La maladie d’Alzheimer est actuellement la forme de démence la plus courante. Les causes, les facteurs de risques ainsi que le(s) mécanisme(s) conduisant à l’apparition des symptômes ne sont pas encore clairement connus. Néanmoins, le rôle central du peptide amyloïde (Aβ) dans le développement de la maladie a été démontré au travers de nombreuses recherches et fait actuellement l’unanimité. L’espèce oligomérique d’Aβ est plus précisément pointée doigt comme l’espèce la plus toxique. La formation des oligomers, au cours du processus d’agrégation, conduit à une population hétérogène en termes de taille et morphologies limitant la compréhension actuelle de leur implication dans le processus pathologique ainsi que dans l’initiation de la maladie. <p>Notre étude structurale minutieuse du processus d’agrégation du peptide Aβ démontre la formation d’agrégats dont le degré d’assemblage augmente au cours du temps. Nous avons montré que les agrégats identifiés comme étant des oligomères adoptent une structure en feuillets β antiparallèles. Tandis que l’interconversion de la structure β d’antiparallèle à parallèle conduit à la formation de fibrilles. Sur base de l’interprétation des spectres infrarouges analysés par corrélation à 2 dimensions, nous suggérons que ce changement de conformation est rendu possible grâce aux modifications des liens hydrogènes. En effet, les liens hydrogènes intramoléculaires qui stabilisent la structure antiparallèle des brins β disparaissent en faveur de liens intermoléculaires conduisant à la formation de feuillets β parallèles. De plus, ce changement de conformation requière la rotation des brins β le long de leur axe respectif. <p>Notre travail a pu mettre en avant le rôle central des oligomères dans la pathologie d’une part par leur rôle d’intermédiaires transitoires nécessaires et obligatoires à la formation des fibrilles mais également par la relation étroite qui existe entre leur structure en feuillets β antiparallèles et leur toxicité cellulaire. La modulation et/ou suppression de cette conformation est requise spécifiquement pour réguler leur toxicité et empêcher le processus de mauvais reploiement du peptide conduisant au développement de la maladie. <p>Enfin, nous avons également apporté de nouvelles informations concernant l’implication des membranes biologiques dans le mécanisme de toxicité des oligomères. Nos résultats démontrent que l’interaction du peptide avec un modèle de la membrane biologique ne conduit pas à la déstabilisation de cette dernière. L’hypothèse suggérant la formation de pores et/ou de canaux ioniques comme mécanisme de cytotoxicité est de facto réfutée par notre travail. Néanmoins, nous suggérons que l’interaction du peptide avec les lipides modifie le processus d’agrégation décrit dans la première partie de notre travail. Elle accélère l’étape de nucléation permettant la formation rapide d’oligomères à la surface de la membrane et accentuant ainsi leur probabilité d’interaction avec les protéines membranaires neuronales telles que les récepteurs de neurotransmetteurs./<p>Aggregation of amyloid-β peptides (Aβ1-40 and Aβ1-42) leads to formation of heterogeneous<p>toxic species, oligomers and fibrils, implicated in Alzheimer’s disease. As oligomers were<p>identified as the most cytotoxic entities, our research did focus on their implications in<p>pathology and the Aβ aggregation process which are currently not fully understood.<p>Using ATR-FTIR spectroscopy, we demonstrated that Aβ oligomers adopt an antiparallel β-<p>sheet structure. β-sheet interconversion from antiparallel to parallel seems to be an important<p>step in the Aβ oligomers-to-fibrils transformation. Furthermore, 2-D correlation analysis of<p>infrared spectra recorded during aggregation showed that Aβ isoforms undergo different β-<p>sheet reorganizations explaining their distinct aggregation kinetics. Aβ1-40 misfolding seems<p>to be related to a greater extent of secondary structure changes (increase of β-sheet structure<p>while α-helices and random coil structures content decrease). On the contrary, the same<p>analysis for Aβ1-42 suggests that a possible β-strand ‘rotation’ triggering inter-H bonding<p>formation and stabilizing fibrils may probably explain the antiparallel to parallel β-sheet<p>conversion.<p>We also provided evidence that cytotoxicity is strongly related to the oligomeric antiparallel<p>β-sheet structure of Aβ. The concomitant absence of antiparallel β-sheet structure due to<p>incubation with whey protein-derived peptide hydrolysate strongly suggests that cytotoxicity<p>and β-sheets organization are related.<p>Formation of β-barrel spanning the lipid membrane has been proposed to explain this Aβ<p>structure-toxicity relationship. In the last part of our work, we demonstrated that the<p>interaction of Aβ1-42 with anionic lipid membranes creates and/or stabilizes specific-size<p>oligomers. These oligomers, especially the dodecamer, are known to be the most toxic.<p>Nevertheless, we could not show that these specific oligomers are implicated in membrane<p>destabilization. Further works are needed to separate and study the individual properties of<p>each oligomer. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La dégénérescence maculaire liée à l’âge ou DMLA est une pathologie oculaire qui touche près d’un million de personnes en France, et représente la première cause de cécité légale dans les pays industrialisés. C’est une affection multifactorielle (environnement, génétique), dans laquelle les stress inflammatoires, métaboliques et oxydants interviennent et aboutissent à la mort des photorécepteurs. L’apparition des drusen (dépôts de matériel extracellulaire contenant de l’amyloïde-β (Aβ)), entre les cellules de l’épithélium pigmentaire de la rétine (EPR) et la membrane de Brush, représente un facteur de risque de développement de la DMLA. De plus, le 4-hydroxynonenal (4-HNE) est un marqueur de stress oxydant dans la rétine de patients de différentes pathologies dégénératives comme la DLMA. L’identification des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans les dégénérescences rétiniennes la pathogenèse de la DMLA constitue un enjeu de santé publique, puisqu’elle permettrait de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques anti-dégénératives.Le but de mon travail de thèse a été dans un premier temps de mieux comprendre le rôle de l’Aβ dans la dégénérescence rétinienne.Nous avons montré que l’Aβ induit une activation rapide des cellules microgliales, une gliose soutenue des cellules gliales de Müller (CGM), un œdème dans la rétine interne et une apoptose des photorécepteurs. La dégénérescence des photorécepteurs est en corrélation avec une activation soutenue de PERK, impliquée dans la voie pro-apoptotique de la réponse UPR. Par ailleurs la gliose des CGM est caractérisé par une délocalisation des canaux Kir4.1, une diminution de l’expression d’AQP4 et de la glutamine synthetase (GS), et une augmentation de l’expression des canaux Kir2.1 et du transporteur GLAST1, suggérant une dérégulation de l’homéostasie rétinienne contrôlée par ces protéines. Nous avons montré que l’inhibition de la réponse inflammatoire, par l’utilisation de l’indomethacine, un inhibiteur non stéroïdien de de la cyclooxygénase (COX) 2, réverse l’effet de l’Aβ sur l’expression des canaux Kir4.1 et sur GLAST1 mais pas celle de la GS et d’AQP4, suggérant un couplage partiel entre la gliose et la réponse inflammatoire dans notre modèle d’injection sous-rétinienne d’Aβ.Dans un deuxième temps, nous nous sommes intéressés au rôle du 4-HNE dans les CGM, un produit de peroxydation lipidique, qui est produit dans la rétine sous l’effet de l’Aβ. Nous avons observé qu’un stress oxydant unique et létal induit par le 4-HNE, entraîne la mort des CGM par apoptose dépendante de l’activation des caspases. L’utilisation d’antioxydants impliqués dans la régénération du glutathion (GSH), protège contre la mort des CGM. L’analyse du transcriptome des CGM soumises au 4-HNE a permis de mettre en évidence une réponse transcriptionnelle adaptative des CGM : une activation de la défense anti-oxydante, de la réponse UPR (unfolded protein response) au stress du réticulum endoplasmique, et un phénotype anti-inflammatoire. Par ailleurs, la surexpression de l’APP (amyloid protein precursor), dont l’expression du transcrit est augmentée sous l’effet du stress oxydant dans les CGM, protège ces cellules contre la mort induite par le 4-HNE. Cette protection est associée à une augmentation des capacités anti-oxydantes et à une activation de la voie de survie de la réponse UPR. L’ensemble de nos résultats montre un rôle de l’Aβ dans la dégénérescence des photorécepteurs et indique que le métabolisme de l’APP, ainsi que les voies de survie et pro-apoptotique de la réponse UPR pourraient constituer des cibles thérapeutiques contre la dégénérescence rétinienne induite par l’Aβ ou les stress oxydants. / Age related macular degeneration (AMD) is a leading cause of blindness in western countries and affects one million people in France. Multiple risk factors (genetics, environment) are involved in the pathogenesis of AMD. In addition, the AMD pathogenesis is strongly associated with chronic oxidative stress and inflammation that ultimately lead to photoreceptor death. AMD is characterized by the formation of drusen, extracellular deposits, including amyloid-β (Aβ), between the retinal pigmented epithelium and Bruch’s membrane. Moreover, 4-hydroxynonenal (4-HNE) is an oxidative stress marker of different retinal diseases including AMD. The determination of molecular and cell mechanisms involved in retinal degeneration and the pathogenesis of AMD is required in order to develop new therapeutic anti-degenerative approaches. The aim of our study was first to investigate the role of Aβ in retinal degeneration. We demonstrated that subretinal injection of Aβ induces an early activation of microglial cells, a sustained retinal Müller glial (RMG) cells gliosis, an oedema in the internal part of retina and photoreceptors apoptosis. The photoreceptors apoptosis was correlated with a sustained activation of PERK, a kinase implicated in the pro-apoptotic