As membranas amnióticas humana, felina e canina representam uma boa fonte de célulastronco mesenquimais multipotentes. Sua obtenção não causa conflitos éticos, pois o âmnio é comumente descartado após o nascimento do indivíduo. Devido à característica inovadora da utilização de células-tronco na medicina regenerativa, diversos testes estão sendo realizados a fim de sanar dúvidas sobre possíveis complicações de seu emprego, tais como: infecções no ato da aplicação, deterioração da função tecidual e principalmente sobre o potencial tumorigênico das linhagens celulares. O teste tumoral foi negativo nas espécies felina e humana, viabilizando a utilização deste tipo de célula nestas espécies, porém, o mesmo teste foi realizado em cães anteriormente com resultado positivo para formação tumoral. A proposta deste estudo é traçar um perfil comparativo sobre as características de cultivo, marcadores moleculares e ensaio tumoral na membrana amniótica canina e felina. Para a obtenção das células, foram utilizadas placentas oriundas de 9 gestações caninas nas idades entre 35 a 45 dias, 1 gestação canina de 25 dias e 3 gestações felinas nas idades de 35 a 45 dias por procedimento de cesariana seguida de castração em clínicas da região de Pirassununga. O âmnio foi separado manualmente das outras membranas fetais e acondicionado em placas de Petri, submetido à maceração manual, para posterior cultivo em meio adequado para cultura de células mesenquimais. Após o estabelecimento do cultivo, foram realizadas análises de imunocitoquímica para marcadores mesenquimais (CD73, CD90 e CD105) e tumoral (CD30) sendo que as células de origem canina mostraram-se positivas para os marcadores mesenquimais CD73, CD90 e para o marcador tumoral CD30 e as de origem felina mostraram-se positivas para os marcadores mesenquimais CD73, CD90 e CD105. O ensaio in vivo realizado com a inoculação das CT\'s canina e felina em camundongos imunossuprimidos (Balb/c NUDE) pelas vias subcutânea, intramuscular e intraperitoneal não demonstrando formação tumoral após 60 dias da inoculação. Foram realizadas análises de citometria de fluxo onde as maiores quantificações nas células caninas foram os marcadores de pluripotência (OCT-4 e SOX2, com 59,4% e 34,35% respectivamente), e felinas foram os marcadores mesenquimais (CD73 e CD90, com 32,58% e 23,48%). A análise de qPCR das células felinas demonstrou baixa, expressão de todos os genes testados (mesenquimais, pluripotência, hematopoiético e teratogênico). Já as células de origem canina, demonstraram expressão maior do gene mesenquimal (CD90) e do gene de pluripotência (SOX2 e OCT4). Os achados deste estudo demonstraram por ambas as técnicas (citometria e qPCR) que as células da membrana amniótica felina tem um potencial mesenquimal mais evidente do que as caninas e ambas não apresentaram potencial tumorigênico quando submetidas ao ensaio in vivo. / Human, feline and canine amniotic membranes are a good source of multipotent mesenchymal stem cells. The obtaining does not cause ethical conflict because the amnion is usually discarded after the birth. Due to the innovative feature of the use of stem cells in regenerative medicine, several tests are being conducted to answer some questions about possible complications of its use, such as infections during application, deterioration of tissue function and particularly on the carcinogenic potential of amniotic stem cells. Teratoma formation assays were proved negative in feline and human species, enabling the use of this type of cell in these species, however, the same test was performed in dogs previously and was positive for teratomas, condemning its application. The purpose of this study is to trace a molecular profile and detailed teratogenic test, comparing the canine and feline amniotic membrane model, since the experiments were favorable to the feline model, in order to find out where they differ to justify the new data to counteract the results of previous studies using canine amnion. To obtain cells, it were used placentas from 9 pregnant canines between 35 to 45 days of gestation, one placenta at 25 days from canine and 3 placentas from feline at 35 to 45 days. It was realized caesarean and followed ovarian salpingo hysterectomy at veterinarian clinics on Pirassununga region. The amnion was manually separated from the other fetal membranes and placed on Petri dishes. Then was made a manual maceration, later to be cultivated. After culture establishment were performed immunocytochemical analyzes for mesenchymal (CD73, CD90 and CD105) and teratogenic (CD30) markers. The canine cells were positive to the following markers: CD73, CD90 and CD30 and the feline cells were positive for CD73, CD90 and CD105. Teratogenic test was conducted by subcutaneous, intramuscular and intraperitoneal inoculation of the canine and feline stem cells, in immunosuppressed mice (Balb/c NUDE)and was not observed tumor formation after 60 days of inoculation. Flow cytometry analyzes were performed where the largest quantifications in canine cells were the genes of pluripotency (Oct-4 and Sox2, 59.4% and 34.35% respectively), and the feline were performed at the mesenchymal genes (CD73 and CD90, with 32.58% and 23.48%). PCR analysis of feline cells demonstrated low expression of all markers tested (mesenchymal, pluripotency, hematopoietic and teratogenic). The cells of canine origin, showed higher expression of mesenchymal gene (CD90) and pluripotencys genes (SOX2 and OCT4). The findings of this study demonstrated for both techniques (flow cytometry and qPCR) that feline amniotic membrane cells has a more potential than the canine amniotic membrane cells. Both showed no tumorigenic potential when submitted to in vivo test.

