Les protéines sont au coeur de la vie. Ce sont d'incroyables nanomachines moléculaires spécialisées et améliorées par des millions d'années d'évolution pour des fonctions bien définies dans la cellule. La structure des protéines, c'est-à-dire l'arrangement tridimensionnel de leurs atomes, est intimement liée à leurs fonctions. L'absence apparente de structure pour certaines protéines est aussi de plus en plus reconnue comme étant tout aussi cruciale. Les protéines amyloïdes en sont un exemple marquant : elles adoptent un ensemble de structures variées difficilement observables expérimentalement qui sont associées à des maladies neurodégénératives. Cette thèse, dans un premier temps, porte sur l'étude structurelle des protéines amyloïdes bêta-amyloïde (Alzheimer) et huntingtine (Huntington) lors de leur processus de repliement et d'auto-assemblage. Les résultats obtenus permettent de décrire avec une résolution atomique les interactions des ensembles structurels de ces deux protéines. Concernant la protéine bêta-amyloïde (AB), nos résultats identifient des différences structurelles significatives entre trois de ses formes physiologiques durant ses premières étapes d'auto-assemblage en environnement aqueux. Nous avons ensuite comparé ces résultats avec ceux obtenus au cours des dernières années par d'autres groupes de recherche avec des protocoles expérimentaux et de simulations variés. Des tendances claires émergent de notre comparaison quant à l'influence de la forme physiologique de AB sur son ensemble structurel durant ses premières étapes d'auto-assemblage. L'identification des propriétés structurelles différentes rationalise l'origine de leurs propriétés d'agrégation distinctes. Par ailleurs, l'identification des propriétés structurelles communes offrent des cibles potentielles pour des agents thérapeutiques empêchant la formation des oligomères responsables de la neurotoxicité. Concernant la protéine huntingtine, nous avons élucidé l'ensemble structurel de sa région fonctionnelle située à son N-terminal en environnement aqueux et membranaire. En accord avec les données expérimentales disponibles, nos résultats sur son repliement en environnement aqueux révèlent les interactions dominantes ainsi que l'influence sur celles-ci des régions adjacentes à la région fonctionnelle. Nous avons aussi caractérisé la stabilité et la croissance de structures nanotubulaires qui sont des candidats potentiels aux chemins d'auto-assemblage de la région amyloïde de huntingtine. Par ailleurs, nous avons également élaboré, avec un groupe d'expérimentateurs, un modèle détaillé illustrant les principales interactions responsables du rôle d'ancre membranaire de la région N-terminal, qui sert à contrôler la localisation de huntingtine dans la cellule. Dans un deuxième temps, cette thèse porte sur le raffinement d'un modèle gros-grain (sOPEP) et sur le développement d'un nouveau modèle tout-atome (aaOPEP) qui sont tous deux basés sur le champ de force gros-grain OPEP, couramment utilisé pour l'étude du repliement des protéines et de l'agrégation des protéines amyloïdes. L'optimisation de ces modèles a été effectuée dans le but d'améliorer les prédictions de novo de la structure de peptides par la méthode PEP-FOLD. Par ailleurs, les modèles OPEP, sOPEP et aaOPEP ont été inclus dans un nouveau code de dynamique moléculaire très flexible afin de grandement simplifier leurs développements futurs. / Proteins are at the center of life. They are formidable molecular nanomachines specialized and optimized during million years of evolution for well-defined functions in the cell. The structure of proteins, meaning the tridimensional setting of their atoms, is closely related to their function. Absence of structure for a subset of proteins is also recognized to be as crucial. Amyloid proteins is a striking example : they fold into an ensemble of various structures hardly observable experimentally that are associated with neurodegenerative diseases. This thesis, firstly, is on the study of the structural ensemble of the amyloid proteins amyloid-beta (Alzheimer) and huntingtin (Huntington) during their folding and aggregation. Our results describe in details, with an atomic resolution, the characteristic interactions present in the structural ensemble of these two proteins. Concerning the amyloid-beta protein (AB), our results show the structural differences between three of its physiological forms during its first aggregation steps in an aqueous environment. We have then compared these results with those obtained during the past few years by several other research groups using various experimental and simulation protocols. Clear trends come out of this comparison regarding the influence of AB physiological form on its structural ensemble during its first aggregation steps. Their distinct aggregation pathways are rationalized by the identified differences. For their part, the identified similarities offer targets for therapeutical compounds disrupting the aggregation of the neurotoxic oligomers. Concerning the huntingtin protein, we identify the structural ensemble of its functional region at its N-terminal in an aqueous environment and in a phospholipid membrane. In agreement with the available experimental results on the global structure of this region in aqueous solution, our results reveal the dominant interactions, at an atomic precision, in its structural ensemble as well as the influence of its neighboring regions. We have also characterized the stability and the growth of nanotube-like structures that could occur during the aggregation of the amyloid region of huntingtin. Moreover, we have developed, in collaboration with a group of experimentalists, a precise model describing the main membrane interactions of huntingtin N-terminal, which serves as a membrane anchor that controls the localization of huntingtin in the cell. Secondly, this thesis is on the refinement of a coarse-grained model (sOPEP) and on the development of a new all-atom model (aaOPEP) that are both based on the coarse-grained OPEP force field, commonly used to study protein folding and amyloid protein aggregation. The goal behind the optimization of these models is to improve the de novo structure prediction of the PEP-FOLD method. These three models -- OPEP, sOPEP and aaOPEP -- are now also implemented in a new molecular dynamics software that we have developed specifically to greatly ease their future developments.