pathway of UPR (unfolded protein response). In addition, RMG gliosis has been characterized by a Kir4.1 channel redistribution, a down-regulation of AQP4 and glutamine synthetase (GS) expression, and an up-regulation of Kir2.1 channel and GLAST1 transporter expression, suggesting a dysregulation of the retinal homeostasis which is controlled by these proteins. The inhibition of the inflammatory response using indomethacin, a non-steroidal and non-specific cyclooxygenase (COX) 2 inhibitor, reversed Aβ-induced Kir4.1 channel redistribution and GLAST1 up-regulation but not GS and AQP4 down-regulation, suggesting a partial coupling between gliosis and inflammatory response in retinal degeneration after subretinal injection of Aβ in mice. The second part of our study aimed to investigate the effects on RMG cells of 4-HNE, a lipid peroxidation product that is up-regulated in retina after Aβ injection. We have shown that a single lethal oxidative stress using 4-HNE induces RMG cells apoptosis associated with caspase 3 and caspase 9 activation. Pre-treatment of RMG cells with anti-oxidative molecules involved in glutathione regeneration restored cell viability. Transcriptome analysis of RMG cells treated with 4-HNE showed an adaptive transcriptional response consisting in an activation of anti-oxidative stress cell defense, activation of UPR in response to endoplasmic reticulum stress and anti-inflammatory phenotype. APP (amyloid protein precursor) overexpression, which the transcript is up-regulated in RMG cells under oxidative stress, protects from 4-HNE-induced cell death. This protection is associated with an up-regulation of anti-oxidative cell defense and an activation of the pro-survival pathway of UPR. Our study pinpoints the role of Aβ in photoreceptors degeneration and suggests that targeting APP metabolism, pro and anti-apoptotic pathways of the UPR response may hel develop selective methods against retinal degeneration implicating Aβ and oxidative stress.

Alzheimer's disease is the most common type of dementia in the elderly; it is characterized by early deficits in learning and memory formation and ultimately leads to a generalised loss of higher cognitive functions. While amyloid beta (Aβ) and tau are traditionally associated with the development of Alzheimer disease, recent studies suggest that other factors, like the intracellular domain (APP-ICD) of the amyloid precursor protein (APP), could play a role. In this study, we investigated whether APP-ICD could affect synaptic transmission and synaptic plasticity in the hippocampus, which is involved in learning and memory processes. Our results indicated that overexpression of APP-ICD in hippocampal CA1 neurons leads to a decrease in evoked AMPA-receptor and NMDA-receptor dependent synaptic transmission. Our study demonstrated that this effect is specific for APP-ICD since its closest homologue APLP2-ICD did not reproduce this effect. In addition, APP-ICD blocks the induction of long term potentiation (LTP) and leads to increased of expression and facilitated induction of long term depression (LTD), while APLP2-ICD shows neither of these effects. Our study showed that this difference observed in synaptic transmission and plasticity between the two intracellular domains resides in the difference of one alanine in the APP-ICD versus a proline in the APLP2-ICD. Exchanging this critical amino-acid through point-mutation, we observed that APP(PAV)-ICD had no longer an effect on synaptic plasticity. We also demonstrated that APLP2(AAV)-ICD mimic the effect of APP-ICD in regards of facilitated LTD. Next we showed that the full length APP-APLP2-APP (APP with a substitution of the Aβ component for its homologous APLP2 part) had no effect on synaptic transmission or synaptic plasticity when compared to the APP-ICD. However, by activating caspase cleavage prior to induction of LTD or LTP, we observed an LTD facilitation and a block of LTP with APP-APLP2-APP, effects that were not seen with the full length APLP2 protein. APP is phosphorylated at threonine 668 (Thr668), which is localized directly after the aforementioned critical alanine and the caspase cleavage site in APP-APLP2-APP. Mutating this Thr668 for an alanine abolishes the effects on LTD and restores LTP induction. Finally, we showed that the facilitation of LTD with APP-APLP2-APP involves ryanodine receptor dependent calcium release from intracellular stores. Taken together, we propose the emergence of a new APP intracellular domain, which plays a critical role in the regulation of synaptic plasticity and by extension, could play a role in the development of memory loss in Alzheimer’s disease. / La maladie d’Alzheimer est la forme la plus commune de démence liée au vieillissement ; elle est caractérisée par des déficits précoces d’apprentissage et de mémorisation et entraîne à terme une perte généralisée des fonctions cognitives supérieures. Alors que l’amyloïde-bêta (Aβ) et la protéine tau sont traditionnellement associées au développement de la maladie d’Alzheimer, des études récentes suggèrent que d’autres