuroinflammatory and excitotoxic components. Neuroinflammation enhanced excitotoxicity under control conditions but the reverse was observed during ethanol withdrawal. Both mechanisms are important but their interaction is not simple. Finally, rhamnetin was evaluated in this model and found to reduce neuroinflammation and excitotoxicity associated with ethanol withdrawal. In conclusion, the studies herein provide strong evidence for alpha7 nAChRs selective flavonoids as potential pharmacotherapies for the treatment of ethanol-induced neurotoxicity and further implicate neuroinflammation, excitotoxicity, and their interaction as critical mechanisms in this pathology.

Introdução: A inflamação constitui um dos fatores mais importantes da fisiopatologia da asma brônquica, caracterizada por uma resposta eosinofílica com produção de citocinas de perfil Th2. A persistência desta inflamação induz no pulmão um processo de reparo associado à redução progressiva da função pulmonar, que nem sempre é revertida pelos tratamentos disponíveis. O sistema colinérgico anti-inflamatório é descrito como um mecanismo neural que suprime a resposta imune e controla a inflamação principalmente pelo efeito da acetilcolina em receptores nicotínicos do tipo alfa7 (alfa7nAChR) encontrados em células do sistema imune. A acetilcolina (ACh) exerce um importante efeito na asma e recentemente demonstramos que a redução parcial da liberação da acetilcolina induz per se a inflamação pulmonar. Embora se saiba que os receptores muscarínicos (mAChRs) exercem um efeito pró-inflamatório e broncoconstritor na asma, a ativação de receptores nicotínicos (nAChRs) poderia ter um efeito benéfico reduzindo a inflamação pulmonar, fato demonstrado em modelos de inflamação sistêmica e aguda. O efeito da ativação do alfa7nAChR na fisiopatologia da asma ainda não está claramente elucidado. Objetivo: Investigar o efeito do tratamento com PNU-282987 (PNU), um agonista específico do alfa7nAChR, em um modelo murino de inflamação alérgica crônica das vias aéreas. Metodologia: Camundongos BALB/c foram submetidos ao protocolo de indução alérgica crônica das vias aéreas com ovoalbumina (OVA) ou salina intraperitoneal (i.p.) e posterior desafios inalatórios. A partir do 22° dia, os animais receberam diariamente tratamento com PNU ou veículo (Ve) até o 28° dia. Foram testadas três doses de PNU (0,5, 1,0 e 2,0 mg/Kg). A fim de evidenciar se o efeito obtido no tratamento com PNU era dependente do receptor alfa7nAChR, um grupo de animais foi tratado com MLA (antagonista do alfa7nAChR), previamente ao tratamento com PNU. No 29° dia do protocolo, os animais foram eutanasiados e foram avaliados o número de células inflamatórias no lavado broncoalveolar (LBA) e no sangue, os níveis de citocinas no LBA, a expressão do alfa7nAChR e mAchRs do tipo 3 (M3) e a ativação do fator de transcrição nuclear kB (NF-kB) no pulmão. O remodelamento brônquico foi avaliado por morfometria. As análises estatísticas foram realizadas por meio do programa SigmaStat (Jandel Scientific, San Rafael, CA), onde um P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Resultados: Houve expressão do alfa7nAChR e M3 no homogenato de pulmão de animais controle e sensibilizados. Determinamos por meio da redução de eosinófilos que a dose de 0,5 mg/Kg do tratamento com PNU foi a mais efetiva. Assim, observamos que o tratamento com PNU0,5 nos animais sensibilizados reduziu o número de células totais, eosinófilos, neutrófilos, macrófagos e linfócitos no LBA, assim como número de eosinófilos no sangue periférico e ao redor das vias aéreas. O tratamento com PNU reduziu os níveis de IgE no sangue e as citocinas IL-4, IL-13 e IL-17 no LBA. Todos estes efeitos foram revertido com o pré-tratamento com MLA, exceto para a citocina IL-17. Alem disso, o tratamento com PNU reduziu o remodelamento brônquico (área de edema, de epitélio e de músculo liso e deposição de fibras colágenas) assim como o número de células positivas para MMP-9 e TIMP-1 ao redor das vias aéreas. No pulmão a expressão do p-65-NF-kB, STAT3 fosforilado e o SOCS3 foram inibidas pelo PNU. Conclusão: Estes dados claramente demonstram que o alfa7nAChR está envolvido no controle da resposta inflamatória pulmonar alérgica e de remodelamento brônquico em modelo experimental de asma alérgica e portanto é um novo alvo com potencial terapêutico a ser explorado na fisiopatologia da asma brônquica / Background: Inflammation is one of the most important features in asthma pathophysiology, characterized by eosinophilic response with production of Th2 cytokine profile. The persistence of this inflammation can induce a lung repair process associated with a progressive reduction in lung function, which is not always reversed by available