Reproduction de : Thèse de doctorat : Chimie et physico-chimie des polymères : Le Mans : 2008. / Titre provenant de l'écran-titre.

En raison d’une abondante matrice extracellulaire chondrogénique, peu vascularisée et hypoxique, le chondrosarcome, cancer du cartilage, est une tumeur chimio et radiorésistante. Une stratégie bispécifique s’appuyant sur deux caractéristiques spécifiques du chondrosarcome, une forte densité de charges négatives, ainsi qu’une hypoxie chronique sévère de la matrice extracellulaire, est actuellement développée au laboratoire et consiste à fonctionnaliser une prodrogue activée en hypoxie avec un ammonium quaternaire (AQ). Sur la base de résultats précliniques, une prodrogue, ICF05016, a été identifiée et fait actuellement l’objet d’une étude d’optimisation.Ce projet vise à identifier des relations structure-activité dans une série de moutardes phosphorodiamidates vectorisées par une fonction AQ. Dans une première partie, nous nous sommes intéressés à faire varier la nature des substituants de la fonction ammonium quaternaire ainsi que la longueur du bras espaceur séparant cette dernière de la moutarde. Ainsi, 27 dérivés ont été synthétisés par une séquence commune multi-étapes impliquant la phosphorylation d’un dérivé 2-nitro-5-hydroxyméthylimidazole.Un screening par résonance plasmonique de surface a permis de mettre en évidence 12 composés plus affins envers l’aggrécane que le composé de référence ICF05016. Cette étude a révélé une dépendance importante entre l’affinité à l’aggrécane et la nature de l’ammonium quaternaire, les composés benzyléspossédant tous des affinités supérieures. In vitrosur cultures cellulaires HEMC-SS, les composés ont affichés des ratios de cytotoxicité normoxie vs hypoxie (HCR)supérieurs à celui du lead ICF05016, et notamment le composé benzylé31f.Avec une constante de dissociation à l’aggrécane de 2,10 µM et un différentiel de cytotoxicité normoxie/hypoxie équivalent à celui de l’évosfosfamide en étude clinique, la composé 31f a été évalué en termes de stabilité et de clivage en conditions réductrices, mimant l’hypoxie tumorale. Démontrant une excellente stabilité sur 24 heures dans un tampon phosphate, le composé 31f s’est révélé être réduit par réduction chimique ou enzymatique via une nitroréductase, et ce avec une cinétique rapide. Ce dernier a été ainsi identifié au terme de l’évaluation in vitro et de cet axe de recherche comme un nouveau « lead ».Dans une seconde partie, nous avons choisi de moduler l’halogène et la position des bras alkylants portés par la moutarde phosphorodiamidate. Compte tenu de l’instabilité des composés de la série bromée, par rapport à la série chlorée, les analogues bromés des composés ICF05016 et 31f n’ont pu faire l’objet d’une évaluation in vitro. Pour les isomères de type moutarde ifosfamide, l’instabilité des précurseurs phosphoramidiques et les difficultés de synthèse inhérentes à l’introduction d’une fonction amine secondaire sur un chlorure de phosphoryle préalablement fonctionnalisé, nous ont contraints à réorienter nos travaux vers des structures issues d’une étape de chimie de click, permettant d’introduire le bras vecteur portant la fonction amine tertiaire indépendamment de l’étape de phosphorylation. Cette séquence réactionnelle pourrait être étendue à la synthèse de nouveaux analogues du composé 31f, identifié lors de ces travaux. / Due to an abundant chondrogenic, poorly vascularized and particularly hypoxic extracellular matrix, chondrosarcoma, a malignant cartilaginous tumour, is chemo- and radio-resistant. A dual targeted therapy leveraging specific chondrosarcoma hallmarks, an extensive cartilaginous extracellular matrix, namely the high negative fixed charge density and severe chronic hypoxia,was investigatedby conjugation of a hypoxia-activated prodrug (HAP) to quaternary ammonium (QA) functions. Based on preclinical results, animidazole prodrug, ICF05016, was identified and provided the basis for a lead optimization study.This project was designed to identify structure-activity relationships in a series of QA-targeted phosphorodiamidate mustard conjugates. In a first part, a series of 27 conjugates, with different QA function and length of the alkyl linker, was synthesizedvia a common multi-step sequence involvingphosphorylation of a key 2-nitroimidazole alcohol intermediate. Then, biomolecular interactions between these QA derivatives and aggrecan were assessed using thesurface plasmon resonance technology. This screeningrevealed that the affinity depends more on the natureof the QA function, rather than on the linker length. The most promising results were obtainedwith QA bearing a benzyle group. Twelves compounds were then evaluated in terms of hypoxia selective cytotoxicityonthe HEMC-SS cell line. For all prodrugs, an overall improvement in hypoxic selectivity compared with the ICF05016 was obtained and the positive impact of thebenzyle QA function was again highlighted. With a dissociation constant of 2.10 µM in the SPR experiment and an attractive hypoxic selectivity, compound 31fwas further selected for a stability and reductive activation study. Activation of the prodrug and phosphoramide mustard release under reductive chemical conditions, and nitroreductase-based activation were demonstrated. From this study, compound 31f emerged as the most effective PG-targeted HAPs. In a second part, the nature of the halogen and the position of the alkylating arms carried by the phosphorodiamidic mustard were modified. Given the high instability of the final compounds of the brominated series, compared to the chlorinated series, brominated analogs of the compounds ICF05016 and 31fcould not be obtained with sufficient purity to be evaluated in vitro.For ifosfamide-like isomers, the design of the prodrugs was modified due to the instability of the phosphoramidic precursors or difficulties of introducing a secondary amine function on a phosphoryl chloride previously functionalized.A click chemistry approach was developed to tether the spacer arm carrying the tertiary amine function independently of the phosphorylation step and could be extended to the synthesis of triazoleanalogues of the new lead 31f.