La maladie d'Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative progressive et irréversible. Une étape précoce de la MA est la relâche neuronale excessive du peptide amyloïde-[bêta] (A[bêta]), qui s'accumule dans le cerveau, s'assemble et se dépose sous forme de plaques A[bêta] insolubles et neurotoxiques. L'A[bêta] est produit suite au clivage amyloïdogénique de la protéine APP, effectué par les sécrétases [bêta] et [gamma] au niveau des endosomes. Il est bien connu que le trafic intracellulaire de l'APP affecte son clivage. L'étude du trafic intracellulaire de cette protéine est donc cruciale pour comprendre ce qui régit la production d'A[bêta]. Certains membres de la famille des récepteurs de lipoprotéines de faibles densités (LDLR), dont SorLA/LR11, interagissent avec l'APP et modulent son clivage en régulant son trafic et/ou en s'associant avec les sécrétases. LRP10, un nouveau membre peu connu des LDLR, trafique entre le Golgi et les endosomes, tout comme SorLA/LR11. Conséquemment, nous avons émis l'hypothèse selon laquelle LRP10 serait un nouveau récepteur de la protéine APP, impliqué dans la régulation du trafic et du clivage de cette dernière ainsi que dans la relâche d'A[bêta]. Nos résultats démontrent que LRP10 et la protéine APP colocalisent au TGN (trans-Golgi network ) et interagissent de façon directe.La surexpression stable de LRP10 dans les cellules de neuroblastome humain SH-SY5Y, provoque une accumulation de la forme mature de l'APP, ainsi qu'une diminution de son clivage et de la production d'A[bêta].La déplétion de LRP10, par la technique d'ARN interférant, provoque l'augmentation de la production d'A[bêta]. De plus, l'expression d'un mutant de LRP10, redistribué aux endosomes précoces, induit la redistribution intracellulaire de l'APP au niveau de ces mêmes endosomes dans les cellules HeLa et SH-SY5Y, tel qu'observé en microscopie confocale.La surexpression stable du mutant de LRP10 dans les SH-SY5Y a aussi démontré une augmentation du clivage amyloïdogénique de l'APP normalement effectué aux endosomes et donc une augmentation de la production d'A[bêta]. Enfin, la comparaison des niveaux d'expression protéique de LRP10 retrouvés dans le cortex frontal et l'hippocampe de cerveaux de patients âgés sains ou atteints de la MA, révèle que l'expression de LRP10 est réduit dans le cerveau des patients atteints de la MA. En conclusion, LRP10 est un nouveau récepteur de l'APP participant à son triage entre le TGN et les endosomes, protégeant ainsi l'APP du clivage amyloïdogénique et de l'accumulation d'A[bêta]. Ainsi, la réduction de l'expression de LRP10 dans le cerveau pourrait augmenter la production de l'A[bêta] et représenter un facteur de risque dans la MA.

L'objectif de ce projet est d'élaborer des composés capables d'interagir avec des processus biologiques impliquant des associations protéines-protéines, soit pour les inhiber, soit pour les marquer. Deux cibles protéiques impliquées dans la maladie d'Alzheimer et formant des fibres amylogènes sont envisagées : la protéine tau et le peptide Aβ40. Notre conception des inhibiteurs consiste à présenter de façon multimérique des composés biologiquement actifs (peptides et molécules organiques) sur un châssis moléculaire, la dicétopiperazine. L'activité biologique de nos composés est évaluée par des tests in vitro et in vivo. Un autre aspect du projet est la conception, la synthèse et la caractérisation d'un peptidomimétique des fibres de la protéine tau.