treatments. The anti-inflammatory cholinergic system was described as a neural mechanism that suppresses the immune response and controls inflammation mainly by the activaction of acetylcholine alfa7 nicotinic receptors (alfa7nAChR) found on immune cells. Acetylcholine (ACh) is an important mediator in asthma and we recently demonstrated that partial reduction on ACh release induced lung inflammation per se. Although it is known that muscarinic receptors (mAChRs) has a pro-inflammatory action and causes bronchoconstriction in asthma, the activation of nicotinic receptors (nAChRs) could have a beneficial effect reducing pulmonary inflammation as demonstrated in models of acute and systemic inflammation. The effects of alfa7nAChR activation in the pathophysiology of asthma have not been clearly elucidated. Aim: To investigate the effects of PNU- 282987 (PNU) treatment, a specific alfa7nAChR agonist, in a murine model of chronic allergic airway inflammation. Methods: BALB/c mice were subjected to a protocol of chronic allergic inflammation induced by intraperitoneal ovalbumin (OVA) or saline and subsequent challenges with inhalation. From the 22th day, the animals daily received PNU or vehicle (Ve) until the 28th day. PNU were tested in three differents doses (0.5, 1.0 and 2.0 mg/kg). In order to demonstrate that the effects obtained by PNU treatment was dependent on alfa7nAChR, a group of animals was treated with MLA (antagonist of alfa7nAChR) prior to the PNU treatment. On the 29th day of the protocol, the animals were euthanised and the number of inflammatory cells in the bronchoalveolar lavage fluid(BALF) fluid and blood, cytokine levels in BALF, the expression of alfa7nAChR and mAChRs type 3 (M3), and activation of nuclear transcription factor kB (NF-kB) in the lung were evaluated. Bronchial remodeling was assessed by morfometric methods. Statistical analyses were performed using the SigmaStat (Jandel Scientific, San Rafael, CA) and P < 0.05 is considered statistically significant. Results: ?7nAChR and M3 expression was detected in control and sensitized lung homogenate. The most effective dose of PNU treatment was 0.5 mg/kg evaluated by the effects on eosinophil reduction. Thus, we observed that treatment with PNU0,5 reduced the number of total cells, eosinophils, neutrophils, macrophages and lymphocytes in BALF, as well as number of eosinophils in peripheral blood and around the airways of sensitized animals. The treatment with PNU also reduced IgE levels in the blood, and cytokines IL-4, IL-13 and IL-17 in BALF. All these effects were reversed by pretreatment with MLA, except for IL-17 cytokine. Furthermore, treatment with PNU reduced bronchial remodeling (edema, epithelium and smooth muscle area and airway collagen deposition) as well as the number of positive cells for MMP-9 and TIMP-1 around the airways. The lung p-65-NF-kB, phosphorylated STAT3 and the SOCS3 expression were inhibited by PNU-282987. Conclusion: These data clearly demonstrate that the alfa7nAChR is involved in the control of allergic pulmonary inflammatory response and in bronchial remodeling in an experimental model of allergic asthma and it can be a new target with therapeutic potential to be explored in the pathophysiology of asthma

Introdução: A inflamação constitui um dos fatores mais importantes da fisiopatologia da asma brônquica, caracterizada por uma resposta eosinofílica com produção de citocinas de perfil Th2. A persistência desta inflamação induz no pulmão um processo de reparo associado à redução progressiva da função pulmonar, que nem sempre é revertida pelos tratamentos disponíveis. O sistema colinérgico anti-inflamatório é descrito como um mecanismo neural que suprime a resposta imune e controla a inflamação principalmente pelo efeito da acetilcolina em receptores nicotínicos do tipo alfa7 (alfa7nAChR) encontrados em células do sistema imune. A acetilcolina (ACh) exerce um importante efeito na asma e recentemente demonstramos que a redução parcial da liberação da acetilcolina induz per se a inflamação pulmonar. Embora se saiba que os receptores muscarínicos (mAChRs) exercem um efeito pró-inflamatório e broncoconstritor na asma, a ativação de receptores nicotínicos (nAChRs) poderia ter um efeito benéfico reduzindo a inflamação pulmonar, fato demonstrado em modelos de inflamação sistêmica e aguda. O efeito da ativação do alfa7nAChR na fisiopatologia da asma ainda não está claramente elucidado. Objetivo: Investigar o efeito do tratamento com PNU-282987 (PNU), um agonista específico do alfa7nAChR, em um modelo murino de inflamação alérgica crônica das vias aéreas. Metodologia: Camundongos BALB/c foram submetidos ao protocolo de indução alérgica crônica das vias aéreas com ovoalbumina (OVA) ou salina intraperitoneal (i.p.) e posterior desafios inalatórios. A partir do 22° dia, os animais receberam diariamente tratamento com PNU ou veículo (Ve) até o 28° dia. Foram testadas três doses de PNU (0,5, 1,0 e 2,0 mg/Kg). A fim de evidenciar se o efeito obtido no tratamento com PNU era dependente do receptor alfa7nAChR, um grupo de animais foi tratado com MLA (antagonista do alfa7nAChR), previamente ao tratamento com PNU. No 29° dia do protocolo, os animais foram eutanasiados e foram avaliados o número de células inflamatórias no lavado broncoalveolar (LBA) e no sangue, os níveis de citocinas no LBA, a expressão do alfa7nAChR e mAchRs do tipo 3 (M3) e a ativação do fator de transcrição nuclear kB (NF-kB) no pulmão. O remodelamento brônquico foi avaliado por morfometria. As análises estatísticas foram realizadas por meio do programa SigmaStat (Jandel Scientific, San Rafael, CA), onde um P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Resultados: Houve expressão do alfa7nAChR e M3 no homogenato de pulmão de animais controle e sensibilizados. Determinamos por meio da redução de eosinófilos que a dose de 0,5 mg/Kg do tratamento com PNU foi a mais efetiva. Assim, observamos que o tratamento com PNU0,5 nos animais sensibilizados reduziu o número de células totais, eosinófilos, neutrófilos, macrófagos e linfócitos no LBA, assim como número de eosinófilos no sangue periférico e ao redor das vias aéreas. O tratamento com PNU reduziu os níveis de IgE no sangue e as citocinas IL-4, IL-13 e IL-17 no LBA. Todos estes efeitos foram revertido com o pré-tratamento com MLA, exceto para a citocina IL-17. Alem disso, o tratamento com PNU reduziu o remodelamento brônquico (área de edema, de epitélio e de músculo liso e deposição de fibras colágenas) assim como o número de células positivas para MMP-9 e TIMP-1 ao redor das vias aéreas. No pulmão a expressão do p-65-NF-kB, STAT3 fosforilado e o SOCS3 foram inibidas pelo PNU. Conclusão: Estes dados claramente demonstram que o alfa7nAChR está envolvido no controle da resposta inflamatória pulmonar alérgica e de remodelamento brônquico em modelo experimental de asma alérgica e portanto é um novo alvo com potencial terapêutico a ser explorado na fisiopatologia da asma brônquica / Background: Inflammation is one of the most important features in asthma pathophysiology, characterized by eosinophilic response with production of Th2 cytokine profile. The persistence of this inflammation can induce a lung repair process associated with a progressive reduction in lung function, which is not always reversed by available treatments. The anti-inflammatory cholinergic system was described as a neural mechanism that suppresses the immune response and controls inflammation mainly by the activaction of acetylcholine alfa7 nicotinic receptors (alfa7nAChR) found on immune cells. Acetylcholine (ACh) is an important mediator in asthma and we recently demonstrated that partial reduction on ACh release induced lung inflammation per se. Although it is known that muscarinic receptors (mAChRs) has a pro-inflammatory action and causes bronchoconstriction in asthma, the activation of nicotinic receptors (nAChRs) could have a beneficial effect reducing pulmonary inflammation as demonstrated in models of acute and systemic inflammation. The effects of alfa7nAChR activation in the pathophysiology of asthma have not been clearly elucidated. Aim: To investigate the effects of PNU- 282987 (PNU) treatment, a specific alfa7nAChR agonist, in a murine model of chronic allergic airway inflammation. Methods: BALB/c mice were subjected to a protocol of chronic allergic inflammation induced by intraperitoneal ovalbumin (OVA) or saline and subsequent challenges with inhalation. From the 22th day, the animals daily received PNU or vehicle (Ve) until the 28th day. PNU were tested in three differents doses (0.5, 1.0 and 2.0 mg/kg). In order to demonstrate that the effects obtained by PNU treatment was dependent on alfa7nAChR, a group of animals was treated with MLA (antagonist of alfa7nAChR) prior to the PNU treatment. On the 29th day of the protocol, the animals were euthanised and the number of inflammatory cells in the bronchoalveolar lavage fluid(BALF) fluid and blood, cytokine levels in BALF, the expression of alfa7nAChR and mAChRs type 3 (M3), and activation of nuclear transcription factor kB (NF-kB) in the lung were evaluated. Bronchial remodeling was assessed by morfometric methods. Statistical analyses were performed using the SigmaStat (Jandel Scientific, San Rafael, CA) and P < 0.05 is considered statistically significant. Results: ?7nAChR and M3 expression was detected in control and sensitized lung homogenate. The most effective dose of PNU treatment was 0.5 