facteurs, tels que le domaine intracellulaire (APP-ICD) du précurseur de la protéine amyloïde (APP), pourraient jouer un rôle. Dans notre étude, nous avons testé si l’APP-ICD pourrait affecter les mécanismes de transmission ou de plasticité synaptique dans l’hippocampe, qui sous-tendent les processus d’apprentissage et de mémorisation. Nos résultats ont indiqué que la surexpression de l’APP-ICD dans des neurones du CA1 de l’hippocampe entraînait une diminution de la transmission synaptique dépendante des récepteurs AMPA et NMDA. Notre étude a montré que cet effet était spécifique de l’APP-ICD puisque son plus proche homologue l’APLP2-ICD n’a pas eu cet effet. De plus, l’APP-ICD entraînait un blocage de la potentialisation à long terme (LTP), une augmentation de l’expression et une facilitation de l’induction de la dépression à long terme (LTD), mais l’APLP2-ICD n’a eu aucun de ces effets. Notre étude a montré que cette différence observée en transmission et en plasticité synaptique entre les deux peptides réside dans le changement d’une seule alanine dans l’APP-ICD pour une proline dans l’APLP2-ICD, et que l’APP(PAV)-ICD n’avait pas d’effet sur la plasticité synaptique. Nous avons aussi démontré que l’APLP2(AAV)-ICD mimait l’effet de l’APP-ICD pour la facilitation de la LTD. Ensuite nous avons montré que la longue forme APP-APLP2-APP (APP avec un changement de la séquence de l’Aβ pour celle homologue de l’APLP2) ne montrait pas d’effet en comparaison avec l’APP-ICD, ni sur la transmission synaptique ni sur la plasticité synaptique. Cependant, en activant le clivage par les caspases préalablement à l’induction de la LTD ou la LTP, nous avons observé une facilitation de la LTD et un iii blocage de la LTP avec l’APP-APLP2-APP, des effets que nous n’avons pas reproduit avec la longue forme APLP2. La thréonine 668 phosphorylable se trouve immédiatement après l’alanine et le site de clivage par les caspases dans l’APP-APLP2-APP. La mutation de la Thr668 pour une alanine a aboli son effet sur la LTD et restauré la LTP. Finalement, nous avons montré que la facilitation de la LTD par l’APP-APLP2-APP dépendait de la libération de calcium intracellulaire par les récepteurs ryanodines. En conséquence, nous proposons l’émergence d’un nouveau domaine de l’APP jouant un rôle critique, en plus de l’Aβ, dans les processus à la base de l’apprentissage et qui en conséquence pourrait jouer un rôle dans le développement de la maladie d’Alzheimer.

Les prions sont des agrégats amyloïdes infectieux. Le prion [Het-s] de Podospora anserina est un des prions le mieux caractérisé. Le prion [Het-s] est impliqué dans l’incompatibilité végétative – un processus biologique qui a lieu au cours des anastomoses entre des souches génétiquement différentes. Quand une souche [Het-s] fusionne avec une souche exprimant l’allèle alternatif du gène het-s – l’allèle het-S – une réaction de mort cellulaire programmée est déclenchée. Les deux protéines diffèrent de 13 acides aminés et partagent une architecture en deux domaines ; un domaine globulaire en N-terminal nommé HeLo et un domaine PFD (Prion Forming Domain) en C-terminal. Il a été établi qu’en présence des fibres amyloïdes de [Het-s], la protéine HET-S agit en ‘pore-forming’ toxine : la transconformation du PFD de HET-S par les fibres amyloïdes du [Het-s] active le domaine HeLo de HET-S et entraîne la mort cellulaire. Afin de mieux caractériser les propriétés du repliement β-solénoïde du prion [Het-s], nous avons entrepris l’exploration in vivo des relations structure-fonction de ce repliement par une approche d’alanine scanning. Au cours de nos recherches pour des homologues de HET-S/s, nous avons identifié un partenaire fonctionnel de HET-S – une protéine appelée NWD2. NWD2 est une protéine STAND et partage une séquence homologue (3-23) au PFD de HET-S/s. Les protéines STAND, après la reconnaissance d’un ligand, forment des plateformes oligomériques pour transduire le signal. Des analyses génomiques in silico réalisées dans plusieurs génomes fongiques nous ont amené à proposer que la transduction du signal via une protéine STAND à repliement amyloïde est un mécanisme ancien et conservé chez les champignons. Dans ce contexte nous avons identifié deux nouveaux motifs PFD putatifs – σ et PP. En soumettant à l’épreuve notre hypothèse, nous avons d’abord démontré que NWD2 interagit avec HET-S/s en fonction d’un ligand spécifique in vivo et l’interaction est dépendante de la séquence NWD2(3-23) homologue au PFD de HET-S/s. Nous avons ensuite exploré le motif PP associé à un domaine HeLo-like (HELL) dans le génome de Chaetomium globosum. En démontrant la nature amyloïde et prion-like du motif PP ainsi que l’analogie fonctionnelle entre ce motif et le PFD de HET-S/s in vivo nous avons apporté des arguments supplémentaires en faveur de l’implication des repliements amyloïdes dans la transduction du signal chez les champignons filamenteux. / Prions are infectious amyloid aggregates. Podospora anserina’s [Het-s] is one of the best characterized fungal prions with a remarkably high prevalence in wild