La maladie d'Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative caractérisée par la présence d'enchevêtrements neurofibrillaires et de plaques séniles. Le composant majoritaire des plaques séniles est le peptide amyloïde Aβ.Dans une première partie de cette thèse, l'objectif a été de caractériser la toxicité du peptide Aβ25-35 après son injection au niveau des ventricules latéraux chez le rat au cours du temps. Nous avons ainsi pu démontrer, entre autre, qu'une seule injection, engendre des déficits mnésiques à court et à long terme qui persistent six semaines après l'injection. Nous avons également montré, entre autre, une astrogliose, une microgliose, une élévation du stress oxydant, ainsi que des phénomènes apoptotiques dans les différentes structures cérébrales étudiées. Le deuxième objectif de cette thèse a été de caractériser le rôle du peptide Aβ25-35 dans la régulation de l'axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien (HPA) au cours du temps. Dans un premier temps nous avons démontré une hyperactivité de l'axe, qui se caractérise par une modification de l'expression des hormones et une modification d'expression et de localisation des récepteurs aux glucocorticoïdes (GC). Nous avons montré que l'injection d'Aβ25-35 induisait un comportement anxieux. Néanmoins la fonctionnalité du rétrocontrôle négatif des GC reste intacte. Alors que l'injection de l'Aβ25-35 modifie la réponse de l'axe HPA à un stress. Nos résultats, dans un modèle pathomimétique, de la MA, montrent que la toxicité amyloïde modifie la fonctionnalité et la réactivité de l'axe HPA, ce qui pourrait participer à la pathophysiologie de la MA. / Alzheimer's disease (AD) is characterized by neurofibrillary tangles and seniles plaques. The major component of senile plaques is the amyloid-β peptide (Aβ). In a first part of this thesis, we characterized the time course toxicity effect of the Aβ25-35 intracerebroventricular (icv) injection in the rat brain. We particulary demonstrated, that only one injection induced memories impairments at short and long term which persisted six weeks after the icv injection. We also shown, a sustain astrogliosis and microgliosis, oxidative stress, apoptotics processes in the differents brain structure of interest.In a second part of this thesis, we characterized the time course impact of Aβ25-35 on hypothalamo-pituitary-adrenal axis during the time. First, we demonstrated an the hyperactivity of the axis, which is characterized by modifications of hormonal concentration associated with modification of the expression and localization of glucocorticoids (GC) receptors. We also demonstrated Aβ25-35 an anxious behavioural in animals. Nevertheless, the functionality of negative feedback is not modified. However, Aβ25-35 injection modify the HPA axis reactivity after acute stress. In conclusions, we shown, in a pathomimetic model of AD that the Aβ25-35 toxicity modifes the reactivity and the functionality of HPA axis, that could be partly involved in the pathophysiology of AD.

La maladie d’Alzheimer est une maladie neurodégénérative, elle représente 70% des formes de démences et affecte près de 860 000 personnes en France. Cette maladie est caractérisée par deux lésions neuropathologiques : les Dégénérescences neurofibrillaires et les Plaques séniles. Ces dernières sont principalement constituées de peptides amyloïdes (A&#946;) résultant du clivage d’une protéine membranaire appelée Précurseur du peptide amyloïde (APP). L’étude des formes familiales monogéniques a montré que des mutations des gènes de l’APP et des Présénilines 1 et 2 conduisaient systématiquement à une augmentation de la production d’A&#946;. Cette observation a permis l’élaboration de la cascade amyloïde plaçant le métabolisme de l’APP au centre du processus physiopathologique. Même si aujourd’hui ce métabolisme commence à être relativement bien connu, plusieurs zones d’ombres subsistent encore. Dans l’optique de caractériser de nouveaux acteurs intervenant dans ce métabolisme, nous avons émis une hypothèse qui repose sur deux constatations : (i) les protéines impliquées dans l’étiologie de la maladie sont différentiellement exprimées entre les cerveaux des patients et ceux des témoins (ii) dans le cerveau, de nombreuses métalloprotéases participent aux même mécanismes que l’APP (adhésion cellulaire, neuroinflammation, plasticité neuronale...), certaines sont aussi directement actrices du métabolisme de l’APP en tant qu’&#945;-sécrétase (ADAM9, ADAM10 et ADAM17) ou en dégradant