L’analyse du mécanisme d’interaction de l’héparane sulfate protéoglycane (HSPG) avec lesprotéines amyloïdes et l’effet de paramètres physiologiques (pH,…) sur ce mécanisme nouspermettent une meilleure compréhension des mécanismes menant à l’amyloïdogenèse.La transthyrétine (TTR), molécule circulant à la fois dans le plasma et dans le liquidecéphalo-rachidien, est une des protéines impliquée dans les amyloses. Elle est responsable desamyloses à la TTR et elle joue un rôle dans la maladie d’Alzheimer en séquestrant la protéinebêta-amyloïde (Aβ). La biochromatographie est un outil très efficace pour analyser lemécanisme entre un ligand et son récepteur dans des conditions modulables et se rapprochantdes conditions biologiques. De plus, les nanotubes de carbones (NTCs) peuvent être utiliséspour détecter ou transporter des molécules qui se lient sur leur surface externe et peuventinteragir avec d’autres composés. Au cours de ce travail, un support particulaire a été utilisé où l’HSPG est immobilisé sur desparticules de silice pré-activées par des résidus amines. Ce support remplissant une colonnechromatographique a permis dans un premier temps d’étudier et de comparer les mécanismesd’association entre l’HSPG et une forme sauvage de la TTR et une forme sénile de la TTRextraite d’un patient décédé des suites d’une amylose sénile à la TTR. Cette étude a montréque pour la TTR sauvage, l’association avec l’HSPG est indépendante du pH et implique desinteractions faibles. Pour la TTR sénile, cette association est dépendante du pH. A pH<6,5, laprotonation d’un résidu histidine est observée. De plus, l’étude des paramètresthermodynamiques et de la compensation enthalpie/ entropie montrent un changement dans lemécanisme de fixation avec l’apparition d’interactions ioniques à pH<6,5. Un pH acide estnécessaire pour dissocier et dénaturer partiellement la TTR. L’affinité de la TTR avec l’HSPGdépend de la structure tétramérique quaternaire de la TTR qui présente alors des résiduscapables de créer des interactions. Dans un deuxième temps, cette colonne a permis d’évaluerl’effet de la TTR et du pH sur la liaison Aβ/HSPG. Comme précédemment, la protonationd’un résidu histidine présent sur la Aβ est observée à pH<6,5. Ce résultat confirme des étudesmenées auparavant sur le précurseur de la protéine Aβ. Les résultats thermodynamiques ontmis en évidence que l’affinité de Aβ avec l’HSPG diminuait avec la concentration croissanteen TTR et l’étude des chromatogrammes associés a montré que la TTR ne séquestrait passeulement Aβ mais la clivait en fragments plus courts qui diminuent son affinité avecl’HSPG. Dans la maladie d’Alzheimer, la TTR exerce une activité protéolytique vis-à-vis deAβ.2. Dans un troisième temps, l’effet de la fonctionnalisation de la TTR par des nanotubes decarbone sur la liaison TTR/HSPG a été étudié. Les résultats obtenus montrent que lesinteractions entre l’HSPG et la TTR-NTC sont de type van der Waals et hydrogène. Lesparamètres thermodynamiques des liaisons TTR/HSPG et TTR-NTC/HSPG sont similairespour des pH>6. A pH<6, il n’existe quasiment pas de différences entre les valeurs obtenues àpH >6 et celles obtenues à pH<6. Les NTCs empêcheraient la formation de liaisons ioniques / The analysis of the heparan sulfate proteoglycan (HSPG) association mechanism withamyloid proteins and the effect of physiological parameters (pH,…) on this mechanism allowa better understanding of the mechanisms leading to amyloidogenesis.Transthyretin (TTR), which circulates in both plasma and cerebrospinal fluid, is one of theproteins involved in amyloidosis. It leads to TTR amyloidosis and plays a role in Alzheimer’sdisease in sequestrating the beta-amyloid (Aβ) protein. Biochromatography is an effectivetool for the analysis of the mechanism involved between a ligand and its receptor inadjustable conditions which could be close to biological conditions. Moreover, carbonnanotubes can be used to detect or to carry molecules which bind on its external surface andcould interact with other molecules. In this work, a particulate support was used where the HSPG was immobilized on the silica particles preactivated by amine residues. This support filling a column was used to study andcompare association mechanisms between HSPG and a wild type TTR form and a senile formof the TTR which was was extracted from a patient who died of cardiac failure with a senilesystemic amyloid. This study showed that the association between wild type TTR and HSPGwas independent of the pH and involved weak interactions.For