As membranas amnióticas humana, felina e canina representam uma boa fonte de célulastronco mesenquimais multipotentes. Sua obtenção não causa conflitos éticos, pois o âmnio é comumente descartado após o nascimento do indivíduo. Devido à característica inovadora da utilização de células-tronco na medicina regenerativa, diversos testes estão sendo realizados a fim de sanar dúvidas sobre possíveis complicações de seu emprego, tais como: infecções no ato da aplicação, deterioração da função tecidual e principalmente sobre o potencial tumorigênico das linhagens celulares. O teste tumoral foi negativo nas espécies felina e humana, viabilizando a utilização deste tipo de célula nestas espécies, porém, o mesmo teste foi realizado em cães anteriormente com resultado positivo para formação tumoral. A proposta deste estudo é traçar um perfil comparativo sobre as características de cultivo, marcadores moleculares e ensaio tumoral na membrana amniótica canina e felina. Para a obtenção das células, foram utilizadas placentas oriundas de 9 gestações caninas nas idades entre 35 a 45 dias, 1 gestação canina de 25 dias e 3 gestações felinas nas idades de 35 a 45 dias por procedimento de cesariana seguida de castração em clínicas da região de Pirassununga. O âmnio foi separado manualmente das outras membranas fetais e acondicionado em placas de Petri, submetido à maceração manual, para posterior cultivo em meio adequado para cultura de células mesenquimais. Após o estabelecimento do cultivo, foram realizadas análises de imunocitoquímica para marcadores mesenquimais (CD73, CD90 e CD105) e tumoral (CD30) sendo que as células de origem canina mostraram-se positivas para os marcadores mesenquimais CD73, CD90 e para o marcador tumoral CD30 e as de origem felina mostraram-se positivas para os marcadores mesenquimais CD73, CD90 e CD105. O ensaio in vivo realizado com a inoculação das CT\'s canina e felina em camundongos imunossuprimidos (Balb/c NUDE) pelas vias subcutânea, intramuscular e intraperitoneal não demonstrando formação tumoral após 60 dias da inoculação. Foram realizadas análises de citometria de fluxo onde as maiores quantificações nas células caninas foram os marcadores de pluripotência (OCT-4 e SOX2, com 59,4% e 34,35% respectivamente), e felinas foram os marcadores mesenquimais (CD73 e CD90, com 32,58% e 23,48%). A análise de qPCR das células felinas demonstrou baixa, expressão de todos os genes testados (mesenquimais, pluripotência, hematopoiético e teratogênico). Já as células de origem canina, demonstraram expressão maior do gene mesenquimal (CD90) e do gene de pluripotência (SOX2 e OCT4). Os achados deste estudo demonstraram por ambas as técnicas (citometria e qPCR) que as células da membrana amniótica felina tem um potencial mesenquimal mais evidente do que as caninas e ambas não apresentaram potencial tumorigênico quando submetidas ao ensaio in vivo. / Human, feline and canine amniotic membranes are a good source of multipotent mesenchymal stem cells. The obtaining does not cause ethical conflict because the amnion is usually discarded after the birth. Due to the innovative feature of the use of stem cells in regenerative medicine, several tests are being conducted to answer some questions about possible complications of its use, such as infections during application, deterioration of tissue function and particularly on the carcinogenic potential of amniotic stem cells. Teratoma formation assays were proved negative in feline and human species, enabling the use of this type of cell in these species, however, the same test was performed in dogs previously and was positive for teratomas, condemning its application. The purpose of this study is to trace a molecular profile and detailed teratogenic test, comparing the canine and feline amniotic membrane model, since the experiments were favorable to the feline model, in order to find out where they differ to justify the new data to counteract the results of previous studies using canine amnion. To obtain cells, it were used placentas from 9 pregnant canines between 35 to 45 days of gestation, one placenta at 25 days from canine and 3 placentas from feline at 35 to 45 days. It was realized caesarean and followed ovarian salpingo hysterectomy at veterinarian clinics on Pirassununga region. The amnion was manually separated from the other fetal membranes and placed on Petri dishes. Then was made a manual maceration, later to be cultivated. After culture establishment were performed immunocytochemical analyzes for mesenchymal (CD73, CD90 and CD105) and teratogenic (CD30) markers. The canine cells were positive to the following markers: CD73, CD90 and CD30 and the feline cells were positive for CD73, CD90 and CD105. Teratogenic test was conducted by subcutaneous, intramuscular and intraperitoneal inoculation of the canine and feline stem cells, in immunosuppressed mice (Balb/c NUDE)and was not observed tumor formation after 60 days of inoculation. Flow cytometry analyzes were performed where the largest quantifications in canine cells were the genes of pluripotency (Oct-4 and Sox2, 59.4% and 34.35% respectively), and the feline were performed at the mesenchymal genes (CD73 and CD90, with 32.58% and 23.48%). PCR analysis of feline cells demonstrated low expression of all markers tested (mesenchymal, pluripotency, hematopoietic and teratogenic). The cells of canine origin, showed higher expression of mesenchymal gene (CD90) and pluripotencys genes (SOX2 and OCT4). The findings of this study demonstrated for both techniques (flow cytometry and qPCR) that feline amniotic membrane cells has a more potential than the canine amniotic membrane cells. Both showed no tumorigenic potential when submitted to in vivo test.