populations. [Het-s] functions in vegetative incompatibility - a biological process occurring during anastomosis between two genetically incompatible strains. When an [Het-s] prion infected strain fuses with a strain expressing the alternative allelic variant of the het-s locus – het-S – a cell death reaction of the heterokaryon occurs. Differing by 13 amino acids both proteins shares two domain architecture; a globular N-terminal domain called HeLo and a C-terminal Prion Forming Domain (PFD). It has been demonstrated that in presence of [Het-s] amyloid fibers HET-S turns into a pore-forming toxin: transconformation of the HET-S PFD by [Het-s] fibers triggers the refolding of the HET-S HeLo domain, inducing the cell death reaction. In an attempt to better characterize the conserved features of the [Het-s] β-solenoid fold we have used a mutational alanine scanning approach and explored in vivo the existing relations between structure and prion functions of [Het-s]. During our quest for new distant homologues of HET-S/s, we have identified a functional partner of HET-S toxin called NWD2. NWD2 is a STAND protein and shares a homology sequence (3-23) in the HET-S/s PFD. STAND proteins form signal transducing hubs through oligomerization upon ligand recognition. Several in silico analysis in various fungal genomes led us to propose that signal transduction via a STAND protein using an amyloid prion-like fold is a general widespread mechanism in fungi. In that context, we have proposed two novel putative PFD motifs called σ and PP. Testing experimentally our hypothesis, we have first demonstrated that NWD2 interacts with HET-S/s upon ligand recognition in vivo and the interaction is dependant of the NWD2(3-23) region. We have then explored the newly identified putative prion domain PP, associated to a Helo-like domain (termed HELL) from the filamentous fungus Chaetomium globosum. By demonstrating the amyloid, prion-like nature of the PP motif and the functional analogy between PP and HET-S/s PFD domain in vivo, we expose further evidences supporting the implication of amyloid folds in signal transduction in filamentous fungi.

Les protéines amyloïdes sont impliquées dans de nombreux processus pathologiques de maladies qui restent souvent incurables. Ces protéines solubles dans leur forme native, s’auto- assemblent pour former des oligomères, des fibrilles, des fibres et enfin des agrégats riches en feuillets β. C’est ce processus délétère qui est le point commun entre ces maladies amyloïdes. La protéine amyloïde la plus décrite est le peptide Aβ suspecté de jouer un rôle primordial dans la maladie d’Alzheimer. Récemment, les petits oligomères du peptide Aβ1-42 formés lors des étapes précoces de ce processus ont été décrit comme étant les plus toxiques.Au cours de cette thèse, nous avons donc développé deux méthodes pour pouvoir évaluer l’activité des composés synthétisés sur les étapes précoces de l’oligomérisation et une pour étudier l’affinité du peptide Aβ1-42 pour son ligand. Nous avons également conçu et synthétisé des peptidomimétiques comme ligands du peptide Aβ1-42 capables ainsi de perturber les interactions protéine-protéine du processus d’agrégation du peptide Aβ1-42. L’évaluation de ces composés ainsi que de différents ligands synthétisés au laboratoire a permis une intéressante étude sur la relation entre la structure des composés évalués et leurs activités sur les étapes cruciales du processus d’oligomérisation du peptide Aβ1-42. Des études de viabilité cellulaire, de RMN et de Docking sont en cours pour améliorer notre compréhension du mode d’action de ces composés et du processus d’oligomérisation du peptide Aβ1-42. / Amyloid proteins are involved in many pathological processes of diseases that are often incurable. These soluble proteins in their native form self-assemble to form oligomers, fibrils, fibers and finally aggregates rich in β-sheets. It is this deleterious process which is the common point between these amyloid diseases. The most described amyloid protein is the Aß peptide suspected of playing a key role in Alzheimer's disease. Recently, small peptide Aβ1-42 oligomers formed during the early stages of this process have appeared to be the most toxic species.In this thesis, we have developed two methods to evaluate the activity of different synthesized compounds on the early steps of oligomerization and one method to study the affinity of Aβ1-42 peptide for its ligand. We have also designed and synthesized peptidomimetics as ligands of Aβ1-42 peptide which are able to disrupt protein-protein interactions involved in the aggregation process of Aβ1-42 peptide. Evaluation of these compounds as well as other ligands synthesized in the laboratory allowed an interesting study on the relationship between the structure of the tested compounds and their activities on the critical steps of the oligomerization process of Aβ1-42 peptide. Cell viability studies, NMR and docking are underway to improve our understanding of the mode of action of these compounds and of the oligomerization process of Aβ1-42 peptide.

