Les canaux potassiques sensibles à l'ATP (KATP) jouent un rôle primordial dans plusieurs processus cellulaires. La modulation de ces canaux par des molécules activatrices constituerait des applications pharmacologiques et médicinales très intéressantes. À cet effet nous avons conçu et synthétisé de nouvelles molécules hybrides cromakalim-diazoxide et diazoxide-amine/aminoacide. Nous avons également, évalué l'activité myorelaxante de ces composés sur l'aorte de rates. Les résultats obtenus ne montrent pas un effet myorelaxant significatif. Des études sur d'autres tissus, notamment les cellules β pancréatiques et le muscle utérin, sont envisagées afin d'explorer une éventuelle sélectivité tissulaire. Par ailleurs, les interactions protéine-protéine jouent un rôle fondamental dans presque tous les processus cellulaires. Elles sont fortement impliquées dans la formation de la structure dimérique de la protéase du VIH-1 et l'agrégation du peptide β amyloïde impliquée dans la maladie d'Alzheimer. L'inhibition de ces interactions serait donc d'un avantage thérapeutique pour le traitement du SIDA et de la maladie d'Alzheimer. Nous avons conçu et synthétisé d'une part, des pinces moléculaires à base de motifs carbonylhydrazides et oligohydrazides (Azatide), et d'autre part, des molécules pentapeptidiques avec un peudoaminoacide central alcoolfluoré. Enfin, nous avons testé la capacité des pinces moléculaires à perturber le feuillet β terminal de la PR du VIH-1 afin d'inhiber sa dimérisation et donc son activité. Nous avons réalisé de même une étude de relation structure-activité et d'après l'ensemble des résultats obtenus, il semblerait que la flexibilité est délétère pour l'activité inhibitrice. Nous avons également évalué la capacité des nouvelles molécules peptidomimétiques alcool fluorées à accélérer ou inhiber l'agrégation du peptide Aβ1-42 dans le but de diminuer la présence de petits oligomères neurotoxiques. Les résultats obtenus sont très prometteurs, nous avons réussi à développer d'une part un pentapeptide capable d'inhiber totalement l'agrégation de Aβ1-42, et d'autre part des pseudopentapeptides capables d'accélérer son agrégation. Nous avons aussi démontré l'influence de l'atome de fluor sur la structuration d'un pentapeptide. Des études par RMN et DC sont en cours.

L’amyloïdose, une maladie progressive et incurable, implique une vaste panoplie de pathologies et de pathogénèses, qui est expliquée par la grande variabilité biologique et structurale des protéines responsables de la formation des dépôts d’amyloïde. L’amyline (polypeptide amyloïde des îlots pancréatiques, IAPP) est une protéine très susceptible de subir des changements de conformation impliquant les feuillets bêta et conférant aussi des propriétés physicochimiques distinctes. Cette protéine prend alors une forme fibrillaire et se dépose dans les îlots de Langerhans chez les humains atteints de diabète de type 2 ou d’insulinome. Ces dépôts d’amyloïde pancréatique (AIAPP) ont été décrits chez certaines espèces animales telles que les félins domestiques, les grands félins, le raton laveur et les primates non humains. La formation de dépôts d’amyloïde contribue à la pathogénèse du diabète de type 2, mais les mécanismes qui induisent la conversion de l’amyline (IAPP) en amyloïde (AIAPP) ne sont pas complètement compris. Les hypothèses du projet sont que certaines variations présentes dans les séquences peptidiques de l’IAPP provenant de différentes espèces animales jouent un rôle critique pour la formation de fibrilles et que plusieurs composés chimiques aromatiques/phénoliques sont capables d’abroger la formation de dépôts d’amyloïde. Le projet de recherche consiste donc à caractériser la propension des différentes isoformes animales d’IAPP à former de l’amyloïde in vitro afin d’identifier les acides aminés jouant un rôle clé dans cette transformation structurale et ultimement d’inhiber la formation d’amyloïde pancréatique. Le projet se divise en deux volets principaux. Le premier consiste à identifier les différentes séquences peptidiques de l’IAPP retrouvées chez les espèces animales. L’objectif est d’identifier les acides aminés jouant un rôle clé dans la formation d’amyloïde. Le gène de l’IAPP a été séquencé chez plus d’une quarantaine d’espèces. Le potentiel d’agrégation des séquences obtenues a été simulé à l’aide d’outils bioinformatique. Une librairie de 23 peptides a été commandée afin de procéder à des analyses physicochimiques in vitro permettant d’évaluer le potentiel amyloïdogénique (test fluorimétrique à la thioflavine T, essai de liaison au rouge Congo, dichroïsme circulaire, microscopie électronique à