mg/kg evaluated by the effects on eosinophil reduction. Thus, we observed that treatment with PNU0,5 reduced the number of total cells, eosinophils, neutrophils, macrophages and lymphocytes in BALF, as well as number of eosinophils in peripheral blood and around the airways of sensitized animals. The treatment with PNU also reduced IgE levels in the blood, and cytokines IL-4, IL-13 and IL-17 in BALF. All these effects were reversed by pretreatment with MLA, except for IL-17 cytokine. Furthermore, treatment with PNU reduced bronchial remodeling (edema, epithelium and smooth muscle area and airway collagen deposition) as well as the number of positive cells for MMP-9 and TIMP-1 around the airways. The lung p-65-NF-kB, phosphorylated STAT3 and the SOCS3 expression were inhibited by PNU-282987. Conclusion: These data clearly demonstrate that the alfa7nAChR is involved in the control of allergic pulmonary inflammatory response and in bronchial remodeling in an experimental model of allergic asthma and it can be a new target with therapeutic potential to be explored in the pathophysiology of asthma

A sepse causa uma alta taxa de mortalidade no mundo. A fisiopatologia da doença envolve uma rede complexa de mediadores inflamatórios que promovem a lesão de diversos tecidos, além de diversas alterações hemodinâmicas e disfunção do sistema nervoso autonômico (SNA). Assim sabe-se que o sistema nervoso cumpre um papel importante no controle da inflamação sistêmica mediante a via colinérgica anti-inflamatória (VCA) através do receptor nicotínico de acetilcolina alfa7 (alfa7nAChR). O uso das células-tronco mesenquimais (CTM) tem mostrado efeitos benéficos em diversos ensaios clínicos de doenças inflamatórias. Neste contexto, as células-tronco mesenquimais derivadas da geleia de Wharton do cordão umbilical (CTM-GW) tornam-se promissórias, uma vez que essas células são reconhecidas pela regulação da resposta imunológica, reparação neural, efeito anti-apoptose, assim como a melhora da sobrevida na sepse, em modelos experimentais. Nossa hipótese foi de que as CTM-GW poderiam cumprir um papel neuroimunomodulador através da VCA e atenuar a disfunção de múltiplos órgãos em um modelo animal de sepse de ligadura e punção do ceco (LPC). Inicialmente células da matriz do cordão umbilical foram isoladas e caracterizadas de acordo com o consenso internacional vigente. Ratos Wistar machos adultos foram subdivididos em grupos: 1) sham (operação simulada); 2) LPC; 3) LPC+CTM-GW (injetado 106 CTM-GW via intraperitoneal, i.p. 6 h após LPC) e 4) LPC+MLA+CTM-GW (MLA: Metillicaconitine, antagonista do alfa7nAChR, i.p., 5:30 h após LPC e 106 CTM-GW 6h após). Às 24 horas após LPC, foram avaliadas a função cardiovascular, hemodinâmica assim como os outros parâmetros. Interessantemente, o tratamento com CTM-GW na sepse atenuou a disfunção diastólica e protegeu a sensibilidade baroreflexa. Além disso, as CTM-GW estimularam a atividade autonômica, simpática e parassimpática no coração. Observamos que o tratamento celular induziu uma regulação da expressão do receptor alfa7nAChR e TLR4 no baço e no coração, assim como a redução da relação p-STAT3TYR705 e STAT3 total no baço. Outros efeitos importantes e adicionais foram a diminuição da infiltração de leucócitos e a regulação das citocinas pró-inflamatórias pelas células. O bloqueio da VCA usando MLA confirmou que o receptor alfa7nAChR pode ser um provável alvo, chave da ação das CTM entre vários outros mecanismos envolvidos na resposta imune. Finalmente, as CTM-GW conseguiram reduzir a apoptose no pulmão e no baço independentemente da VAC reforçando o conceito de que as células-tronco tem efeitos diversos além da imuno-regulação. Em conclusão, as CTM-GW na sepse foram capazes de atenuar a lesão cardiopulmonar assim como modular a atividade autonômica, reduzindo a inflamação sistêmica, pelo menos em parte, através da via colinérgica anti-inflamatória. Indubitavelmente todos estes efeitos anteriormente descritos e em associação se demonstraram fundamentais no mecanismo de reparo e proteção tecidual em resposta a sepse. Mais estudos pré-clínicos e futuros testes clínicos precisam ser realizados para maior compreensão destes mecanismos bem como uma possível validação terapêutica / Sepsis induces organ dysfunction due to overexpression of the inflammatory host response, involving cardiorespiratory and autonomic dysregulation, thus increasing the associated morbidity and mortality. The cholinergic anti-inflammatory pathway (CAP) is mediated by nervous system through alpha7 nicotinic acetylcholine receptor (alpha7nAChR). This receptor has an important role in systemic inflammation control. Wharton\'s jelly-derived mesenchymal stem cells (WJ-MSCs) are known to express genes