l’A&#946; (NEP, IDE, MMP2, MMP3 et MMP9). Nous avons donc supposé que les métalloprotéases présentant une différence d’expression entre le tissu cérébral des malades et celui des témoins soient des candidates intéressantes pour moduler le métabolisme et le trafic de l’APP. Une première analyse transcriptomique par biopuce, à partir d’ARN totaux issus des cerveaux de 12 malades et de 12 témoins, nous a permis d’identifier quatre métalloprotéases présentant une différence d’expression significative (p<10-5) : ADAMTS16, ADAM17, ADAM30 et ADAM33. Nous avons cherché à confirmer ce résultat par une autre technologie sur un plus grand nombre d’échantillons (malades n=52 et témoins n=42). Seules ADAM30 et ADAM33 ont pu être validées. Nous avons également pu observer que l’expression d’ADAM30 dans le tissu cérébral des malades est inversement proportionnelle à la quantité d’A&#946;42 déposée dans la parenchyme (A&#946;42 la forme d’A&#946; la plus neurotoxique). De plus, au niveau cérébral, l’expression d’ADAM30 est restreinte aux neurones, cellules sièges du métabolisme de l’APP. Nous avons donc sélectionné ADAM30 comme intervenante potentielle dans le métabolisme de l’APP. Pour tester notre hypothèse, nous avons sous- et sur-exprimé ADAM30 dans deux modèles cellulaires différents. Nous avons mis en évidence que la sur-expression d’ADAM30 entraîne une diminution de l’ensemble des produits du métabolisme de l’APP. En mutant le site catalytique de cette protéase, nous avons remarqué que cette action sur le métabolisme de l’APP est dépendante de cette activité catalytique. De manière cohérente, une sous-expression d’ADAM30 entraîne une augmentation de l’ensemble des produits du métabolisme de l’APP. En utilisant les inhibiteurs alcalisant, nous avons démontré que l’effet d’ADAM30 sur le métabolisme de l’APP met en jeu la dégradation par le lysosome. Des expériences d’immunofluorescence ont attesté qu’ADAM30 est localisée dans le réticulum endoplasmique et l’appareil de Golgi et qu’elle co-localise fortement avec l’APP dans ces organites. Au vu des résultats obtenus durant ces quatre années, nous pensons qu’ADAM30 pourrait être une protéine clé de la régulation de l’APP en inhibant son acheminement jusqu’à la membrane plasmique et en favorisant sa dégradation par le lysosome. [...] / Alzheimer’s disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder of the old age, characterized by the presence of two major neuropathological features : neurofibrillary tangles and senile plaques. These plaques are composed of the A&#946; peptides cleavage product of the amyloid precursor protein (APP). Proteolytic processing of APP is modulated by the action of enzymes &#945;-, &#946;- and &#947;-secretases with the latter two mediating the amyloidogenic pathway. Suggesting that processing of APP is a key step in the pathology of AD. However, even if extensively studied, this APP metabolism is still not fully characterized. With this background, we postulate that the characterization of new actors of the APP metabolism might help for a more subtle understanding of this APP metabolism and trafficking. We focused on the ADAMs and related proteins with the hypothesis that ADAMs and related proteins, under- or over-expressed in the brain of AD cases compared with the one of controls, may be of particular interest. Beyond the obvious implication of several ADAMs as &#945;-secretases, this hypothesis was also driven by several observations : (i) ADAMs have been involved in numerous biological processes including brain development, plasticity and repair as APP; (ii) several metalloproteases (MMP-2, -3 and -9) have been described to degrade A&#946; peptides. Using microarray to screen the expression of 117 ADAMs and MMPs was analyzed using total RNA extracted from cerebral tissue of 12 AD cases and 12 controls. We observed that 4 ADAMs were differentially expressed. We first confirmed that the ADAM30 expression was decreased in AD brains and we observed that ADAM30 under-expression was correlated with an increase in A&#946;42 deposition in AD brains. Consistently, over-expression of ADAM30 led to decrease APP metabolism and as a consequence, A&#946; secretion in two different cell lines (Moreover, under-expressed ADAM30 increases APP processing and A&#946; generation). This modification of the APP metabolism was directly linked to the ADAM30 catalytic properties. Our data suggest that catalytic activity of ADAM30 takes an important place in APP processing in a lysosome dependent manner and AD pathophysiological process.