Le chondrosarcome (CHS), cancer du cartilage est une tumeur chimio- et radiorésistance dont le seul traitement efficace reste la chirurgie. Une prodrogue vectorisée et activable en hypoxie, ICF05016, est actuellement développée par l’UMR 1240, et évaluée en préclinique comme potentielle alternative théra-peutique pour ce cancer. La structure de cette molécule regroupe i) une moutarde cytotoxique, ii) un vecteur ammonium quaternaire chargé positivement possédant un tropisme pour l’aggrécane, protéoglycane majoritaire de la matrice extracellulaire tumorale, iii) une gâchette de type 2-nitroimidazole permettant une activation sélective en situation d’hypoxie, une des caractéristiques principales du CHS.Ces travaux de thèse ont consisté à pharmaco-moduler cette prodrogue bispécifique ICF05016 en modifiant la position du vecteur ainsi que la nature de l’agent cytotoxique. Ainsi sept prodrogues vectorisées ont été synthétisées présentant une chaine vectrice N,N,N-triméthylpropylaminium soit en C-4, soit en N-1 du cycle imidazole. Leur activation par réduction chimique, mimant l’hypoxie, ainsi que leur affinité pour l’aggrécane ont été confirmées in tubo par des analyses de RMN 31P et de SPR, toutefois elles se sont avérées non sélectives en termes de cytotoxicité (CI50 comprises entre 15 et 1 µM, et ce, quelles que soient les conditions d’oxygénation) et faiblement sensibles à une bio-réduction enzymatique. La fonctionnalisation par un vecteur ammonium quaternaire de la gâchette 2-nitroimidazole annihile donc l’activation en hypoxie des prodrogues.Cette stratégie a ensuite été étendue au cancer de la prostate en remplaçant le vecteur ammonium quaternaire par un ligand de type urée affin pour l’antigène membranaire spécifique de la prostate (PSMA). La première molécule synthétisée, qui possède un espaceur triazole, a démontré une affinité pour le récepteur PSMA, par une étude de compétition avec un radioligand, ainsi qu’une activation in tubo par bioréduction enzymatique. Toutefois aucune cytotoxicité n’a été constatée sur les lignées LNCaP-Luc et PC3-Luc. Une seconde molécule combinant un espaceur triazole avec une séquence peptidique identifiée pour la molécule PSMA-617, actuellement en cours d’essai clinique, est actuellement développée mais sa synthèse doit être optimisée, notamment au niveau de l’étape de cycloaddition 1,3-dipolaire. / Chondrosarcoma (CHS), the malignant tumor of the cartilage, is a chemo- and radio-resistant cancer. Surgical resection is still considered the mainstay of treatment of this pathology. A dual targeted hypoxia-activated prodrug, ICF05016 was developed by the UMR 1240 and evaluated in preclinical studies as a potential therapeutic alternative for CHS. The latter is a nitroheteroaryl-based compound designed as follows: a phosphorodiamidic mustard functionalized with a quaternary ammonium (QA) used as targeting function, and a 2-nitroimidazole group to trigger fragmentation and then release the bis-alkylating mustard anion by bioreduction under hypoxic conditions, chemical hallmark of CHS.This project deals with the pharmacomodulation of ICF05016, more specifically by modification of the position of the targeting moiety as well as the nature of the cytotoxic agent. Seven QA-targeted prodrugs have been synthesized with N,N,N-trimethylpropylaminium tethered to the imidazole either in the C-4, or the N-1 position. These prodrugs were cleaved in vitro under chemical reductive conditions, which mimic in vivo hypoxia conditions. In addition, the binding of these derivatives to aggrecan was highlighted by surface plasmon resonance. In vitro assays on human CHS cells (H-EMC-SS) demonstrated quite equivalent cytotoxicities, whatever the oxygen conditions used and their evaluation as substrate of an oxygen-insensitive nitroreductase revealed the almost total lack of activation. A QA targeting moiety grafted on the trigger seems to alter hypoxia activation.New prodrugs with prostate specific membrane antigen (PSMA)-targeting ligand were synthesized to extend this HAP strategy to prostate cancer. The first tested compound, having a triazole spacer, presented selective affinity for PSMA in an in vitro binding experiment as well as activation under enzymatic reduction. However, no cytotoxicity was observed on LNCaP-Luc and PC3-Luc cells. The synthesis of a prodrug combining the spacer of PSMA-617, currently in clinical trial, and a propyltriazole moiety, was initiated but the 1,3-dipolar cycloaddition still need to be optimized.