and secreted factors related to neurological and immunological protection, as well as to improve survival in experimental sepsis. We hypothesized that WJ-MSCs play a modulatory role through the CAP and attenuate sepsis-induced organ injury in a cecal ligation and puncture (CLP) model. Rats were randomly divided into 4 groups: 1) Control (sham-operated); 2) submitted to CLP without treatment; 3) submitted to CLP and treated with 106 WJ-MSCs 6 h later and 4) CLP+MLA+WJ-MSC group (MLA: Methyllycaconitine, alpha7nAChR antagonist). All experiments were performed 24 h post-surgery. Echocardiographic parameters and heart rate variability were assessed. Importantly, treatment with WJ-MSCs attenuated diastolic heart failure and recovered barorreflex sensitivity. Moreover, WJ-MSCs injection increased cardiac sympathetic and cardiovagal activity. In cardiac and splenic tissue, WJ-MSC treatment downregulated TLR4 and alpha7nAChR expression, as well as it reduced p-STAT3/Total STAT3 ratio in the spleen. In addition, WJ-MSC reduced leukocyte infiltration and pro-inflammatory cytokines, which only were abolished by MLA treatment. Finally, WJ-MSC treatment diminished apoptosis in lung and spleen tissue. Together these findings suggest that treatment with WJ-MSCs appears to protect against sepsis-induced organ injury reducing systemic inflammation, at least in part, through cholinergic anti-inflammatory pathway

A lesão pulmonar aguda (LPA) é caracterizada por inflamação pulmonar de início súbito com recrutamento de polimorfonucleares e liberação de mediadores próinflamatórios. É uma condição grave que evolui com óbito em aproximadamente 40% dos casos. Diversos estudos que elucidaram a fisiopatologia da LPA, o tratamento ainda é insatisfatório. O sistema colinérgico anti-inflamatório foi descrito no pulmão e está relacionado a um reflexo via nervo vago que inibe a liberação de citocinas inflamatórias por efeitos relacionados a ação da acetilcolina em receptores nicotínicos. Nossa hipótese é de que a redução de VAChT, que está relacionada ao déficit na liberação de ACh, module a resposta inflamatória pulmonar em modelo de LPS. Objetivo: 1. Avaliar se a deficiência de VAChT modula a resposta pulmonar em animais geneticamente modificados; 2. Avaliar se a deficiência colinérgica induzida por redução de VAChT está envolvida na resposta pulmonar ao LPS e elucidar alguns mecanismos envolvidos; 3. Avaliar o potencial terapêutico do PNU, um agonista de alfa7nAChR nas alterações funcionais e histopatológicas em modelo de LPA em animais C57Bl6. Metodologia: Foram utilizados camundongos machos geneticamente modificados mutante (VAChT KDHOM) ou selvagem (WT) e C57BL/6. Inicialmente avaliamos a função pulmonar e a histopatologia pulmonar em animais VAChT KDHOM. Após, animais WT e VAChT KDHOM receberam instilação intranasal de LPS ou salina e a resposta inflamatória foi avaliada de 1,5h até 72 horas após. Ainda, foi avaliado a resposta pulmonar em VAChT KDHOM e WT após a instilação de LPS intraperitoneal. Por fim, animais C57BL/6 instilados com LPS intranasal, receberam tratamento prévio ou após com PNU, agonista do receptor nicotínico alfa7. Resultados: Animais mutante apresentaram maior quantidade de células recuperadas no lavado bronco alveolar (LBA) e aumento de citocinas próinflamatórias, aumento de edema peribrônquico e piora da função pulmonar. Ainda, observamos aumento da expressão de NF-kB e redução de JAK2. A deficiência de VAChT induziu aumento de células inflamatórias em animais que receberam LPS somente em 1.5h após a indução, sendo os valores iguais ao dos animais WT em 24 e 72 horas. Nos animais WT, o estimulo do receptor nicotínico melhora a inflamação, enquanto o estímulo de receptores muscarínicos parece contribuir com a piora da resposta da inflamação pulmonar. Os efeitos do PNU parecem que dependem da via colinérgica intacta, uma vez que esta droga não teve o mesmo efeito em animais mutante. Entretanto, o tratamento com PNU em animais C57BL/6 reduziu a inflamação, a produção de citocinas, a deposição de colágeno no tecido pulmonar e os níveis de MMP-2, MMP-9 e TIMP-1, melhorando a função pulmonar. Estes efeitos parecem estar associados a redução de macrófagos perfil M1, e a inibição de NF-kB. Conclusão: Estes dados claramente demonstram que o sistema colinérgico anti-inflamatório está envolvido no controle da resposta inflamatória pulmonar, seja na manutenção da homeostasia ou ainda nas fases iniciais do desenvolvimento da LPA. Ainda, está claro que o estímulo de receptores nicotínicos tem grande potencial como alvo terapêutico a ser explorado na SDRA / Acute lung injury (ALI) is characterized by acute lung inflammation with recruitment of polymorphonuclear and release of proinflammatory