the senile TTR, this association was dependent on pH. At pH<6,5, a histidine residue wasprotonated. Moreover, the study of both thermodynamical parameters and enthalpy-entropycompensation showed a change in the association mechanism with involvement of more ionicinteractions at pH<6,5. An acidic pH was necessary to dissociate and partially denaturate theTTR. The affinity of the TTR with HSPG depends on the tetrameric quaternary structure ofthe TTR which presents some residues which are able to create interactions.In a second time, this column was used to evaluate the effect of both the TTR and the pH onAβ/HSPG binding. As previously, the protonation of a histidine residue present on Aβ wasobserved at pH<6,5. This result confirmed studies on the Aβ precursor. Thermodynamicalvalues highlighted that the affinity of Aβ for l’HSPG decreased with the increase of TTRconcentration, and the study of the chromatograms associated showed that TTR sequestratedAβ and cut Aβ in smaller fragments which decreased its affinity for HSPG. In Alzheimer’sdisease, TTR has a proteolytic activity on Aβ.In a third time, the effect of the carbon nanotubes (CNTs), immobilized on TTR, on theTTR/HSPG binding was studied. Results showed that interactions between TTR-NTC andHSPG are van der Waals and hydrogen. Thermodynamical data of TTR/HSPG et TTRNTC/HSPG bindings are similar at pH>6. At pH<6, no differences between values obtainedat all pH values for TTR-NTC. NTCs would avoid ionic interactions formations.

Une protéine prion peut adopter deux conformations distinctes, l’une cellulaire et l’autre prion. La conformation prion est le résultat de son agrégation en fibre amyloïde. Cette fibre est le support de l’information prion à partir duquel les isoformes cellulaires sont convertis en forme prion de façon autocatalytique. La transmission de l’information prion repose donc sur la transmission de cette fibre au cours des divisions cellulaires, qui est réalisée par de petits polymères. Ceux-ci sont le résultat d’un équilibre entre la fragmentation et la polymérisation de la fibre. Une perturbation de cet équilibre provoque une agrégation massive de la protéine prion, menant à la perte de l’information prion.L’objectif de ma thèse était de comprendre ce qui définit in vivo la transmission du prion. Mon modèle d’étude est la protéine Ure2p propageant le prion [URE3] dans la levure S. cerevisiae. J’ai montré que la concentration cellulaire d’Ure2p détermine la vitesse d’agrégation de la protéine prion et donc son efficacité de transmission. En effet, de trop fortes concentrations cellulaires sont incompatibles avec la propagation du prion. La concentration cellulaire d’Ure2p définit également la diversité des souches prions. Un crible génétique m’a permit de mettre en évidence que la présence de séquences centromériques surnuméraires dans la cellule interfère avec la transmission du prion [URE3]. Le même phénomène est observé avec une augmentation du niveau de ploïdie de la cellule. Dans les deux cas, la surexpression du chaperon Hsp104 restaure une propagation normale du prion. / A prion protein can adopt two distinct conformations, one cellular and one prion. Prion conformation is the result of its aggregation into amyloid fibers. This fiber is the support of the prion information from which the cellular isoforms are converted into prion form by autocatalytic manner. The prion information transmission is therefore based on the transmission of this fiber during cell division, which is done by small polymers. These are the result of a balance between fragmentation and polymerization of the fiber. A disturbance of this balance causes a massive aggregation of the prion protein, leading to the prion information loss.The objective of my thesis was to understand what defined in vivo the prion transmission. My studying model was the Ure2p protein propagating the [URE3] prion in S. cerevisiae yeast. I showed that the Ure2p cellular concentration determined the aggregation speed of the prion protein and thus its transmission efficiency. Indeed, too high cellular concentrations are incompatible with the prion propagation. The cellular concentration of Ure2p also defines the prion strains diversity. A genetic screen allowed me to highlight that the presence of centrometric supernumerary sequences in the cell interferes with the [URE3] prion transmission. The same phenomenon is observed with an increase in the cell ploidy. In both cases, overexpression of the Hsp104 chaperone restores normal prion propagation.