La résistance aux antibiotiques est l'une des menaces les plus graves pour la santé mondiale de nos jours. L'émergence de bactéries multirésistantes encourage les chercheurs à développer de nouveaux antibiotiques et stratégies pour compenser leurs différents mécanismes de résistance. L'un de ces mécanismes de défense est la formation de biofilms. Sous cette forme, les bactéries développent une matrice extracellulaire protectrice les rendant plus résistantes à divers traitements antimicrobiens. Nous avons conçu et synthétisé des composés de déstabilisation des membranes avec des caractéristiques clés : un cation benzimidazolium ou imidazolium, une chaîne apolaire hydrophobe et/ou un site de reconnaissance des anions lipophiles. Ces caractéristiques leur confèrent une activité antimicrobienne accrue et une grande capacité à perturber les membranes cellulaires. Ces composés perturbateurs de la membrane agissent via un mécanisme rapide et efficace et ont montré de bons résultats contre les souches de SARM (staphylococcus aureus résistant à la méthiciline) en tant que candidats antibiofilms prometteurs. Ces nouveaux agents ont le potentiel de se disperser et d'inhiber la formation de biofilms et pourraient avoir un impact positif sur la médecine humaine à l'avenir. / Antibiotic resistance is one of the most serious threats to global health nowadays. Emergence of resistant bacteria encourages researchers to develop new antibiotics and strategies to mitigate their different resistance mechanisms. One of these defense mechanisms is the formation of biofilms. In this form, bacteria develop a protective extracellular matrix making them more resistant to various antimicrobial treatments. We have designed and synthesized membrane destabilizing compounds with three key features: a benzimidazolium or an imidazolium cation, a hydrophobic apolar chain, and a lipophilic anion recognition site. These characteristics give these compounds increased antimicrobial activity and greater ability to disrupt cell membranes. These membrane-disrupting compounds act via a fast and efficient mechanism and showed good results against MRSA (methicillin-resistant staphylococcus aureus) strains as promising antibiofilms candidates. These new agents have the potential to disperse and inhibit the formation of biofilms and could have a positive impact on human medicine in the future.

Les nanoparticules de silice sont des plateformes idéales pour la conception d’outils de bioimagerie afin d’étudier les mécanismes de transfert de gènes par des lipoplexes. L’objectif de notre étude est le développement d’une modification chimique de surface permettant d’obtenir des colloïdes de silice chargés positivement susceptible de lier de l’ADN par des interactions électrostatiques. Deux stratégies pour la génération de groupements ammonium quaternaires sur des nanoparticules de silice sont présentées a) une silanisation directe par l’utilisation d’un agent de couplage silanique contenant un groupement ammonium quaternaire et b) un procédé en deux étapes mettant en jeu une modification de surface chimique par des aminosilanes primaires et secondaires suivie d’une alkylation des amines par l’iodomethane. Différentes méthodes physico-chimiques (essais de cosédimentation, des expériences de microbalance à cristal de quartz avec mesure de dissipation et d’imagerie MET et Cryo-MET) ont été utilisées pour mettre en évidence et caractériser les interactions entre les biomolécules et les surfaces quaternisées. Des études préliminaires ont montrées les capacités de marquage de lipoplexes par de telles nanoparticules. / Silica nanoparticles are ideal platforms for the conception of bioimaging tools serving for the elucidation of the mechanisms of gene transfection via lipoplex structures. The purpose of the present study is the development of a chemical surface modification for the generation of quaternary ammonium groups on silica nanoparticles permitting the obtainment of highly positively charged silica colloids which strongly attract DNA by electrostatic interactions. Two modification strategies to generate quaternary ammonium groups on silica are presented a) a direct silanization using quaternary ammonium groups containing silane derivatives and b) a modification of silica nanoparticles via a first modification with an amine group containing silane derivative and a subsequent quaternization of the amine groups via an alkylation with iodomethane. Different physicochemical methods were employed (cosedimentation assays, quartz crystal microbalance with dissipation monitoring measurements, TEM and Cryo-TEM imaging) to analyze interactions between quaternized surfaces, DNA and lipids. A preliminary study was carried out which shows the capacity of the synthesized nanoparticles to label DNA in lipoplexes.