La Barrière Hémato-Encéphalique (BHE) est une interface localisée au niveau des cellules endothéliales des capillaires cérébraux (CECs). Elle présente des caractéristiques structurales et métaboliques spécifiques restreignant considérablement les échanges entre le sang et le cerveau dans le but de maintenir l’homéostasie du système nerveux central (SNC). La présence de transporteurs et récepteurs au niveau de CECs permet l’apport de nutriments essentiels au fonctionnement cérébral. L’expression de ces propriétés est induite par l’environnement cérébral et notamment par la population astrocytaire. Dans notre laboratoire, la BHE est reconstituée in vitro en co-cultivant des CECs bovines et des cellules gliales primaires de rat reproduisant les principales caractéristiques de la BHE in vivo. Son utilisation a permis de mettre en évidence une voie originale de transcytose (récepteur-dépendante) assurant le transport des lipoprotéines de basse densité (LDL) vers le parenchyme cérébral. Nous avons caractérisé les premières étapes de ce processus et démontré que celles-ci impliquent des structures cellulaires spécialisées comme les cavéoles et les cavéosomes, permettant aux lipoprotéines d’être relarguées intactes vers le compartiment cérébral. Récemment, de nombreux travaux ont placé la BHE au centre des échanges des peptides β-amyloïde (Aβ) entre le sang et le cerveau. Un défaut des mécanismes de transport est suspecté d’être à l’origine de l’accumulation cérébrale de ces peptides responsables de la maladie d’Alzheimer (MA). En utilisant notre modèle in vitro de BHE, nous avons étudié l’implication des CECs dans les échanges de ces peptides. Nous avons démontré l’implication du récepteur « receptor for advanced glycation end-products » (RAGE) dans l’entrée vers le compartiment cérébral des peptides Aβ. Ce transport est spécifique et implique la voie des cavéoles. L’implication de pompes d’efflux telles que la P-glycoprotéine (P-gp) et la « breast cancer resistance protein » (BCRP) dans la restriction de l’influx des peptides Aβ a également été mise en évidence. D’autre part, des résultats préliminaires suggèrent que le récepteur « low density lipoprotein receptor-related 1 » (LRP1) n’est pas impliqué dans l’efflux des peptides Aβ. Ces résultats contribuent à apporter une meilleure compréhension du rôle de la BHE dans la MA et permettent d’envisager de nouvelles approches thérapeutiques. / The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic interface located at the brain capillary endothelial cells (BCECs) level. This barrier possesses some morphological and enzymatic properties whose aim is to maintain homeostasis of central nervous system (CNS) by firmly reducing the passages between blood and brain. BCECs express carrier-mediated transporters and receptors allowing the income of nutrients that are essential to brain function. These BBB properties come from brain environment and especially from the astrocytic population. In our laboratory, we have developed an in vitro BBB model consisting of a co-culture of bovine BCECs and new-born rat glial cells that closely mimics the in vivo situation. In this in vitro model, an original transcytosis pathway (receptor-dependent) that ensures low density lipoproteins (LDL) transport into the brain parenchyma has been discovered. We have characterized the first steps of this transport and we have shown that involve specialized cellular structures such as caveolae and caveosomes, allowing intact lipoproteins to be released into the brain compartment. Recently, many studies have considered the BBB like a very suitable site for the exchanges of amyloid β (Aβ) peptides between blood and brain. An alteration in the mechanisms of transport is suspected to result in cerebral accumulation of these peptides which are responsible for Alzheimer's Disease (AD). Using our in vitro model, we investigated the involvement of the BCECs in the exchanges of these peptides. Our works show an asymmetrical transport across the BBB suggesting the involvement of specific receptors and transporters. We have demonstrated the involvement of « receptor for advanced glycation end products » (RAGE) in the entry into the brain compartment. This transport is specific and involves the caveolae’s pathway. The involvement of P-glycoprotein (P-gp) and « breast cancer resistance protein » (BCRP) efflux pumps in restricting the influx of Aβ peptides was also highlighted. Moreover, preliminary results suggest that « low density lipoprotein receptor related-1 » (LRP1) is not involved in the efflux of Aβ peptides. These studies help to provide a better understanding of the role of the BBB in AD and allow to consider new therapeutic approaches.