La maladie d’Alzheimer (MA) est un trouble neurodégénératif qui se manifeste, entre autres, par une détérioration progressive de la mémoire. Le peptide amyloïde (Aβ), composant principal des plaques séniles retrouvées dans le cerveau des patients, a longtemps été considéré comme le principal responsable de ce dysfonctionnement mnésique. Néanmoins, les mécanismes moléculaires à l’origine du déclin de la mémoire restent à ce jour inconnus. Le peptide Aβ est produit par la protéolyse d’une protéine transmembranaire appelée Protéine Précurseur Amyloïde (APP). Il a été proposé qu’en plus de l’effet néfaste de l'accumulation d’Aβ, une perte de fonction d’APP puisse jouer un rôle dans le dysfonctionnement cognitif associé à la MA, en particulier au début de la maladie. La drosophile possède un orthologue d’APP, APP-like (APPL), soumis à deux voies de maturation similaires à celles d’APP. Le laboratoire a mis en évidence l’implication d’APPL chez la mouche adulte dans la mémoire olfactive associative (Goguel et al., 2011). Au cours de ma thèse, nous avons poursuivi deux objectifs : 1) identifier le ou les métabolites d’APPL impliqués dans la mise en place de la mémoire, et 2) analyser l’incidence de la surexpression de la voie amyloïdogénique chez le jeune adulte. Nous avons mis à jour deux types d’interaction fonctionnelle entre APPL et ses métabolites : une interaction positive entre les formes sécrétées et membranaires, qui pourrait sous-tendre la mise en place de la mémoire dans des conditions physiologiques, et une interaction négative entre APPL et dAβ, qui pourrait au contraire participer à l’aggravation des déficits mnésiques observés au cours de l’évolution de la MA. / Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disorder characterized by a progressive deterioration of memory. The amyloid peptide (Aβ), the principal component of senile plaques found in patients’ brains, has been considered as the main cause of memory dysfunction. However, the exact molecular mechanisms that underlie memory decline remain unknown. Aβ is produced by the proteolysis of a transmembrane protein named Amyloid Precursor Protein (APP). It has been suggested that in addition to the accumulation of Aβ, APP loss of function may play a crucial role in the cognitive dysfunction associated with AD, especially at the onset of the disease. Drosophila contains a single APP ortholog APP-like (APPL), that undergoes processing pathways similar to that of APP. We have previously highlighted in young flies the involvement of APPL in associative olfactory memory (Goguel et al., 2011). During my thesis, we sought firstly to identify which form of APPL, among its numerous metabolites, is critical for memory, and secondly, to analyze the effect of promoting the amyloidogenic pathway in the young adult brain. Our results suggest several types of functional interactions between APPL and its metabolites: a positive interaction between the full length membrane and the secreted form - which would underlie implementation of memory under physiological conditions - and a negative interaction between APPL and dAβ - which would rather participate to the progression of the memory decline observed during AD.