mediators. It is a severe condition since leads to death 40% of the cases. Several studies have elucidated the pathophysiology of ALI, however the treatment is still unsatisfactory. The anti-inflammatory cholinergic system was described in the lung and is related to a vagal nerve reflex that inhibits the release of inflammatory cytokines by the action o ACh on nicotinic receptors. Our hypothesis is that the VAChT reduction, which is related to the deficit in the release of ACh, modulates the pulmonary inflammatory response in a model of LPS. Aim: 1. To assess whether VAChT deficiency modulates the pulmonary response in genetically modified animals; 2. Assess whether cholinergic deficiency induced reduction VAChT is involved in pulmonary response to LPS and elucidate some mechanisms involved; 3. To evaluate the therapeutic potential of PNU, an agonist alfa7nAChR, in functional and histological changes in C57BL6 mice with LPA. Methods: Mutant genetically modified male mice (VAChT KDHOM) or wild (WT) and C57BL/6 were used. First, we evaluated lung function and lung histopathology in VAChT KDHOM animals. After, WT animals and VAChT KDHOM received intranasal instillation of LPS or saline and the inflammatory response was assessed 1.5 hours to 72 hours. Moreover, the pulmonary response was evaluated in WT and VAChT KDHOM after instillation of LPS intraperitoneally. Finally, C57BL6 instilled with intranasal LPS received prior or post-treatment with PNU, an alfa7 nicotinic receptor agonist. Results: Mutant animals had higher number of cells recovered in brochoalveolar lavage (BAL) and increased pro-inflammatory cytokines, peribronchial edema and worsening of lung function. Still, there was an increase of NF_kB expression and reduction of JAK2. The VAChT deficiency induced increase in inflammatory cells in animals receiving LPS only 1.5h after the LPS instilation, and the values were similar to WT in 24 and 72 hours. In WT mice, the stimulation of the nicotinic receptor improves inflammation, while the stimulation of muscarinic receptors appears to contribute to the worsening of the pulmonary inflammatory response. The effects of PNU seem to depend on the intact cholinergic pathway, since this drug had no effects on mutant animals. However, treatment with PNU in C57BL6 reduced pulmonar inflammation, cytokine production, collagen deposition in lung tissue and the levels of MMP-2, MMP-9 and TIMP-1, improving pulmonary function. These effects appear to be associated with reduced profile M1 macrophages and the inhibition of NF-kB. Conclusion: These data clearly demonstrate that the anti-inflammatory cholinergic system is involved in the control of lung inflammatory response, both to maintain the lung homeostasis or in the early stages of the development of ALI. Finally, it is clear that the stimulation of nicotinic receptors has great potential as a therapeutic target to be explored in ARDS

A lesão pulmonar aguda (LPA) é caracterizada por inflamação pulmonar de início súbito com recrutamento de polimorfonucleares e liberação de mediadores próinflamatórios. É uma condição grave que evolui com óbito em aproximadamente 40% dos casos. Diversos estudos que elucidaram a fisiopatologia da LPA, o tratamento ainda é insatisfatório. O sistema colinérgico anti-inflamatório foi descrito no pulmão e está relacionado a um reflexo via nervo vago que inibe a liberação de citocinas inflamatórias por efeitos relacionados a ação da acetilcolina em receptores nicotínicos. Nossa hipótese é de que a redução de VAChT, que está relacionada ao déficit na liberação de ACh, module a resposta inflamatória pulmonar em modelo de LPS. Objetivo: 1. Avaliar se a deficiência de VAChT modula a resposta pulmonar em animais geneticamente modificados; 2. Avaliar se a deficiência colinérgica induzida por redução de VAChT está envolvida na resposta pulmonar ao LPS e elucidar alguns mecanismos envolvidos; 3. Avaliar o potencial terapêutico do PNU, um agonista de alfa7nAChR nas alterações funcionais e histopatológicas em modelo de LPA em animais C57Bl6. Metodologia: Foram utilizados camundongos machos geneticamente modificados mutante (VAChT KDHOM) ou selvagem (WT) e C57BL/6. Inicialmente avaliamos a função pulmonar e a histopatologia pulmonar em animais VAChT KDHOM. Após, animais WT e VAChT KDHOM receberam instilação intranasal de LPS ou salina e a resposta inflamatória foi avaliada de 1,5h até 72 horas após. Ainda, foi avaliado a resposta pulmonar em VAChT KDHOM e WT após a instilação de LPS intraperitoneal. Por fim, animais C57BL/6 instilados com LPS intranasal, receberam tratamento prévio ou após com PNU, agonista do receptor nicotínico alfa7. Resultados: Animais mutante apresentaram maior quantidade de células