Les biofilms sont des édifices macromoléculaires qui résultent de l'adhérence de microorganismes à une surface. Ils sont constitués de cellules enchâssées dans un réseau d'exopolymères d'origine biologique qui forment une matrice extracellulaire. Les biofilms posent des problèmes technologiques et sanitaires dans de nombreux domaines, aussi bien agroalimentaire, médical, ou industriel. Comprendre les mécanismes de formation de ces structures est donc un enjeu majeur. Malgré une grande diversité de la structure des biofilms, de grands principes semblent en régir la composition. Ainsi, la présence de polysaccharides comme l'alginate et la cellulose joue un rôle majeur dans leur formation et dans la définition de leurs propriétés mécaniques. Si la présence de polymères protéiques comme les fibres amyloïdes semble avoir un caractère universel au sein des biofilms, leur rôle dans la formation de la matrice et dans ses propriétés mécaniques restait à définir. Lors de cette étude, nous avons caractérisé la structure et la composition de trois biofilms monobactériens issus de trois espèces différentes P. aeruginosa NK 125502, S. enterica CIP 58.58 et S. epidermidis CIP 53.124. Nous avons décrit la formation de fibres amyloïdes par différents peptides issus de protéines bactériennes impliquées dans la formation de biofilm et montré par différentes techniques qu'ils sont capables de former des fibres amyloïdes. Nous avons notamment identifié un peptide amyloïde, suggérant la présence de ce type de fibre au sein des biofilms de Staphylococcus, mais aussi plus généralement dans les biofilms des espèces exprimant une protéine de type Bap (Biofilm associated protein). Enfin, nous avons analysé les propriétés mécaniques de différentes matrices synthétiques à base d'alginate et de méthyl-cellulose, en présence et en absence de protéines et de peptides amyloïdes afin de mieux comprendre l'apport qu'a ce type de fibre sur les propriétés de ces structures. Ainsi, les fibres amyloïdes modifient les propriétés mécaniques des gels synthétiques, permettant d'augmenter la déformation sous contrainte. En conclusion, ce travail apporte de nouveaux éléments pour la compréhension du rôle des fibres amyloïdes dans le renforcement de la matrice du biofilm. La capacité à former des fibres amyloïdes par un peptide issu de la protéine Bap de S. epidermidis suggère que cette propriété est plus largement présente au sein de cette famille de protéines. Les travaux menés au cours de cette thèse, et l'ensemble des techniques utilisées, avec notamment la mise au point de l'observation de la biréfringence du rouge Congo par microscopie confocale permettront de développer les études sur cette famille de protéines amyloïdes ainsi que sur les matrices complexes de type biofilm / Biofilms are macromolecular structures which result from the adhesion of microorganisms to a surface. They consist of cells embedded in a network of exopolymers of biological origin which form an extracellular matrix. Biofilms pose technological and health problems in many industrial and medical domains. Understanding the mechanisms of formation of these structures is a major challenge. Despite a great diversity in the structure of biofilms, universal principles seem to govern their composition. Thus, the presence of polysaccharides such as alginate and cellulose plays a major role in their formation and in determining their mechanical properties. If the presence of protein polymers such as amyloid fibers seems to be universal within biofilms, their role in the formation and in the mechanical properties of the matrix remains to be defined. In this study, we characterized the structure and composition of monobacterial biofilms from three different species: P. aeruginosa NK 125502, S. enterica CIP 58.58 and S. epidermidis CIP 53124. We described the formation of amyloid fibers by different peptides from proteins involved in bacterial biofilm formation. Morover our results suggest the presence of this type of fiber within biofilms of Staphylococcus, but also more generally in biofilms of bacteria expressing a protein of the Bap family (Biofilm associated protein). Finally, we analyzed the mechanical properties of various synthetic matrices made of alginate and methyl-cellulose in the presence and absence of protein and amyloid peptides in order to better understand the contribution of this type of fiber on the properties of these matrices. Hence, amyloid fibers modify the mechanical properties of synthetic gels, by increasing the deformation under stress.In conclusion, this study provides new evidence for understanding the role of amyloïd fibers in the biofilm matrix strengthening. The formation of amyloid fibers by the Bap protein of S. epidermidis suggests the possibility of a general amyloid behavior in the Bap protein family. A new application of confocal laser scanning microscopy was developped: the use of the confocal microscope to image the birefringence of Congo red.