La maladie d’Alzheimer (MA) est une maladie multifactorielle et à ce jour aucune cause des formes sporadiques de la maladie, qui représente plus de 99% des cas, n’a été mise en évidence. Des données émergentes de la littérature suggèrent l’existence d’un lien entre les dysfonctionnements thyroïdiens et la MA. Dans ce contexte, l’objectif de cette étude était de préciser l’implication de l’hypothyroïdie dans les processus neuropathologiques de la MA. En utilisant un modèle de rats rendus hypothyroïdiens par un traitement au propylthiouracile (PTU), nous avons montré que l’hypothyroïdie favorise la mise en place de lésions caractéristiques de la MA dans l’hippocampe, structure du cerveau précocement altérée dans la maladie et qui joue un rôle crucial dans les processus de mémoire. Une étude d’IRM in vivo a révélé une diminution progressive du volume cérébral des rats hypothyroïdiens. Dans l’hippocampe, l’hypothyroïdie s’accompagne d’une augmentation de la production de peptides amyloïdes, d’une hyperphosphorylation de la protéine Tau et d’une augmentation de la libération de plusieurs cytokines pro-Inflammatoires. Ces lésions, caractéristiques de la MA, sont associées à des troubles de la mémoire spatiale à court et long terme et à une altération de deux voies de signalisation connues pour jouer un rôle important dans les processus de plasticité synaptique et de mémoire : la voie calcique et la voie ERK-MAPK. Afin d’évaluer le potentiel de restauration de ces lésions, une partie des rats hypothyroïdiens a reçu des injections intra-Péritonéales de triiodothyronine (T3), forme active des hormones thyroïdiennes. Nos résultats montrent que l’administration de T3 permet de restaurer les déficits de mémoire spatiale à court terme, mais pas à long terme. En outre, ce même traitement permet de restaurer les niveaux de cytokines pro-Inflammatoires, de peptides amyloïdes ainsi que les voies « calcique » et « ERK-MAPK ». Ces données renforcent l’existence d’un lien entre l’hypothyroïdie et la MA : elles suggèrent que l’hypothyroïdie pourrait représenter un facteur important pouvant impacter le risque de développer des formes sporadiques de la MA. / Alzheimer’s disease (AD) is a multifactorial disease and to date no single cause for the sporadic forms, which accounts for over 99% of the cases, has been established. Converging evidence suggests a possible link between thyroid dysfunctions and AD. The aim of the present study was to explore the possibility that adult hypothyroidism represents an etiopathogenic mechanism of AD. In this context, using a hypothyroid rat model induced by propylthiouracil (PTU) treatment, we report that hypothyroidism is associated with several AD-Associated hallmarks in the hippocampus, a brain structure affected in early stages of AD and which plays a crucial role in memory processes. In vivo MRI revealed a progressive decrease in cerebral volume of hypothyroid-Rats. In the hippocampus, hypothyroidism resulted in Tau hyperphosphorylation, increased levels of amyloid peptide and of several pro-Inflammatory cytokines. These AD-Related pathological hallmarks were associated with impaired short- and long-Term spatial memory and alteration of hippocampal signalling pathways important for synaptic plasticity and memory, including calcium and ERK-MAPK pathways. To test the potential reversion of PTU-Induced lesions, we injected hypothyroid rats with triiodothyronine (T3), the active form of thyroid hormone. Our results show that intraperitoneal injections of T3 restored spatial short-Term, but not long-Term memory in hypothyroid-Treated rat. Furthermore, levels of pro-Inflammatory cytokines, amyloid peptide and of proteins involved in calcium and ERK-MAPK signalling were restored. These data strengthen the link between hypothyroidism and AD, supporting the idea that hypothyroidism may represent an important factor impacting the risk for developing sporadic forms of AD.