transmission) et cytotoxique (sur une lignée cellulaire provenant d’insulinome : INS-1). Les analyses effectuées à partir de la librairie constituée de 23 peptides ont permis d’identifier trois séquences ne formant pas d’amyloïde et qui proviennent des espèces animales suivantes : le tamarin lion doré (Leontopithecus rosalia), le grand dauphin (Tursiops truncatus) et l’alpaga (Vicugna pacos). Un site potentiellement critique est le segment 8-20 présentant le motif NFLVH qui ne forme plus d’amyloïde lorsqu’il est remplacé par le motif DFLGR ou KFLIR. Les acides aminés 29P, 14K et 18R sont également impliqués dans l’inhibition de la transformation structurale en fibrille. La dernière partie du projet consiste à inhiber la formation de l’amyloïde en utilisant des composés chimiques commercialisés (hypoglycémiants, anti-inflammatoires non stéroïdiens) ou nouvellement synthétisés dans notre laboratoire (les aryles éthyles urées). Un criblage d’une soixantaine de composés chimiques a été conduit dans cette étude. Leur efficacité a été testée sur l’IAPP humaine, qui possède un fort potentiel amyloïdogénique. Les techniques utilisées sont les mêmes que celles exploitées précédemment. L’essai de liaison croisée photo-induite ("photo-induced cross-linking of unmodified proteins", PICUP) a été réalisé afin d’étudier les formes intermédiaires (monomères, oligomères). Un total de 11 composés chimiques a démontré un potentiel à inhiber l’agrégation des fibrilles. Pour la classe des hypoglycémiants, le glyburide, le répaglinide et la troglitazone ont montré l’activité thérapeutique la plus élevée pour retarder et réduire la formation de fibrilles. Les anti-inflammatoires antiamyloïdogènes actifs incluaient le diclofenac, le méloxicam, le phénylbutazone, le sulindac et le ténoxicam. Les aryles étyles urées les plus intéressantes étaient la EU-362 et la EU-418. Tous ces composés ont conféré une protection cellulaire contre l’activité cytotoxique des fibrilles. Les molécules actives possèdent des éléments structuraux communs tels des substituants donneurs d’électrons (alcool, amine, halogène) sur un noyau benzène. En conclusion, ce projet de recherche a permis de caractériser l’IAPP chez diverses espèces animales, dont plusieurs chez lesquelles elle n’avait pas encore été décrite, de déterminer les sites jouant un rôle clé dans sa transformation en amyloïde et, ultimement, de tester le potentiel thérapeutique de nouveaux agents antiamyloïdogènes dans le diabète de type 2. Nous espérons que ce projet ouvrira ainsi la porte à de nouvelles stratégies de traitement. / Amyloidosis is a progressive and, as of now, incurable disease caused by the deposition of insoluble proteins. Amyloid research over the past decades focused on the characterization of the substantive biological variability of amyloid deposits. Amyloidosis encompasses a diversity of pathological manifestations, explained by the diversity of underlying causal proteins. In the pancreas of susceptible species, islet amyloid polypeptide (IAPP) is a precursor for an amyloid protein (AIAPP), which has a characteristic fibrillar structure and resistance to physical agents. This folded protein deposits in the islets of Langerhans of patients with type 2 diabetes or islet cell tumors (insulinoma). Amyloid deposits have also been well characterized, anatomically, in feline and non-human primate species. Amyloid fibril formation contributes to the pathogenesis of diabetes mellitus but the precise pathophysiologic factors involved in the fibrillization of IAPP as well as resultant islet injury remain to be elucidated. Further understanding of the causative factors in the fibrillogenesis of IAPP will be requisite in the development of therapeutic strategies to disrupt the amyloidosis process. This project hypothesizes that the specific variations found in IAPP peptide sequences among different animal species are critical for IAPP fibrillization. Also, some aromatic/polyphenolic compounds can abrogate fibrillization. The main objective forms the basis for development of new therapeutic tactics to impede amyloid formation and associated cellular injury. Thus this project has two specific aims. The first specific aim was to identify critical variations in IAPP amino acid sequences from different animal species and to assess their amyloidogenic potential. To accomplish this, the IAPP gene was isolated and sequenced from paraffin-embedded tissues from various animals (40 species). The aggregation potency was assessed for each sequence using in silico analysis. A library of 23 peptides was prepared from sequences that were distinctly different and their amyloidogenic