As células tronco possuem a capacidade de auto renovação ilimitada e de se manterem indiferenciadas durante um período prolongado de tempo, até se diferenciarem em uma linhagem celular específica. Devido as dificuldades encontradas na utilização de células embrionárias por questões éticas, de segurança e histocompatibilidade e a limitada plasticidade das células tronco adultas, as células tronco fetais, derivadas de tecidos extraembrionários, aparecem no cenário terapêutico como uma alternativa promissora. Uma vez que apresentam alta capacidade de proliferação e expansão in vitro, além de sua característica imunogênica, por se encontrarem na interface materno fetal. Por conta destas características, a membrana amniótica surgiu como uma nova e importante fonte de células tronco em diferentes espécies. Neste trabalho, foram utilizados 8 fetos de coelhos para a coleta da membrana amniótica. A membrana foi isolada pela técnica de explante, as amostras foram cultivadas em meio DMEM-HIGH, e posteriormente criopreservadas nas passagens P4 e P8 para realizar os experimentos. Em cultivo, essas células apresentaram aderência a placa, alta capacidade de proliferação e morfologia semelhante à fibroblastos. Na caracterização imunofenotípica, houve expressão de marcadores de citoesqueleto, de células mesenquimais, proliferação, pluripotência e para precursores de células hematopoiéticas, embora não tenha ocorrido a expressão de marcadores de células hematopoiéticas (CD-45) e de células precursoras neuronais. Quando induzidas a diferenciação in vitro, as células amnióticas tiveram capacidade de se diferenciarem nas linhagens osteogênica, adipogênica e condrogênica. Além disso, quando injetadas em camundongos nude, não foi verificada a formação de tumor. Nossos resultados demostram que células de membrana amniótica de coelho podem ser consideradas células tronco mesenquimais com possibilidade de serem utilizadas no futuro na terapia celular / Stem cells are capable of unlimited self renewal and to remain undifferentiated for a prolonged period of time up to differentiate into a specific cell lineage. Due to the difficulties in the use of embryonic cells due ethical reasons, security and histocompatibility, and in the other hands, the limited plasticity of adult stem cells, fetal stem cells, derived from extraembryonic tissues, appear in the therapeutic setting as a promising alternative. They have high capacity of proliferation and in vitro expansion, as well as immunogenic properties, since they are at the maternal-fetal interface. Due to these characteristics, the amniotic membrane has emerged as an important new source of stem cells in different species. In this work, we used 8 fetuses of rabbits to collect amniotic membrane. The membrane was isolated by the explant technique. Samples were cultured in DMEM-HIGH, and cryopreserved in the passages P4 and P8 in order to perform the experiments. In culture, these cells exhibited adhesion to the dishes, high proliferative capacity and fibroblast-like morphology. In immunophenotypic characterization, there was expression of markers related to cell cytoskeleton, mesenchymal stem cells, proliferation, pluripotency, and hematopoietic precursor cells. And there was no expression of hematopoietic cell markers (CD-45) and neuronal precursor cells. When induced to in vitro differentiation, the amniotic cells were able to differentiate in osteogenic, adipogenic and chondrogenic lineages. Furthermore, when injected into nude mice, tumor formation has not been verified. Our results demonstrate that rabbit amniotic membrane cells can be considered mesenchymal stem cells with possibility to be used in the future in cell therapy

Os procedimentos de reconstrução de parede abdominal são importantes na rotina cirúrgica de pequenos animais e, apesar da sua baixa casuística, normalmente são realizados por consequência de traumas ou neoplasias. O material ideal a ser utilizado permanece sem unanimidade e sua busca é constante. Diversos materiais de origem sintética e biológica são pesquisados, apresentando prós e contras. Entretanto, a maior utilização aparenta ser a malha de polipropileno. Em contrapartida, a membrana amniótica é estudada atualmente, demostrando melhor aceitação dos pacientes, assim como menor reatividade. Junto às boas informações sobre a membrana amniótica, se tem estudado processos de decelularização de tecidos como técnicas de bioengenharia tecidual, o qual criam-se materiais imunologicamente compatíveis, aumentando sua biocompatibilidade, com melhor resposta cicatricial e menor inflamação do hospedeiro no período pós-operatório. O presente trabalho objetivou avaliar macro e microscopicamente a membrana amniótica equina mantida em meio de preservação tradicional (glicerina 98%) e tratada com solução utilizada para decelularização, em baixa concentração (detergente Dodecil Sulfato de Sódio Sodium Dodecyl Sulfate SDS 0,01%), a fim de mensurar possíveis diferenças de resultados apresentados pelos hospedeiros. Foram formados dois grupos (grupo I e grupo II) contendo 15 animais em cada. Os animais do grupo I receberam a membrana amniótica tratada com SDS 0,01%, assim como os animais do grupo II receberam a membrana preservada em glicerina 98%. Cada grupo foi dividido em três subgrupos, contendo cinco animais em