Les biofilms sont des édifices macromoléculaires qui résultent de l'adhérence de microorganismes à une surface. Ils sont constitués de cellules enchâssées dans un réseau d'exopolymères d'origine biologique qui forment une matrice extracellulaire. Les biofilms posent des problèmes technologiques et sanitaires dans de nombreux domaines, aussi bien agroalimentaire, médical, ou industriel. Comprendre les mécanismes de formation de ces structures est donc un enjeu majeur. Malgré une grande diversité de la structure des biofilms, de grands principes semblent en régir la composition. Ainsi, la présence de polysaccharides comme l'alginate et la cellulose joue un rôle majeur dans leur formation et dans la définition de leurs propriétés mécaniques. Si la présence de polymères protéiques comme les fibres amyloïdes semble avoir un caractère universel au sein des biofilms, leur rôle dans la formation de la matrice et dans ses propriétés mécaniques restait à définir. Lors de cette étude, nous avons caractérisé la structure et la composition de trois biofilms monobactériens issus de trois espèces différentes P. aeruginosa NK 125502, S. enterica CIP 58.58 et S. epidermidis CIP 53.124. Nous avons décrit la formation de fibres amyloïdes par différents peptides issus de protéines bactériennes impliquées dans la formation de biofilm et montré par différentes techniques qu'ils sont capables de former des fibres amyloïdes. Nous avons notamment identifié un peptide amyloïde, suggérant la présence de ce type de fibre au sein des biofilms de Staphylococcus, mais aussi plus généralement dans les biofilms des espèces exprimant une protéine de type Bap (Biofilm associated protein). Enfin, nous avons analysé les propriétés mécaniques de différentes matrices synthétiques à base d'alginate et de méthyl-cellulose, en présence et en absence de protéines et de peptides amyloïdes afin de mieux comprendre l'apport qu'a ce type de fibre sur les propriétés de ces structures. Ainsi, les fibres amyloïdes modifient les propriétés mécaniques des gels synthétiques, permettant d'augmenter la déformation sous contrainte. En conclusion, ce travail apporte de nouveaux éléments pour la compréhension du rôle des fibres amyloïdes dans le renforcement de la matrice du biofilm. La capacité à former des fibres amyloïdes par un peptide issu de la protéine Bap de S. epidermidis suggère que cette propriété est plus largement présente au sein de cette famille de protéines. Les travaux menés au cours de cette thèse, et l'ensemble des techniques utilisées, avec notamment la mise au point de l'observation de la biréfringence du rouge Congo par microscopie confocale permettront de développer les études sur cette famille de protéines amyloïdes ainsi que sur les matrices complexes de type biofilm

Ces travaux de recherche s'intéressent à la conception de nouvelles méthodologies analytiques destinées à mesurer le bénéfice d'une transplantation hépatique ou bien encore à l'évaluation de nouvelles voies thérapeutiques à l'essai pour des patients atteints de la polyneuropathie amyloïde familiale à transthyrétine (TTR). Cette maladie rare se caractérise par une déstabilisation structurale du tétramère de TTR qui aboutit à l'agrégation de fibrille dans les tissus du système nerveux autonome, au niveau des nerfs périphériques et autour de certains organes dont le cœur. Dans le cadre d'une collaboration entre hospitalo-universitaires, chimistes analystes, électrochimistes, physico-chimistes et technologues, nous nous sommes attachés à développer des séparations en électrophorèse capillaire couplée avec une détection optique de peptides natif et muté qui sont directement associés à une variente de cette maladie rare. La difficulté première de cette recherche concerne le choix même de ces biomarqueurs qui s'est finalement révélé pertinent grâce de la réalisation de cartes peptidiques à partir du sérum. Ensuite deux voies ont été explorées : une séparation électrocinétique avec une détection spectrométrique d'absorbance dans l'ultra-violet et l'autre nécessitant le marquage préalable de peptides par des molécules fluorophores ou fluorogènes pour ensuite faire une séparation en électrophorèse couplée LIF (laser induced fluorescence). Dans les deux cas le critère principal de séparation, la résolution, autorise une quantification et surtout les validations analytiques associées montrent une réelle robustesse des méthodologies développées. L'autre signe encourageant pour la transposition des ces méthodes à l'analyse de prélèvements issus de patients, concerne la limite de quantification qui est inférieure à celle couramment mesuré dans le sérum. La spectrométrie de masse, moyen d'investigation physico-chimique puissant à permis de suivre et de comprendre d'un point vue plus fondamental le produit des réactions de chimie organique de dérivation des peptides par trois marqueurs fluorescents : le TAMRA-SE, le NDA et le FQ. La possibilité de proposer un outil d'analyse miniaturisé et simple d'utilisation pour le monde hospitalier a également été étudiée. Un poste d'analyse sur puce microfluidique permettant l'analyse quantitative et qualitative a été installé pour permettre la réalisation de premiers essais expérimentaux de séparations électrocinétiques sur puce microfluidique. Ces travaux jettent les bases d'une nouvelle voie analytique pour séparer et quantifier les différents biomarqueurs caractéristiques de la polyneuropathie amyloïde familliale à TTR.