recuperadas no lavado bronco alveolar (LBA) e aumento de citocinas próinflamatórias, aumento de edema peribrônquico e piora da função pulmonar. Ainda, observamos aumento da expressão de NF-kB e redução de JAK2. A deficiência de VAChT induziu aumento de células inflamatórias em animais que receberam LPS somente em 1.5h após a indução, sendo os valores iguais ao dos animais WT em 24 e 72 horas. Nos animais WT, o estimulo do receptor nicotínico melhora a inflamação, enquanto o estímulo de receptores muscarínicos parece contribuir com a piora da resposta da inflamação pulmonar. Os efeitos do PNU parecem que dependem da via colinérgica intacta, uma vez que esta droga não teve o mesmo efeito em animais mutante. Entretanto, o tratamento com PNU em animais C57BL/6 reduziu a inflamação, a produção de citocinas, a deposição de colágeno no tecido pulmonar e os níveis de MMP-2, MMP-9 e TIMP-1, melhorando a função pulmonar. Estes efeitos parecem estar associados a redução de macrófagos perfil M1, e a inibição de NF-kB. Conclusão: Estes dados claramente demonstram que o sistema colinérgico anti-inflamatório está envolvido no controle da resposta inflamatória pulmonar, seja na manutenção da homeostasia ou ainda nas fases iniciais do desenvolvimento da LPA. Ainda, está claro que o estímulo de receptores nicotínicos tem grande potencial como alvo terapêutico a ser explorado na SDRA / Acute lung injury (ALI) is characterized by acute lung inflammation with recruitment of polymorphonuclear and release of proinflammatory mediators. It is a severe condition since leads to death 40% of the cases. Several studies have elucidated the pathophysiology of ALI, however the treatment is still unsatisfactory. The anti-inflammatory cholinergic system was described in the lung and is related to a vagal nerve reflex that inhibits the release of inflammatory cytokines by the action o ACh on nicotinic receptors. Our hypothesis is that the VAChT reduction, which is related to the deficit in the release of ACh, modulates the pulmonary inflammatory response in a model of LPS. Aim: 1. To assess whether VAChT deficiency modulates the pulmonary response in genetically modified animals; 2. Assess whether cholinergic deficiency induced reduction VAChT is involved in pulmonary response to LPS and elucidate some mechanisms involved; 3. To evaluate the therapeutic potential of PNU, an agonist alfa7nAChR, in functional and histological changes in C57BL6 mice with LPA. Methods: Mutant genetically modified male mice (VAChT KDHOM) or wild (WT) and C57BL/6 were used. First, we evaluated lung function and lung histopathology in VAChT KDHOM animals. After, WT animals and VAChT KDHOM received intranasal instillation of LPS or saline and the inflammatory response was assessed 1.5 hours to 72 hours. Moreover, the pulmonary response was evaluated in WT and VAChT KDHOM after instillation of LPS intraperitoneally. Finally, C57BL6 instilled with intranasal LPS received prior or post-treatment with PNU, an alfa7 nicotinic receptor agonist. Results: Mutant animals had higher number of cells recovered in brochoalveolar lavage (BAL) and increased pro-inflammatory cytokines, peribronchial edema and worsening of lung function. Still, there was an increase of NF_kB expression and reduction of JAK2. The VAChT deficiency induced increase in inflammatory cells in animals receiving LPS only 1.5h after the LPS instilation, and the values were similar to WT in 24 and 72 hours. In WT mice, the stimulation of the nicotinic receptor improves inflammation, while the stimulation of muscarinic receptors appears to contribute to the worsening of the pulmonary inflammatory response. The effects of PNU seem to depend on the intact cholinergic pathway, since this drug had no effects on mutant animals. However, treatment with PNU in C57BL6 reduced pulmonar inflammation, cytokine production, collagen deposition in lung tissue and the levels of MMP-2, MMP-9 and TIMP-1, improving pulmonary function. These effects appear to be associated with reduced profile M1 macrophages and the inhibition of NF-kB. Conclusion: These data clearly demonstrate that the anti-inflammatory cholinergic system is involved in the control of lung inflammatory response, both to maintain the lung homeostasis or in the early stages of the development of ALI. Finally, it is clear that the stimulation of nicotinic receptors has great potential as a therapeutic target to be explored in ARDS