L'angiopathie amyloïde cérébrale (AAC) est caractérisée par des dépôts amyloïdes au sein des parois cérébrovasculaires, associés à des altérations vasculaires et des troubles cognitifs. L'inflammation étant un processus délétère au cours de l'AAC, je me suis intéressée à l'effet inflammatoire sur les cellules musculaires lisses (CML) vasculaires du peptide amyloïde principalement accumulé au sein des parois artérielles, le peptide A 1-40. Cette étude met en évidence que le peptide A 1-40 n'induit pas directement de réponse inflammatoire de la part des CML, mais les sensibilise aux stimuli pro-inflammatoires. Aussi, cette sensibilisation cellulaire résulte d'une pré-activation des voies PI3K/Akt et NF- B, insuffisante à elle-seule pour induire une réponse inflammatoire. Dans une seconde partie de ma thèse, je me suis intéressée aux mécanismes moléculaires impliqués dans la migration des CML au cours de la re-sténose post-angioplastie. Lorsque l'athérosclérose conduit à une sténose artérielle, l'angioplastie est l'opération chirurgicale rétablissant le flux sanguin. Cependant, dans les 6 mois postopératoires, 10 à 20% des patients présentent une re-sténose post-angioplastie. Un des principaux facteurs impliqué dans ce processus est la migration des CML de la paroi vers la lumière artérielle. Dans ce contexte, j'ai pu démontrer que la re-sténose post-angioplastie chez le rat est dépendante du niveau d'expression de l'adénylyl cyclase 8 (AC8). Dans cette étude, nous avons également montré que l'expression de l'AC8 induit la migration des CML et l'activation de la métalloprotéinase matricielle-2, en stimulant les voies Epac2/Rap1 et PI3K/Akt. / Cerebral amyloid angiopathy (CAA) is defined by amyloid deposits within cerebral vasculature associated with vascular damages and cognitive impairment. As inflammation is a deleterious event during CAA, I explored the inflammatory effect in vascular smooth muscle cells (VSMC) of the amyloid peptide which is mainly accumulated in arterial wall, the peptide A1-40. This study evidenced that A1-40 does not directly induce inflammatory response of VSMC but sensitizes these cells to pro-inflammatory stimuli. Furthermore, this sensitization results from a pre-activation of PI3K/Akt and NF-B pathways, insufficient alone to induce inflammatory response.In the second part of my thesis, I studied the molecular mechanisms involved in VSMC migration occurring in post-angioplasty restenosis. When atherosclerosis leads to arterial stenosis, angioplasty is the surgery practiced to restore blood flow. However, during the 6 month post-surgery, 10 to 20% of patients display post-angioplasty restenosis. One of the main components of this event is the migration of VSMC from the wall to arterial lumen. In this context, I demonstrated that the severity of rat post-angioplasty restenosis is dependent to the level of adenylyl cyclase 8 (AC8) expression. In this study, we have also shown that AC8 expression promotes VSMC migration and matrix metalloproteinase-2 activation through Epac2/Rap1 and PI3K/Akt pathways.

L'étiologie de la forme sporadique de la maladie d'Alzheimer (AD) reste largement inconnue. Toutefois, une adéquation entre des facteurs environnementaux et génétiques est fortement probable. C'est ainsi que de nombreux arguments suggèrent que le virus herpes simplex de type 1 (HSV1) en infectant et en se répliquant dans le système nerveux central, puisse être un co-facteur impliqué dans le déclenchement et le développement de l'AD. Pour éprouver cette hypothèse, nous avons développé un modèle cellulaire constitué de neurones de rat infectés par HSV1 pour analyser les modifications viro-induites de leur expression génique. Il a été mis en évidence dans les neurones infectés : i) une augmentation de la production du peptide amyloïde Aβ42 et de Tau phosphorylée, ainsi que leur agrégation dans un agrésome intracellulaire ; ii) des variations du niveau de transcription de nombreux gènes très similaires à celles observées chez des patients AD. Par ailleurs, l'étude des mécanismes moléculaires de l'apoptose viro-induite dans ce modèle original a permis de mettre en évidence une corrélation entre l'activation des caspases et la production d'Aβ42 et une corrélation entre le phénomène d'apoptose avortée (abortosis) et la formation d'agrésome. De l'ensemble des ces résultats, il apparait que ce modèle cellulaire est représentatif de certains aspects des stades précoces de l'AD et conforte l'hypothèse qu'HSV1 serait un co-facteur dans la maladie d'Alzheimer / The origin of the sporadic form of the Alzheimer's disease (AD) remains still widely unknown. However, an adequacy between environmental and genetic factors is highly probable. Numerous arguments suggest that the virus herpes simplex of type 1 (HSV1) by