cada. O primeiro subgrupo foi avaliado aos sete dias de pós-cirúrgico (M1), o segundo aos 20 dias (M2), e o terceiro aos 40 dias (M3). Após anestesia geral, segmento de aproximadamente 2,0cm x 1,5cm foi retirado da parede abdominal de cada rato, para criação de defeito abdominal, e substituído pelo material a ser avaliado, suturado com fio náilon 5-0 em padrão simples interrompido, seguido de sutura cutânea em U horizontal com fio náilon 4-0. Informações macro e microscópicas foram coletadas e analisadas estatisticamente. As avaliações macroscópicas não apresentaram diferenças estatísticas entre os grupos, mostrando bons resultados quanto a prevenção das aderências viscerais ao implante. A avaliação microscópica mostrou diferença importante de contagem celular no terceiro momento de avaliação (M3) entre os grupos, sendo que o grupo I apresentou menor intensidade de células inflamatórias em comparação ao grupo II (p=0,002973). A eficiência do detergente SDS 0,01% não foi boa, devido manutenção de conteúdo nuclear ao avaliar o material em lâminas histológicas. Pode-se concluir com o presente estudo que, a membrana amniótica equina pode ser utilizada para reconstrução de parede abdominal em ratos Wistar, pois, mostrou bom resultado, não causando aderências viscerais e, consequentemente, sem comprometimento de quaisquer funções. O grupo I mostrou importante queda na contagem celular em comparação ao grupo II, levantando a hipótese de possível efeito do tratamento com SDS 0,01%. Porém, a total eficiência para decelularização avaliada ao final, não foi boa, sugerindo melhores abordagens aos protocolos de decelularização, aumentando a concentração da substância, o tempo de tratamento, assim como a associação com outras técnicas para melhor efetividade na total remoção do conteúdo celular da membrana amniótica equina. / Abdominal wall reconstruction procedures are important in the surgical routine of small animals and, despite their low casuistry, are usually performed as a consequence of traumas or neoplasias. There is no unanimity as to the ideal material to be used in these procedures and, therefore, their demand is constant. Several materials, both of synthetic and biological origin, were and are researched nowadays, presenting advantages and disadvantages in its use. The preference, however, appears to be the polypropylene mesh. On the other hand, the amniotic membrane, currently studied, has demonstrated better patient acceptance as well as lower reactivity. In addition to the good information about the amniotic membrane, tissular decellularization processes have been studied as tissue bioengineering techniques, in which immunologically compatible materials are created, increasing their biocompatibility, with better cicatricial response and less inflammation of the host in the postoperative period. The aim of the present work was to evaluate the equine amniotic membrane maintained in a traditional preservation medium (glycerin 98%) and treated with a low concentration decellularization solution (Sodium Dodecyl Sulfate detergent - SDS 0,01%), in order to measure possible differences of results presented by the hosts. Two groups were formed (group I and group II) containing 15 animals each. The animals in group I received the amniotic membrane treated with SDS 0,01% while the animals in group II received the membrane preserved in glycerin 98%. Each group was divided into three subgroups, each containing five animals. The first subgroup (from each group) was evaluated at seven days postoperative (M1), second at 20 days (M2), and third at 40 days (M3). After a general anesthesia, a segment of approximately 2,0cm x 1,5cm was removed from the abdominal wall of each animal, to create abdominal defect, and replaced by the material to be evaluated, sutured with 5-0 nylon thread in a simple interrupted pattern, followed by horizontal U shaped skin suture with 4-0 nylon thread. Macro and microscopic information were collected and analyzed statistically. The macroscopic evaluations did not present statistical differences between the groups, showing good results regarding the prevention of the visceral adhesions to the implant. Microscopic evaluation showed a significant difference in cell counts in the third evaluation period (M3) between groups, and group I presented lower inflammatory cell intensity compared to group II (p=0,002973). The efficiency of the SDS detergent 0,01% was not good, due to the maintenance of nuclear content, verified when evaluating the material in histological slides. It is concluded with the present study that equine amniotic membrane can be used for abdominal wall reconstruction in Wistar rats, demonstrating good results in not causing visceral adhesions and without compromising any functions. Group I showed an important decrease in the cell count in comparison to group II, raising the hypothesis of possible treatment effect with SDS 0,01%. However, the efficiency for the total decellularization evaluated at the end was not good, suggesting that there are better approaches within the decellularization protocols, such as increasing the concentration of the substance, the time of treatment, and the association with other techniques for better effectiveness in the total removal of the cellular contents of the equine amniotic membrane.