A sepse causa uma alta taxa de mortalidade no mundo. A fisiopatologia da doença envolve uma rede complexa de mediadores inflamatórios que promovem a lesão de diversos tecidos, além de diversas alterações hemodinâmicas e disfunção do sistema nervoso autonômico (SNA). Assim sabe-se que o sistema nervoso cumpre um papel importante no controle da inflamação sistêmica mediante a via colinérgica anti-inflamatória (VCA) através do receptor nicotínico de acetilcolina alfa7 (alfa7nAChR). O uso das células-tronco mesenquimais (CTM) tem mostrado efeitos benéficos em diversos ensaios clínicos de doenças inflamatórias. Neste contexto, as células-tronco mesenquimais derivadas da geleia de Wharton do cordão umbilical (CTM-GW) tornam-se promissórias, uma vez que essas células são reconhecidas pela regulação da resposta imunológica, reparação neural, efeito anti-apoptose, assim como a melhora da sobrevida na sepse, em modelos experimentais. Nossa hipótese foi de que as CTM-GW poderiam cumprir um papel neuroimunomodulador através da VCA e atenuar a disfunção de múltiplos órgãos em um modelo animal de sepse de ligadura e punção do ceco (LPC). Inicialmente células da matriz do cordão umbilical foram isoladas e caracterizadas de acordo com o consenso internacional vigente. Ratos Wistar machos adultos foram subdivididos em grupos: 1) sham (operação simulada); 2) LPC; 3) LPC+CTM-GW (injetado 106 CTM-GW via intraperitoneal, i.p. 6 h após LPC) e 4) LPC+MLA+CTM-GW (MLA: Metillicaconitine, antagonista do alfa7nAChR, i.p., 5:30 h após LPC e 106 CTM-GW 6h após). Às 24 horas após LPC, foram avaliadas a função cardiovascular, hemodinâmica assim como os outros parâmetros. Interessantemente, o tratamento com CTM-GW na sepse atenuou a disfunção diastólica e protegeu a sensibilidade baroreflexa. Além disso, as CTM-GW estimularam a atividade autonômica, simpática e parassimpática no coração. Observamos que o tratamento celular induziu uma regulação da expressão do receptor alfa7nAChR e TLR4 no baço e no coração, assim como a redução da relação p-STAT3TYR705 e STAT3 total no baço. Outros efeitos importantes e adicionais foram a diminuição da infiltração de leucócitos e a regulação das citocinas pró-inflamatórias pelas células. O bloqueio da VCA usando MLA confirmou que o receptor alfa7nAChR pode ser um provável alvo, chave da ação das CTM entre vários outros mecanismos envolvidos na resposta imune. Finalmente, as CTM-GW conseguiram reduzir a apoptose no pulmão e no baço independentemente da VAC reforçando o conceito de que as células-tronco tem efeitos diversos além da imuno-regulação. Em conclusão, as CTM-GW na sepse foram capazes de atenuar a lesão cardiopulmonar assim como modular a atividade autonômica, reduzindo a inflamação sistêmica, pelo menos em parte, através da via colinérgica anti-inflamatória. Indubitavelmente todos estes efeitos anteriormente descritos e em associação se demonstraram fundamentais no mecanismo de reparo e proteção tecidual em resposta a sepse. Mais estudos pré-clínicos e futuros testes clínicos precisam ser realizados para maior compreensão destes mecanismos bem como uma possível validação terapêutica / Sepsis induces organ dysfunction due to overexpression of the inflammatory host response, involving cardiorespiratory and autonomic dysregulation, thus increasing the associated morbidity and mortality. The cholinergic anti-inflammatory pathway (CAP) is mediated by nervous system through alpha7 nicotinic acetylcholine receptor (alpha7nAChR). This receptor has an important role in systemic inflammation control. Wharton\'s jelly-derived mesenchymal stem cells (WJ-MSCs) are known to express genes and secreted factors related to neurological and immunological protection, as well as to improve survival in experimental sepsis. We hypothesized that WJ-MSCs play a modulatory role through the CAP and attenuate sepsis-induced organ injury in a cecal ligation and puncture (CLP) model. Rats were randomly divided into 4 groups: 1) Control (sham-operated); 2) submitted to CLP without treatment; 3) submitted to CLP and treated with 106 WJ-MSCs 6 h later and 4) CLP+MLA+WJ-MSC group (MLA: Methyllycaconitine, alpha7nAChR antagonist). All experiments were performed 24 h post-surgery. Echocardiographic parameters and heart rate variability were assessed. Importantly, treatment with WJ-MSCs attenuated diastolic heart failure and recovered barorreflex sensitivity. Moreover, WJ-MSCs injection increased cardiac sympathetic and cardiovagal activity. In cardiac and splenic tissue, WJ-MSC treatment downregulated TLR4 and alpha7nAChR expression, as well as it reduced p-STAT3/Total STAT3 ratio in the spleen. In addition, WJ-MSC reduced leukocyte infiltration and pro-inflammatory cytokines, which only were abolished by MLA treatment. Finally, WJ-MSC treatment diminished apoptosis in lung and spleen tissue. Together these findings suggest that treatment with WJ-MSCs appears to protect against sepsis-induced organ injury reducing systemic inflammation, at least in part, through cholinergic anti-inflammatory pathway