potential was assessed in vitro using physicochemical analysis (thioflavin-T assay, Congo red binding assay, far-UV circular dichroism, transmission electron microscopy) and cytotoxicity assays (insulinoma cell line INS-1). Among this peptide library, three were non-amyloidogenic and corresponded to the following animal species: golden lion tamarin (Leontopithecus rosalia), commun bottlenose dolphin (Tursiops truncates) and alpaca (Vicugna pacos). Segment 8-20 of the peptide was critical for amyloid formation and the substitution of the NFLVH motif found in this region by a DFLGR or KFLIR motif impeded fibrillization. The amino acids 29P, 14K and 18R were also demonstrated to abrogate fibril formation. The second objective consisted in abrogating IAPP fibrillogenesis using conceptualized aromatic/polyphenolic structures, specifically hypoglycemic, non-steroidal anti-inflammatory and aryl ethyl urea agents. This part of the project involved molecular screening of more than 60 compounds. Their efficacy at inhibiting amyloid formation was assessed in vitro on human IAPP, which exhibits the highest amyloidogenic potential. Techniques included the above-mentioned methods, with the addition of photo-induced cross-linking of unmodified proteins (PICUP). A total of 11 compounds showed potential in abrogating IAPP aggregation. Among the hypoglycemic agents evaluated, glyburide, repaglinide and troglitazone showed the highest potency in reducing fibril formation. The NSAIDs that displayed anti-amyloidogenic activity were diclofenac, meloxicam, phenylbutazone, sulindac and tenoxicam. EU-362 and EU-418 were the hit compounds resulting from the screening of the aryl ethyl urea (EU) class. Additionally, these anti-amyloidogenic molecules conferred a protection against fibril cytotoxicity. All of the active molecules bear a commun motif composed of benzene ring with electron donor moieties, such as alcohol, amine or halide. To conclude, this project characterized IAPP in several animal species in which it has not been previously described and improves our understanding of the amyloidogenesis process. Moreover, the therapeutic potential of hypoglycemic, non-steroidal anti-inflammatory and aryl ethyl ureas agents as anti-amyloidogenic compounds was evaluated. It is conceivable that the additional information hereby gained on the regulation of amyloidogenesis may point towards new therapeutic strategies for diabetic patients.

Le vieillissement des populations est corrélé à l’augmentation des pathologies neurodégénératives liées à l’âge, plus particulièrement la maladie d’Alzheimer. La recherche de marqueurs précoces de la maladie ainsi que l’élaboration de nouvelles stratégies thérapeutiques constituent un enjeu de taille. Parmi les mécanismes moléculaires de la formation des plaques amyloïdes actuellement explorés, les formes oligomériques tronquées de peptide amyloïde (Aß), notamment le peptide Aß3(?pE)??42? retrouvé à des stades précoces de la maladie, joueraient un rôle déterminant. Ces travaux de thèse ont permis de montrer, dans un premier temps, que l’injection intracérébrale de ce peptide chez la souris entraîne des altérations de la mémoire de travail et des capacités d’apprentissage, associées à une accumulation d’espèces réactives dérivées de l’oxygène dans des régions cérébrales spécifiques (hippocampe et bulbes olfactifs) de ces animaux. Des essais menés in vitro sur des cultures primaires de neurones de souris montrent leur implication dans les voies apoptotiques impliquant l’activation des caspases et la cascade métabolique de l’acide arachidonique. La seconde étape de ces travaux a constitué en l’étude des effets protecteurs d’un peptide antiapoptotique d’origine endogène, l’humanine (HN) et son variant S14G (HNG). In vitro, un effet protecteur de ces peptides a été mesuré après traitement de neurones en culture par le peptide A[bêta]3?(pE)42.??? Les résultats les plus marquants résident dans les observations faites in vivo : en effet, ces peptides inhibent l’effet délétère de l’injection intracérébroventriculaire du peptide Aß3?