The incidence of preterm labor has risen over recent decades and preventative antibiotic treatment is ineffective. Associated with a 40% increased risk of preterm birth, bacterial vaginosis is characterized by a decrease in lactobacilli and increase in pathogenic bacteria in the vaginal flora. Ascent of bacterial products to the intrauterine environment stimulates cytokine and prostaglandin secretion from invading immune cells and gestational tissues. Probiotic lactobacilli modulate the immune responses in mouse macrophages and human placental trophoblast cells. The focus of this thesis was to determine the influence of Lactobacillus rhamnosus GR-1 (GR-1) on cytokines and prostaglandins which are part of the activated pathway in infection and/or inflammation mediated preterm labour. GR-1 increased amnion chemokine and reduced pro-inflammatory cytokine release. GR-1 elevated prostaglandin E2 release that was paralleled by an increase in mPGES2 expression. It is possible that t that GR-1 may enhance the host defense barriers of the amnion to pathogenic bacteria.

The incidence of preterm labor has risen over recent decades and preventative antibiotic treatment is ineffective. Associated with a 40% increased risk of preterm birth, bacterial vaginosis is characterized by a decrease in lactobacilli and increase in pathogenic bacteria in the vaginal flora. Ascent of bacterial products to the intrauterine environment stimulates cytokine and prostaglandin secretion from invading immune cells and gestational tissues. Probiotic lactobacilli modulate the immune responses in mouse macrophages and human placental trophoblast cells. The focus of this thesis was to determine the influence of Lactobacillus rhamnosus GR-1 (GR-1) on cytokines and prostaglandins which are part of the activated pathway in infection and/or inflammation mediated preterm labour. GR-1 increased amnion chemokine and reduced pro-inflammatory cytokine release. GR-1 elevated prostaglandin E2 release that was paralleled by an increase in mPGES2 expression. It is possible that t that GR-1 may enhance the host defense barriers of the amnion to pathogenic bacteria.