La maladie d'Alzheimer est la maladie neurodégénérative la plus fréquente dont la prévalence augmente avec l'âge. Elle résulte d'un excès de peptide β-amyloïde (Aβ) capable de s'agréger, de s'insérer dans la membrane plasmique des cellules et de s'organiser en pores perméables au calcium. Cette insertion est modulée par la composition lipidique de la membrane dont le cholestérol. Alors que plusieurs études indiquent que le cholestérol interagit avec le peptide Aβ et module sa toxicité, les mécanismes moléculaires sous-jacents demeurent mal compris.A l'aide d'approches expérimentales multiples nous avons évalué le rôle du cholestérol dans l'insertion du peptide Aβ à la membrane ainsi que dans le processus d'oligomérisation responsable de la formation de pore. Notre étude identifie le domaine 22-35 du peptide Aβ comme domaine d'interaction avec le cholestérol au sein duquel deux acides aminés sont essentiels : la Val24 et la Lys28. Ce petit fragment s'organise en pore dans la membrane plasmique et déclenche une entrée massive de calcium dans les cellules. Cet effet n'est plus observé lorsque les cellules ont moins de cholestérol dans leur membrane ou en présence de zinc, un inhibiteur des pores amyloïdes. Le cholestérol maintient le peptide de façon oblique et en hélice α. Cette orientation favorise l'établissement d'une liaison hydrogène entre l'Asp27 d'un peptide et la Lys28 d'un peptide voisin, qui stabilise le pore. Enfin, notre étude montre que le bexarotène, un composé anti-Alzheimer dont le mécanisme d'action est controversé, prévient l'insertion du peptide dans des membranes et empêche la formation de pores dans la membrane plasmique des cellules nerveuses. / Alzheimer's disease is the most common neurodegenerative disease whose prevalence increases with age. It is the result of excess β-amyloid peptide (Aß), which self-organizes. This peptide is able to insert into the plasma membrane of cells where their organization in calcium permeable pores triggers the early stages of toxicity. This insertion is directly modulated by the lipid composition of the membrane especially cholesterol. Whereas several studies indicate that cholesterol interacts with and modulates Aß toxicity, the underlying molecular mechanisms remain poorly understood.Using computational, physico-chemical and cellular approaches, we evaluated the role of cholesterol in the insertion of the Aß peptide in the membrane and in the oligomerization process responsible for pore formation. Our study identifies the 22-35 fragment of Aβ as a functional cholesterol-binding domain in which two amino acids are essential: Val24 and Lys28. When incubated with SH-SY5Y cells, the minimal Aβ22-35 peptide caused an increase of Ca2+ entry. This effect was no longer observed in cholesterol-depleted cells and was inhibited by zinc, a classical blocker of amyloid channels. Cholesterol specifically induced a tilted alpha-helical topology of Aβ22-35 which appeared to facilitate the oligomerization process through the establishment of a hydrogen bond network involving Asn27 and Lys28. Finally, our study showed that bexarotene, an anti-Alzheimer compound whose mechanism of action is still under debate, competitively inhibited Aβ insertion into cholesterol-containing membranes and prevented calcium-permeable amyloid pore formation in the plasma membrane of neural cells.

La maladie d'Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative qui est la cause la plus fréquente de démence chez les personnes âgées. Il est proposé que celle-ci ait pour origine l'agrégation du peptide l'amyloïde-ß (Aß) qui, produit à l'état monomérique, est retrouvé sous formes de plaques séniles dans le cerveau des patients. Lors de l'agrégation, le peptide se retrouve sous plusieurs formes, dont les formes oligomériques qui présentent la plus grande toxicité envers les neurones. Bien qu'il existe une grande diversité de structures chimiques utilisées comme sondes des plaques séniles, le développement d'outils de détection des formes précoces du processus d'agrégation reste un défi scientifique majeur. Pour cela, il est nécessaire de connaitre à l'échelle moléculaire la nature du(des) site(s) d'interaction entre la sonde et le peptide. Ceci permettrait l'élaboration rationnelle de ligands plus spécifiques pour chaque forme du peptide Aß (monomère, oligomère,...). Dans le cadre de ces travaux de thèse, la mise au point de synthèses modulaires de différents dérivés du motif 2-aryl-benzothiazole connu pour son interaction avec les agrégats a été effectuée. Ces dérivés permettent l'étude de l'agrégation et de l'identification du(des) site(s) d'interaction par différentes techniques. Au cours de ces travaux, la synthèse et l'étude de quatre principaux dérivés du 2-aryl-benzothiazole ont été réalisées ; (i) un dérivé comportant une amine secondaire présentant des propriétés photophysiques intéressantes, obtenu en 11 étapes avec un rendement global de 23 % ; (ii) un dérivé avec un motif ferrocène pour des études en électrochimie, obtenu avec 13 % de rendement en 11 étapes ; (iii) un dérivé comportant un motif TEMPO radicalaire pour des études par RPE et RMN, obtenu avec un rendement 16 % en 10 étapes ; et (iv) un dérivé comportant un motif diazirine obtenu avec un rendement global de 8 % en 19 étapes pour une étude de