Ce travail de thèse propose de réaliser un nanofil électrique auto-assemblé constitué de protéines. L'unité de base de ce nanofil est une protéine chimère comprenant un domaine capable de former des fibres amyloïdes (Het-s 218-289) et un domaine capable d'effectuer des transferts d'électrons (une rubrédoxine). Le premier domaine permet la réalisation d'une fibre par auto-assemblage tandis que le deuxième est exposé à la surface de cette structure. Les caractéristiques redox du domaine exposé permettent aux électrons de se déplacer d'un bout à l'autre de la fibre par sauts successifs. Un tel nanofil a été créé et caractérisé par différentes techniques biophysiques. Ensuite, la preuve de la conduction des nanofils a été apportée sur des ensembles d'objets, de manière indirecte par électrochimie, et de manière directe par des mesures tension/courant. Ces travaux ouvrent la voie à la réalisation d'objets biocompatibles, biodégradables, possédant des propriétés électroniques exploitables dans des dispositifs technologiques.

La maladie d'Alzheimer (MA) et l'angiopathie amyloïde cérébrale (AAC) sont respectivement caractérisées par des dépôts de peptides amyloïdes β (Aβ) dans le cerveau et la vascularisation cérébrale. Étant donné qu’un régime riche en DHA est associé à une réduction du risque de la MA, l'objectif principal de ma thèse a été d'évaluer l'impact d'un régime enrichi en DHA sur l'inflammation systémique et ses conséquences sur les dépôts Aβ parenchymateux et vasculaires au cours du vieillissement dans un modèle de souris transgéniques de MA/AAC, les Tg2576. Les dépôts amyloïdes ont été détectés en utilisant un anticorps anti-Aβ et les hémorragies avec du bleu prussien sur des coupes cérébrales. A 10, 14 et 18 mois, nous avons démontré une réduction des dépôts vasculaires amyloïdes et des hémorragies en régime DHA par rapport au régime placebo, alors que les dépôts parenchymateux ne sont pas affectés. De plus, nous avons démontré une forte corrélation entre les dépôts amyloïdes vasculaires, les hémorragies et un médiateur pro-inflammatoire lipidique, le 12-HETE. Nous avons ensuite évalué in vitro les effets du peptide Aβ1-40 sur la production de 12-HETE par les cellules musculaires lisses vasculaires. Nous avons démontré que les niveaux d'ARNm de l'enzyme 12-LOX, impliquée dans la synthèse de 12-HETE, était augmenté lorsque les cellules ont été incubées avec du peptide Aβ1-40, suggérant une relation de cause à effet entre les dépôts Aβ et les lipides pro-inflammatoires. Mon travail a de nouveau souligné l'importance de l'inflammation dans la pathogenèse de l'AAC tout en ouvrant une nouvelle voie pour des cibles potentielles dans l'intervention préventive de cette pathologie. / Alzheimer's disease (AD) and cerebral amyloid angiopathy (CAA) are characterized by Amyloid β-peptides depositions in the brain and cerebral vasculature respectively. Because DHA-diet is associated with a reduced risk of AD, the main objective of my thesis was to evaluate the impact of a DHA-diet on cerebrovascular and peripheral inflammation and its consequences on parenchymal and vascular Aβ-deposits during aging in a transgenic mouse model of AD/CAA (Tg2576). The Aβ-peptide deposits were detected using an anti-Aβ peptides and hemorrhages were detected with Prussian Blue on brain sections. At 10, 14 and 18 month-old, we demonstrated a reduction of amyloid vascular deposits and hemorrhages under DHA-diet compared to placebo, while parenchymal Aβ-peptides deposits remain unaffected. Moreover, we demonstrated a strong negative correlation between amyloid vascular deposition, hemorrhage and a lipid-derived pro-inflammatory mediator, 12-HETE. We next evaluated the in vitro effects of Aβ1-40-peptide on 12-HETE production by the Vascular Smooth Muscle Cells. We demonstrated that the mRNA level of the 12-LOX enzyme, involved in 12-HETE synthesis, was increased when cells where incubated with Aβ1-40-peptide, suggesting a cause-to-effect relationship between Aβ deposits and pro-inflammatory biolipids. The work carried out during my thesis made it possible to demonstrate DHA protective effect on evolution and consequences of Aβ peptide cerebrovascular accumulation and link it to plasma 12-HETE level. My work emphasized once again the importance of inflammation in AAC pathogenesis while opening up a new pathway for potential targets in the preventive intervention of this pathology.