Orientador: Carlos Eduardo Leite Arieta / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-15T13:36:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Paes_JoaquimPereira_D.pdf: 1675369 bytes, checksum: a671cc24bdc34134b1f16e5bd46b7b77 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Objetivo: Determinar se o transplante de membrana amniótica é um procedimento mais eficaz que a rotação de retalho conjuntival, no tratamento cirúrgico de pterígio primário, quanto à taxa de recidiva. Material e métodos: Foi realizado um estudo prospectivo, do tipo ensaio clínico randomizado, de 228 pacientes (228 olhos) com pterígio primário grau II. Os pacientes foram divididos em dois grupos: grupo teste (126 olhos) - exérese de pterígio seguida de transplante de membrana amniótica; grupo controle(102 olhos)- exérese de pterígio seguida de rotação de retalho conjuntival. Os procedimentos foram realizados no período de janeiro de 2001 a outubro de 2005 no bloco cirúrgico do Hospital Escola da Universidade Federal do Triângulo Mineiro. Os pacientes tiveram um seguimento de 1 ano e o critério de recidiva foi a invasão corneana por tecido fibrovascular. A análise estatística foi feita pelo teste de igualdade de duas proporções. Resultados: No grupo teste foram observados 8 quadros de recidiva (6,3%) sendo 6 em pacientes do sexo masculino e 2 no sexo feminino. A média de idade dos pacientes foi de 39,6 anos, sendo que a recidiva ocorreu em média 3.3 meses pós-operatório. No grupo controle foram observadas 17 recidivas (16,7%) sendo 11 no sexo masculino e 6 no feminino.A média de idade dos pacientes foi de 35,7 anos sendo que a recidiva ocorreu em média 3,1 meses pós operatório . O z calculado foi de 2,48 evidenciando significância estatística e validando a hipótese proposta. Conclusão: O transplante de membrana amniótica é um procedimento efetivo e seguro no tratamento cirúrgico do pterígio primário apresentando baixa taxa de recidiva / Abstract: Objective: Determine the best procedure for the treatment of the surgical primary pterygium according to the recurrence rate. Design: Randomized clinical trials. Material and Methods: 228 patients (228 eyes) carrying primary pterygium level II diagnosed with biomicroscopy, having the surgical treatment from January 2001 to October 2005 in the surgical room of the School Hospital of UFTM. Patients were divided into two groups:Test group (126 eyes): exeresis of the pterygium followed by a transplant of amnionic membrana;Control group (102 eyes): exeresis of the pterygium followed by rotation of the conjunctival flap. Criterion of recidivation considered was the corneal invasion by the fibrovascular tissue in a period of a year after the surgery. Statistics analysis was done using the significance test for equality of two proportions. Results: In the test group we observed 8 tables of recidivation, being 6 in male patients and 2 in female ones. Average age of these patients was 39.6 (ranging from 22 to 53). Recidivation occurred on an average of 3.3 months (ranging from the 2nd to the 7th month). In the control group we observed 17 recidivations of the pterygium being 11 in the male sex and 06 in the female one. The average age of these patients was 35.7 years old (ranging from 20 to 50 years). Recidivation occurred on an average of 3.1 months (ranging from the 1st to the 8th month). The calculated z (2.48) was higher than the table z. Conclusions: Amniotic membrane transplantation is an effective and safe procedure for primary pterygium surgery with a relatively low recurrence rate. However, we couldn't affirm that the amniotic membrane transplant has to be considered the first choice in the primary pterygium surgery treatment / Doutorado / Oftalmologia / Doutor em Ciências Médicas

As células tronco possuem a capacidade de auto renovação ilimitada e de se manterem indiferenciadas durante um período prolongado de tempo, até se diferenciarem em uma linhagem celular específica. Devido as dificuldades encontradas na utilização de células embrionárias por questões éticas, de segurança e histocompatibilidade e a limitada plasticidade das células tronco adultas, as células tronco fetais, derivadas de tecidos extraembrionários, aparecem no cenário terapêutico como uma alternativa promissora. Uma vez que apresentam alta capacidade de proliferação e expansão in vitro, além de sua característica imunogênica, por se encontrarem na interface materno fetal. Por conta destas características, a membrana amniótica surgiu como uma nova e importante fonte de células tronco em diferentes espécies. Neste trabalho, foram utilizados 8 fetos de coelhos para a coleta da membrana amniótica. A membrana foi isolada pela técnica de explante, as amostras foram cultivadas em meio DMEM-HIGH, e posteriormente criopreservadas nas passagens P4 e P8 para realizar os experimentos. Em cultivo, essas células apresentaram aderência a placa, alta capacidade de proliferação e morfologia semelhante à fibroblastos. Na caracterização imunofenotípica, houve expressão de marcadores de citoesqueleto, de células mesenquimais, proliferação, pluripotência e para precursores de células hematopoiéticas, embora não tenha ocorrido a expressão de marcadores de células hematopoiéticas (CD-45) e de células precursoras neuronais. Quando induzidas a diferenciação in vitro, as células amnióticas tiveram capacidade de se diferenciarem nas linhagens osteogênica, adipogênica e condrogênica. Além disso, quando injetadas em camundongos nude, não foi verificada a formação de tumor. Nossos resultados demostram que células de membrana amniótica de coelho podem ser consideradas células tronco mesenquimais com possibilidade de serem