infecting and replicating in the central nervous system, could be a co-factor involved in the AD process. To evaluate this hypothesis, we set up a model made of rat neurons infected by HSV1 in order to analyse the virally-induced modifications of their gene expression. Using this model we have shown: i) an over-production of the amyloid peptide Aß42 and of phosphorylated form of Tau accompanied by their concentration within an intracellular aggresome; ii) variations of the transcription levels of numerous genes equivalent to that observed in AD patients. Furthermore, the study of the molecular mechanisms underlying the virally-induced apoptosis allowed to point out a correlation between caspase activation and Aß42 production as well as a correlation between abortosis and aggresome formation. All together these results demonstrate that this cellular model represents, at least in part, some aspects of the early stages of AD and bring evidences that HSV1 could be a co-factor in the AD process

La complémentarité des outils de neuroimagerie et de neuropsychologie permettent de mieux comprendre les liens complexes entre le syndrome clinique et les lésions pathologiques de la maladie d’Alzheimer (MA). Les objectifs de cette thèse étaient de mieux caractériser la nature des déficits mnésiques au stade prodromal de la MA et leurs liens avec les biomarqueurs d’imagerie. Dans un premier temps, nous avons étudié l’atteinte des souvenirs récents versus anciens en mémoire autobiographique au stade prodromal et ses corrélats cognitifs, cérébraux structuraux et fonctionnels. Nos résultats suggèrent une atteinte plus précoce des souvenirs récents et de ses substrats cérébraux et cognitifs. Nous nous sommes ensuite intéressés aux différences quantitatives et qualitatives entre les patients amyloïdes positifs et négatifs au niveau cognitif (avec un focus sur la mémoire épisodique) et cérébraux structuraux et fonctionnels. Nos travaux montrent que la présence d’amyloïde chez les patients au stade prodromal se répercute par des profils particuliers au niveau cognitif et plus particulièrement en mémoire épisodique (score global, autobiographique et effet de primauté) ce que la neuroimagerie ne parvient pas à mettre en évidence. Dans une dernière étude, nous avons évalué les modifications lors du vieillissement normal et pathologique (MA) de la concentration plasmatique de tissue plasminogen activator (tPA), une molécule impliquée dans les processus de mémoire, neurodégénérescence, inflammation et dans l’élimination des dépôts amyloïde. Nous avons ainsi pu montrer que la concentration plasmatique de tPA augmentait avec l’âge alors qu’elle n’est pas affectée par la pathologie. Une augmentation du niveau de tPA aurait un effet négatif sur le cerveau. En conclusion, une évaluation neuropsychologique détaillée particulièrement en mémoire épisodique pourrait refléter la présence de la pathologie amyloïde au stade prodromal de la MA et ceci de façon plus efficace que les biomarqueurs d’imagerie classiques. / The complementarity of neuroimaging and neuropsychological tools allows to better understand the complex links between the clinical syndrome and the neuropathological lesions of Alzheimer’s disease (AD). The objectives of this thesis were to better characterize the nature of memory deficits at the prodromal stage of AD and their links with imaging biomarkers. First, we studied the alterations and the cognitive and brain substrates of recent versus remote autobiographical memories in prodromal AD. Our results reveal that there is an earlier alteration of recent memories and of their cognitive and brain substrates. Secondly, we were interested in quantitative and qualitative differences between amyloid positive and negative patients on cognitive (focusing on episodic memory) and brain structural and functional measures. We demonstrated that the presence of amyloid in the brain of patients at the prodromal stage is associated with a specific cognitive profile including greater episodic memory deficits (global score, autobiographical memory, and primacy effect), more than to a specific profile of brain alteration. Then, we evaluated the changes in normal and pathological aging (AD) in the plasma concentration of tissue plasminogen activator (tPA; a molecule implicated in memory neurodegeneration, inflammation and amyloid degradation processes) and their impact on brain integrity. We showned that tPA plasma concentration was increased with age, with a negative effect on brain structure, while it was not affected by AD. Overall, this thesis highlights that a detailed neuropsychological evaluation particularly in episodic memory could reflect specific AD-related brain alterations in the prodromal stage, more efficiently than classical imaging biomarkers.