(pE??)42?? en restaurant les performances mnésiques des animaux dans les tests comportementaux. A la lumière de ces résultats, les peptides HN pourraient constituer de nouveaux outils thérapeutiques dans le traitement ou la prévention des dommages cellulaires précoces liés à la présence des oligomères solubles du peptide Aß / Aging of population is correlated to the increase of neurodegenerative disease, more particularly Alzheimer disease. Defining early diagnostic markers and new therapeutic strategies are highly relevant. Among the molecular pathways which are currently developed, N-terminal-truncated forms of amyloid-ß (Aß) peptide have been recently suggested to play a pivotal role in the disease. Among them, Aß3(?pE)42 ?peptide is the dominant Aß species in amyloid plaques. We first investigated the effects of soluble oligomeric Aß3(pE) 42 after intracerebroventricular injection on mice learning capacities and the molecular mechanisms of in vitro neurotoxicity. Mice injected with soluble Aß3(pE) 42 displayed impaired spatial working memory and delayed memory acquisition. These cognitive alterations were associated with free radical overproduction in hippocampus and olfactory bulbs. In vitro, Aß3(pE) 42 oligomers induced a redox-sensitive neuronal apoptosis involving caspase activation and an arachidonic acid-dependent pathway. The second goal of this work was to investigate the protective effects of the apoptosis rescue endogenous peptide humanin (HN) and its S14G mutant (HNG). In vitro, we measured their inhibitory effect on neuronal death and apoptotic events resulting from soluble Ab oligomer treatment. What’s of particular interest is the in vivo restoration of soluble Aß3(pE) 42 oligomer-induced mnesic impairment. Thus, HN peptides might serve as new drug candidates for treatment or prevention of early cellular damages linked to soluble A[bêta] oligomers

Résumé confidentiel / Confidential abstract

La maladie d'Alzheimer est la démence neurodégénérative la plus fréquente, en particulier chez les personnes âgées. A l'heure actuelle, aucun traitement ne permet d'arrêter efficacement le développement de la maladie. Le tetrahydro-N,N-dimethyl-2,2-diphenyl-3-furanmethanamine (ANAVEX2-73) est un composé mixte avec une affinité modérée, de l'ordre du µM pour les récepteurs muscariniques et les récepteurs sigma-1. Des données préliminaires ont montré que la molécule avait des propriétés anti-amnésiantes et neuroprotectrices dans un modèle non transgénique de la maladie d'Alzheimer. L'objectif de cette thèse est de poursuivre le développement préclinique de la molécule. Nous avons montré, d'abord dans un modèle non-transgénique de la maladie d'Alzheimer, le modèle d'injection de peptide AB(25-35) oligomérisé chez la souris, que la molécule prévient l'hyperphosphorylation de la protéine Tau ainsi que la production du peptide AB(1-42), deux éléments clés de la physiopathologie de la maladie. Nous avons utilisé ce même modèle pour montrer que l'ANAVEX2-73 prévient les déficits de la fonction mitochondriale, qui sont présents de manière constante et précoce chez les patients. Enfin, nous avons montré qu'un traitement chronique de deux mois avec le composé, dans un modèle de souris transgéniques de la maladie, permet de restaurer les capacités cognitives chez les souris, de diminuer le stress oxydant et d'augmenter les marqueurs synaptiques. Cependant le traitement n'a pas permis de réduire la charge amyloïde dans le cerveau des souris. L'ensemble de ces résultats est encourageant pour le développement futur de la molécule, puisque cette dernière, en plus d'être neuroprotectrice et anti-amnésiante semble être efficace sur les éléments clés de la physiopathologie de la maladie. / Alzheimer's disease is the most common form of dementia in the elderly. There is however no efficient treatment to stop the disease progression. Tetrahydro-N,N-dimethyl-2,2-diphenyl-3-furanmetanamine (ANAVEX2-73) is a mixed compound with moderate affinity for muscarinic and sigma-1 receptors. Preliminary data showed ANAVEX2-73 had anti-amnesic and neuroprotective poperties, in a non-transgenic model of Alzheimer's disease. The aim of this thesis is to improve knowledge about preclinical data of this molecule. We first showed that, in the non-transgenic AB(25-35) mouse model, ANAVEX2-73 prevented Tau protein hyperphosphorylation and AB(1-42) peptide seeding, two key parameters involved in Alzheimer's disease physiopathology. We also used this model tho show that ANAVEX2-73 prevented mitochondrial dysfunction, consistently reported as an early event of the disease in patients. The last part of this thesis showed that a two-month chronic treatment with ANAVEX2-73 in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease reversed cognitive dysfunction and prevented loss of synaptic markers and increased of oxidative stress. However, we could not show a decrease of amyloid load in mouse brain after chronic treatment. Altogether, these results suggest that ANAVEX2-73 treatment could be effective to treat Alzheimer's disease. In addition to its neuroprotective and anti-amnesic property, it also prevents key hallmarks involved in the physiopathology of Alzheimer's disease.