utilizadas no futuro na terapia celular / Stem cells are capable of unlimited self renewal and to remain undifferentiated for a prolonged period of time up to differentiate into a specific cell lineage. Due to the difficulties in the use of embryonic cells due ethical reasons, security and histocompatibility, and in the other hands, the limited plasticity of adult stem cells, fetal stem cells, derived from extraembryonic tissues, appear in the therapeutic setting as a promising alternative. They have high capacity of proliferation and in vitro expansion, as well as immunogenic properties, since they are at the maternal-fetal interface. Due to these characteristics, the amniotic membrane has emerged as an important new source of stem cells in different species. In this work, we used 8 fetuses of rabbits to collect amniotic membrane. The membrane was isolated by the explant technique. Samples were cultured in DMEM-HIGH, and cryopreserved in the passages P4 and P8 in order to perform the experiments. In culture, these cells exhibited adhesion to the dishes, high proliferative capacity and fibroblast-like morphology. In immunophenotypic characterization, there was expression of markers related to cell cytoskeleton, mesenchymal stem cells, proliferation, pluripotency, and hematopoietic precursor cells. And there was no expression of hematopoietic cell markers (CD-45) and neuronal precursor cells. When induced to in vitro differentiation, the amniotic cells were able to differentiate in osteogenic, adipogenic and chondrogenic lineages. Furthermore, when injected into nude mice, tumor formation has not been verified. Our results demonstrate that rabbit amniotic membrane cells can be considered mesenchymal stem cells with possibility to be used in the future in cell therapy

Os procedimentos de reconstrução de parede abdominal são importantes na rotina cirúrgica de pequenos animais e, apesar da sua baixa casuística, normalmente são realizados por consequência de traumas ou neoplasias. O material ideal a ser utilizado permanece sem unanimidade e sua busca é constante. Diversos materiais de origem sintética e biológica são pesquisados, apresentando prós e contras. Entretanto, a maior utilização aparenta ser a malha de polipropileno. Em contrapartida, a membrana amniótica é estudada atualmente, demostrando melhor aceitação dos pacientes, assim como menor reatividade. Junto às boas informações sobre a membrana amniótica, se tem estudado processos de decelularização de tecidos como técnicas de bioengenharia tecidual, o qual criam-se materiais imunologicamente compatíveis, aumentando sua biocompatibilidade, com melhor resposta cicatricial e menor inflamação do hospedeiro no período pós-operatório. O presente trabalho objetivou avaliar macro e microscopicamente a membrana amniótica equina mantida em meio de preservação tradicional (glicerina 98%) e tratada com solução utilizada para decelularização, em baixa concentração (detergente Dodecil Sulfato de Sódio Sodium Dodecyl Sulfate SDS 0,01%), a fim de mensurar possíveis diferenças de resultados apresentados pelos hospedeiros. Foram formados dois grupos (grupo I e grupo II) contendo 15 animais em cada. Os animais do grupo I receberam a membrana amniótica tratada com SDS 0,01%, assim como os animais do grupo II receberam a membrana preservada em glicerina 98%. Cada grupo foi dividido em três subgrupos, contendo cinco animais em cada. O primeiro subgrupo foi avaliado aos sete dias de pós-cirúrgico (M1), o segundo aos 20 dias (M2), e o terceiro aos 40 dias (M3). Após anestesia geral, segmento de aproximadamente 2,0cm x 1,5cm foi retirado da parede abdominal de cada rato, para criação de defeito abdominal, e substituído pelo material a ser avaliado, suturado com fio náilon 5-0 em padrão simples interrompido, seguido de sutura cutânea em U horizontal com fio náilon 4-0. Informações macro e microscópicas foram coletadas e analisadas estatisticamente. As avaliações macroscópicas não apresentaram diferenças estatísticas entre os grupos, mostrando bons resultados quanto a prevenção das aderências viscerais ao implante. A avaliação microscópica mostrou diferença importante de contagem celular no terceiro momento de avaliação (M3) entre os grupos, sendo que o grupo I apresentou menor intensidade de células inflamatórias em comparação ao grupo II (p=0,002973). A eficiência do detergente SDS 0,01% não foi boa, devido manutenção de conteúdo nuclear ao avaliar o material em lâminas histológicas. Pode-se concluir com o presente estudo que, a membrana amniótica equina pode ser utilizada para reconstrução de parede abdominal em ratos Wistar, pois, mostrou bom resultado, não causando aderências viscerais e, consequentemente, sem comprometimento de quaisquer funções. O grupo I mostrou importante queda na contagem celular em comparação ao grupo II, levantando a hipótese de possível efeito do tratamento com SDS 0,01%. Porém, a total eficiência para decelularização avaliada ao final, não foi boa, sugerindo melhores abordagens aos protocolos de decelularização, aumentando a concentração da substância, o tempo de tratamento, assim como a associação com outras técnicas para melhor efetividade na total remoção do conteúdo celular da membrana amniótica equina. / Abdominal wall reconstruction procedures are important in the surgical routine of small animals and, despite their low casuistry, are usually performed as a consequence of traumas or neoplasias. There is no unanimity as to the ideal material to be used in these procedures and, therefore, their demand is constant. Several materials, both of synthetic and biological origin, were and are researched nowadays, presenting advantages and