La maladie d’Alzheimer (MA) est une neurodégénérescence liée à l’âge, caractérisée par l’agrégation intracérébrale du peptide Aβ. Plusieurs études ont montré que la signalisation insulin-like growth factor (IGF), régulateur clé de la longévité, est impliquée dans la progression de la MA. Nous avons récemment démontré que la suppression de la signalisation IGF neuronale à l’âge adulte chez un modèle de souris MA freine la progression de la pathologie amyloïde par une clairance de l’Aβ facilitée. L’objectif de ma thèse est d’identifier les mécanismes cellulaires et moléculaires liant signalisation IGF et neuroprotection contre la protéotoxicité Aβ. J’ai démontré que l’ablation de l’IGF-1R neuronal au cours du vieillissement protège des déficits cognitifs et de la neuroinflammation liée aux oligomères Aβ, et réduit substantiellement la taille du soma neuronal adulte. Pour identifier les voies impliquées dans cette neuroprotection, j’ai caractérisé le profil transcriptomique de neurones KO IGF-1R microdisséqués dans la région CA1 de l’hippocampe. J’ai démontré que la MA et l’ablation de l’IGF-1R neuronal impactent les mêmes fonctions biologiques, comme la neurotransmission, la croissance, et la transduction du signal, et presque tous les changements d’expression géniques communs à la MA et au KO IGF-1R neuronal se produisent dans le même sens. En revanche, dans les cerveaux MA, une proportion significative des gènes dérégulés par la MA sont inversés par le KO IGF-1R neuronal. Mes résultats révèlent que l’inhibition de la voie IGF neuronale à l’âge adulte protège de la pathologie Aβ en régulant l’organisation du cytosquelette, la neurotransmission, et la réponse au stress. / Alzheimer's disease (AD) is an age-related neurodegenerative disease, characterized by intracerebral amyloid-β (Aβ) peptide aggregation. Several studies have shown that insulin-like growth factor (IGF) signaling, a key regulator of longevity, is involved in AD progression. We recently showed that suppression of neuronal IGF signaling during adulthood alleviates amyloid pathology and cognitive deficits in AD mice through A clearance. In this context, the aim of my thesis was to identify the cellular and molecular mechanisms linking IGF signaling to neuronal protection against Aβ proteotoxicity. I demonstrated that ablation of neuronal IGF-1R during aging reduces cognitive deficits and neuroinflammation linked to A oligomers (AO), and induces a conspicuous decrease in neuronal soma size. To identify which pathways are involved in previously observed neuroprotection, I characterized the transcriptome profiling of microdissected hippocampal CA1 neurons from mice where neuronal IGF-1R was conditionally ablated at 3 months of age. I found that AD and neuronal IGF-1R inactivation impact on similar neuronal functions, namely neurotransmission, growth and differentiation, and signal transduction, and almost all of the changes in gene expression common to AD and IGF-1R ablation occurred in the same direction. However, in AD brains, a significant proportion of genes deregulated by AD were reversed by IGF-1R knockout. My results also reveal that inhibition of IGF signaling in adult neurons protects from A pathology by regulating cytoskeleton organization, neurotransmission, and response to stress.