marquage par photo-affinité (création d'un lien covalent après irradiation) suivi d'une étude par spectrométrie de masse. Outre les synthèses de ces sondes, des résultats préliminaires des études menées par études photophysiques, électrochimie, RPE, RMN et spectrométrie de masse seront présentées dans ce manuscrit. / Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disease which is the most common cause of dementia in elderly people. It is proposed that it originates from the aggregation of amyloid-ß peptide (Aß), produced in the monomeric state, which is found as senile plaques in the brain of patients. During aggregation, the peptide is found in several forms, including oligomeric forms that are the most toxic to neurons. Although there is a wide variety of chemical structures used as probes for senile plaques, the development of tools to detect early forms of the aggregation process remains a major scientific challenge. To accomplish this, it is necessary to know, at the molecular level, the nature of the interaction site(s) between the probe and the peptide. This would allow the rational design of more specific ligands for each form of the Aß peptide (monomer, oligomer,...). As part of this thesis work, the development of modular syntheses of various derivatives of the 2-aryl-benzothiazole scaffold, known for its interaction with aggregates, was carried out. These derivatives allow the study of the aggregation and identification of the interaction site(s) by different techniques. During this work, the synthesis and study of four main 2-aryl-benzothiazole derivatives were carried out; (i) a derivative containing a secondary amine with interesting photophysical properties, obtained in 11 steps with an overall yield of 23%; (ii) a derivative with a ferrocene unit for electrochemistry studies, obtained with 13% yield in 11 steps; (iii) a derivative with a radical TEMPO moiety for EPR and NMR studies, obtained with a 16% yield in 10 steps; and (iv) a derivative with a diazirine unit obtained with an overall yield of 8% in 19 steps for photoaffinity labelling study (creation of a covalent bond after irradiation) followed by mass spectrometry analysis. In addition to the syntheses of these probes, preliminary results of studies conducted by fluorescence, electrochemistry, EPR, NMR and mass spectrometry will be presented in this manuscript.

Au cours de la voie de maturation amyloïdogène, la βAPP subit l'action séquentielle de deux activités enzymatiques appelées sécrétases : la β-sécrétase puis la γ-sécrétase qui conditionne la longueur des peptides Aβ en C-terminal. L'activité γ-sécrétase dépendante des présénilines est portée par un complexe multi protéique composé d'au moins quatre partenaires : Aph-1, Pen-2, la nicastrine et les présénilines (PS1 ou PS2). Ces présénilines subissent une coupure protéolytique par une « présénilinase » qui génère deux fragments qui s'apparient en hétérodimère, forme biologiquement active au sein du complexe. La γ-sécrétase au sens générique du terme est impliquée dans la protéolyse de nombreux substrats et sa nature reste très discutée.<br />Dans une première partie de ma thèse, je me suis intéressé à la production du peptide amyloïde. Dans ce but, j'ai mis au point 3 dosages enzymatiques qui permettent de mesurer des activités de type γ- et ε-sécrétase hydrolysant la βAPP et ε-sécrétase clivant Notch. Ces dosages sont un outil permettant de répondre à plusieurs questions : l'activité g sécrétase est-elle portée par plusieurs enzymes, dépendantes ou indépendantes des présénilines ? Les activités g- et ε-sécrétase sont elles portées par une seule et même enzyme ? L'activité ε-sécrétase qui clive Notch est-elle identique à celle coupant la βAPP ?<br />Les premiers résultats obtenus avec le substrat dérivé du site γ-sécrétase sur la βAPP (JMV2660) ont permis la mise en évidence d'une activité γ-sécrétase dans un système cellulaire dépourvu de présénilines, activité qui, paradoxalement, conserve une sensibilité à un inhibiteur classique de γ-sécrétase qui interagit physiquement avec les présénilines. La mise au point des deux autres dosages a conduit à la mise en évidence de l'implication de plusieurs activités enzymatiques regroupées sous le terme générique γ-sécrétase. Au final, ces dosages, fiables et reproductibles, permettront de tester en routine et à haut débit des inhibiteurs capables de discriminer les différentes activités de type γ-sécrétase et ε-sécrétase.<br />Un autre aspect de mon travail de thèse a concerné la dégradation du peptide amyloïde et plus particulièrement les modifications qui se produisent au niveau de son extrémité N-terminale. Dans le cadre de cette étude, j'ai pu démontrer l'implication de l'aminopeptidase A dans la dégradation de l'extrémité N-terminale du peptide amyloïde grâce à une approche utilisant des inhibiteurs spécifiques et à la mise au point un essai enzymatique de l'activité gamma-sécrétase basé sur l'hydrolyse d'un substrat recombinant in vitro.<br />Nous disposons au laboratoire d'un inhibiteur d'aminopeptidase A sous forme de pro-drogue active in vivo, ainsi, nous pourrons confirmer ces résultats sur des modèles de souris transgéniques « alzheimerisées » mais également déterminer l'impact d'un traitement ciblant l'aminopeptidase A sur le développement de la pathologie.