disadvantages in its use. The preference, however, appears to be the polypropylene mesh. On the other hand, the amniotic membrane, currently studied, has demonstrated better patient acceptance as well as lower reactivity. In addition to the good information about the amniotic membrane, tissular decellularization processes have been studied as tissue bioengineering techniques, in which immunologically compatible materials are created, increasing their biocompatibility, with better cicatricial response and less inflammation of the host in the postoperative period. The aim of the present work was to evaluate the equine amniotic membrane maintained in a traditional preservation medium (glycerin 98%) and treated with a low concentration decellularization solution (Sodium Dodecyl Sulfate detergent - SDS 0,01%), in order to measure possible differences of results presented by the hosts. Two groups were formed (group I and group II) containing 15 animals each. The animals in group I received the amniotic membrane treated with SDS 0,01% while the animals in group II received the membrane preserved in glycerin 98%. Each group was divided into three subgroups, each containing five animals. The first subgroup (from each group) was evaluated at seven days postoperative (M1), second at 20 days (M2), and third at 40 days (M3). After a general anesthesia, a segment of approximately 2,0cm x 1,5cm was removed from the abdominal wall of each animal, to create abdominal defect, and replaced by the material to be evaluated, sutured with 5-0 nylon thread in a simple interrupted pattern, followed by horizontal U shaped skin suture with 4-0 nylon thread. Macro and microscopic information were collected and analyzed statistically. The macroscopic evaluations did not present statistical differences between the groups, showing good results regarding the prevention of the visceral adhesions to the implant. Microscopic evaluation showed a significant difference in cell counts in the third evaluation period (M3) between groups, and group I presented lower inflammatory cell intensity compared to group II (p=0,002973). The efficiency of the SDS detergent 0,01% was not good, due to the maintenance of nuclear content, verified when evaluating the material in histological slides. It is concluded with the present study that equine amniotic membrane can be used for abdominal wall reconstruction in Wistar rats, demonstrating good results in not causing visceral adhesions and without compromising any functions. Group I showed an important decrease in the cell count in comparison to group II, raising the hypothesis of possible treatment effect with SDS 0,01%. However, the efficiency for the total decellularization evaluated at the end was not good, suggesting that there are better approaches within the decellularization protocols, such as increasing the concentration of the substance, the time of treatment, and the association with other techniques for better effectiveness in the total removal of the cellular contents of the equine amniotic membrane.

Orientador: Nereu Carlos Prestes / Resumo: Estudos das células-tronco mesenquimais (CTMs) comprovaram a influência do sexo do doador nas suas capacidades proliferativa e imunomoduladora. Nesse sentido, o objetivo deste trabalho é investigar se há disparidades entre as células da placenta derivada de fetos de sexos diferentes, fato que ainda não foi descrito na medicina veterinária. Foram coletadas 11 pares de membrana alantoamniótica de cães (ALAM), isoladas por digestão enzimática e cultivadas. Utilizamos amostras de tecido para avaliação histológica e imunohistoquímica. Avaliamos os cultivos celulares para padrões morfológico, proliferativo e de capacidade de diferenciação. A justaposição íntima das membranas alantoideana e amniótica observada nos cortes histológicos justifica estudá-las juntas. Observamos que as células obtidas da ALAM de ambos os sexos apresentaram características semelhantes. As alterações morfológicas foram consistentes entre as amostras, e a viabilidade e a curva de crescimento apresentaram p>0,05. As células demonstraram capacidade de diferenciação nas linhagens adipogênica e osteogênica. Na imunocitquímica, as amostras expressaram a vimentina e os marcadores de pluripotência (Oct-4 e Nanog). Na citometria de fluxo, elas expressaram valores significativos de CD44 e CD90, além da baixa expressão de CD34 e MHCII. Esses resultados indicam não haver diferença entre as células quando comparamos as células da ALAM derivadas de fetos de sexos diferentes, mas sugerem seu uso futuramente na medicina re... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Mesenchymal stem cells (MSCs) studies have proven the influence of the donor's gender in its proliferative and immunomodulatory abilities. Therefore this study aims to investigate the presence of discrepancies among the MSCs of the placenta derived from different sex fetus, which haven't been described in the veterinary medicine. Eleven pairs of canine allantoamniotic membranes (ALAM) were collected,isolated through enzymatic digestion and cultivated. Tissue samples were used for histological and immunohistochemistry assessment. The cell cultures were evaluated for morphological, proliferative, and differentiation potential standards. The intimate juxtaposition of the allantoic and amniotic membranes detected in the histological slides justifies studying them together. Similar characteristics were observed for the cells derived from ALAM in both genders. The morphological alterations were consistent among samples, and viability and growth curve exhibited p>0.05. The cells displayed capability to: differentia... / Mestre