La maladie d'Alzheimer est la démence la plus répandue dans le monde. Le nombre de cas augmente de manière exponentielle et il est donc important de comprendre les mécanismes moléculaires donnant lieu à cette terrible maladie. Une des hypothèses les plus supportées est celle suggérant que la production et dégradation déséquilibrées de l'amyloïde-beta (Aß), un peptide de 42 acides aminés trouvé dans tous les individus sains, est un événement clé dans le déroulement de la maladie d'Alzheimer. En effet, une production accrue ou une dégradation faible du peptide ont pour conséquence son agrégation et accumulation dans des plaques de fibres entre les neurones des régions spécifiques du cerveau. C'est pourquoi la modulation de l'agrégation du peptide Aß est une des approches envisageables pour modifier l'évolution de la maladie d'Alzheimer. Les protéines chaperons dont une des fonctions est d'assister d'autres protéines dans leur repliement, sont parmi les molécules les plus étudiées pour leur capacité modulatrice de l'agrégation des protéines (inclus le peptide Aß). Plusieurs chaperons ont montré la capacité d'inhiber la formation des fibres par l'Aß. Cependant, du fait que les chaperons sont des molécules conservées et peu spécifiques, leur surexpression ou administration directe peut avoir des conséquences négatives si les chaperons interagissent avec des protéines autres que la protéine cible. Dans ce travail, nous nous sommes intéressés à une protéine chaperon bactérienne possédant une forte activité " holdase " (i.e., elle empêche le repliement précoce des protéines) comme possible modulateur de l'agrégation du peptide Aß. Le chaperon sauvage a une très faible capacité d'inhibition de la formation de fibres par le peptide Aß. Cependant, nous avons démontré qu'en modifiant légèrement la surface de liaison du chaperon, la protéine devient un puissant inhibiteur de l'agrégation d'Aß. En parallèle, nous nous sommes intéressés à l'influence des ions métalliques sur l'agrégation du peptide Aß. [...] / Alzheimer's disease is the most frequent type of dementia. With an exponentially growing number of cases, understanding the underlying molecular events leading to this devastating condition is of crucial importance. Much evidence points to a disequilibrium in the production and degradation of amyloid beta (Aß), a normally physiological 42 amino acid peptide, as an early key event in Alzheimer's etiology. Whether Aß is overproduced or poorly degraded, the overall result is an abnormally large pool of peptide that gradually aggregates forming extracellular deposits of fibrils, called amyloid plaques, in specific brain regions. Hence, modulation of Aß aggregation process is one of the suggested approaches to control the evolution of Alzheimer's disease. Universally conserved molecular chaperones have been intensively studied for their capacity to prevent aggregation of disease-related proteins, and many of them have proven to efficiently modulate Alzheimer's Aß aggregation. In a scenario where chaperones are overexpressed or directly administered into the affected tissue, the universal conservation and the relatively poor client-specificity of generic chaperones can become a downside because of the risk of interaction with proteins other than the targeted one is not dismissible, and thus the consequences unpredictable. In the first part of this work, we looked upon a bacterial chaperone call SecB with an unusually robust holdase activity (i.e. it prevents early protein folding) as a promising modulator of Alzheimer's Aß peptide aggregation. [...]

Les chaperonines sont des machines moléculaires impliquées dans la protection des protéines contre le mauvais repliement et l’agrégation. Ces macromolécules de tailleimportante (environ 1 MDa) sont présentes dans tous les domaines du vivant et sontorganisées en deux anneaux concentriques et empilés l’un sur l’autre, possèdent chacun une cavité en leur centre. Les chaperonines sont particulièrement intéressantes car peu caractérisées par rapport aux autres chaperones, notamment dû à leur grande taille et à leur complexité intrinsèque. Leur mécanisme d’action reste donc assez flou.Ce travail de thèse est centré sur l’étude de PhCPN, la chaperonine de Pyrococcushorikoshii, et son interaction avec différentes protéines substrats, grâce à une combinaison d’outils biochimiques et biophysiques tels que la RMN. En effet, la spectroscopie RMN est un outil particulièrement adapté à l’étude des interactions moléculaires transitoires à l’échelle atomique. L’utilisation dans ce cadre du marquage isotopique spécifique des groupements méthyles permet d’étudier des ensembles protéiques de taille importante tels que PhCPN, tandis que la RMN plus classique reste limitée à des poidsmoléculaires inférieurs à 30 kDa. Afin d’étudier le repliement des protéines à l’intérieur des cavités de PhCPN, deux protéines substrats de taille hétérogène et d’activité différentes ont été sélectionnées.En particulier, l’un de ces deux substrats (laMalate Synthase G ou MSG), formedes agrégats amorphes lorsqu’elle elle chauffée tandis que la seconde (l’Amyline) est capable de s’auto associer de manière plus organisée, créant des fibres amyloïdes de haut poids moléculaire. J’ai observé lors de cette étude que PhCPN est capable d’empêcher l’agrégation de ces deux substrats.En effet, la Chaperonine PhCPN est capable de se lier de manière irreversible à laproteine MSG, dépliée par une augmentation de la temperature, dans un ratio stoechiométrique 1/1. Le complexMSG/PhCPN a été isolé et characterisé. En particulier, la surface d’interaction entre PhCPN et cette large protéine substrat a été déterminée grâce à la RMN et la mciroscopie électronique.De plus, l’inhibition de la formation de fibres amyloïdes issues de l’Amyline parla Chaperonine a été étudiée par RMN et fluorescence de la ThT. Il a été notammentmontré que la Chaperonine retarde l’apparition des fibres amyloïdes, quelque soit l’état oligomerique de PhCPN. Le rôle de la Chaperonine sur les méchanismes de nucléation et d’élongation des fibres amyloïdes de l’Amylin a également été étudié. / Chaperonins are molecular machineries involved in the prevention of protein misfolding. These large macromolecules (approximately 1 MDa) are present in all domains of life and globally organized in two stacked rings on top of one another, hosting a cavity in their respective centers. By hydrolyzing ATP within their cavities, these rings can switch between twomajor structural states, an open and a closed conformation, to trap and refold misfolded proteins. Among the different types of molecular chaperones, chaperonins are of particular interest because their mechanism of action is not yet totally understood.This thesis focused on the study of PhCPN, the Chaperonin fromPyrococcus horikoshii,and its interaction with substrate proteins by various biochemical and biophysical techniques including NMR. In fact, NMR spectroscopy is a powerful tool to probe transient interactions in solution, at atomic resolution. Especially, specific isotope labeling of methyl groups is a technique of choice to study huge protein assemblies such as PhCPN chaperonin because they overcome the liquid-state NMR size limitation. To study the protein folding within the cavities of PhCPN, two different model substrate of various sizes and biological functions were selected. Particularly, one of these substrates (Malate Synthase G /MSG) forms amorphous aggregates when submitted to heat while the other (Amylin) is able to self-associate into amyloid fibrils. During this thesis, I have demonstrated that the Chaperonin PhCPN can prevent the aggregation of the chosen substrates.In fact, the PhCPN Chaperonin is able to irreversibly bind thermally unfoldedMSGin a 1/1 ratio. TheMSG/PhCPN complex was isolated and characterized. Especially, theinteraction surface between PhCPN and this large substrate protein was investigated using a combination of NMR and EM.In addition, the inhibition of the Amylin fibrillation by the Chaperonin was investigated using NMR and ThT fluorescence assays. It was shown that the Chaperonin delays the fibrils formation, no matter its oligomeric state. The role of the Chaperonin on the Amylin nucleation and fibril elongation mechanisms was investigated.

La barrière hémato-encéphalique (BHE) est une barrière physique qui sépare le sang du parenchyme cérébral. Dues à ses propriétés, la BHE est très sélective et peu perméable. Les cellules qui la composent sont dotées de différents mécanismes de transport adaptés au besoin du système nerveux central (SNC). Jusqu'à présent, l'état de la BHE dans la pathologie Alzheimer a été peu étudié, mais certains indices supposent qu'elle puisse réguler le transport de molécules pathologiques dont le peptide β-amyloïde (Aβ). Nos premiers résultats concernant l'étude de la perméabilité de la BHE suggèrent une diminution du volume vasculaire cérébrale (VvaSc) chez le modèle de souris triple transgéniques (3xTgAD). Notre seconde étude démontre que les protéines ATP-binding cassettes (ABC) pourraient jouer un rôle dans l'efflux du peptide Aβ lors de la maladie d'Alzheimer (MA). Finalement, notre dernière étude suggère que les anticorps monoclonaux (mAb) pourraient servir de vecteurs à la libération de médicament au niveau cérébral