Les dépôts amyloïdes sont des dépôts fibrillaires extracellulaires associés à la maladie d'Alzheimer, dont le constituant principal est le peptide amyloïde (Aβ). La fibrillogenèse d'Aβ s'accompagne d'une transconformation du peptide, depuis une structure secondaire principalement en hélice au voisinage des membranes ou non structurée en milieu aqueux vers une structure en feuillet β. Cette transconformation est couplée à une oligomérisation. Les plaques amyloïdes renferment une quantité importante de cations métalliques, en particulier Zn2+, et le peptide amyloïde y est caractérisé par une grande hétérogénéité de sa partie N-terminale qui présente des troncations et des isomérisations/racémisations. Ces modifications et l'interaction d'Aβ avec les cations ont été proposées comme des facteurs contribuant à la déposition amyloïde.<br />Afin de caractériser ces différents mécanismes moléculaires, nous avons examiné la région N-terminale 1-16 du peptide amyloïde, Aβ(1-16), qui apparaît impliquée dans l'interaction du peptide avec les cations métalliques et renferme plusieurs sites susceptibles de subir des modifications liées au vieillissement protéique. Du fait de son accessibilité au sein des fibrilles amyloïdes, ce domaine d'Aβ constitue une cible thérapeutique potentielle, notamment pour un traitement immunologique.<br />Au cours de ce travail, nous avons mis en évidence la plasticité conformationnelle d'Aβ(1-16) par dichroïsme circulaire (DC) et RMN et nous avons caractérisé la structure qu'adopte ce peptide en milieu aqueux et en milieu mimant un environnement membranaire. Nous avons également identifié les formes produites par vieillissement in vitro. Le complexe Aβ(1-16)/Zn2+ a été examiné par DC, RMN et ESI-MS, ce qui a conduit à établir un modèle d'attachement du cation Zn(II) au peptide Aβ(1-16). Ce modèle implique une coordination tétraédrique de Zn(II), les résidus H6, E11, H13 et H14 étant identifiés comme ligands. Nous avons de plus montré que l'interaction Aβ(1-16)/Zn2+ modifie le profil de vieillissement protéique et exerce un effet agoniste sur la reconnaissance de la région 1-16 d'Aβ par des anticorps spécifiques. La conformation de deux peptides isomères issus du vieillissement d'Aβ(1-16), Aβ(1-16)-L-IsoAsp7 et Aβ(1-16)-D-Asp7 a été examinée par RMN. Un changement conformationnel local est observé dans la région H6-S8 par rapport à Aβ(1-16), mais pas de remaniement conformationnel global. L'étude de l'interaction Aβ(1-16)-L-IsoAsp7/Zn2+ par RMN a suggéré la participation du résidu IsoAsp7 à la coordination du cation Zn(II).<br />Enfin, une étude complémentaire entreprise sur Aβ(1-40) a mis en évidence l'absence de fibrillogenèse du peptide en présence d'ions Zn2+ ou d'anticorps ciblant la région N-terminale d'Aβ, au profit de la formation de différents types d'agrégats. Ces résultats suggèrent que les différentes interactions établies entre la région N-terminale 1-16 d'Aβ et Zn2+ ou des anticorps anti-Aβ inhiberaient la fibrillogenèse du peptide amyloïde pleine longueur.

As the most prevalent cause of dementia worldwide, Alzheimer’s disease (AD) has become a global issue of public health. By current criteria, diagnosis of this neurodegenerative disorder requires both clinical confirmation of dementia and post-mortem detection of the so-called neurofibrillary tangles and senile plaques in the brain. Yet the main proteinaceous component of these plaques, the amyloid beta peptide (Abeta) is now widely believed to initiate a cascade of events that ultimately leads to Alzheimer’s disease. Besides, extensive evidence supports a pathogenic role of soluble oligomers formed upon Abeta aggregation in the onset of the disease, which, unlike Abeta fibrils, present distinct neurotoxic properties and correlate well with disease progression. Their detrimental effects have been suggested to appear decades before the first signs of cognitive impairment, making them biomarkers of choice in the study of the pathology. <p>Given that present guidelines for AD diagnosis are increasingly considered as ill-defined, reliable and early-stage detection methods taking into account the presence of toxic Abeta species are highly awaited by the medical community. In this regard, this thesis work describes the development of a sensing device aiming at the specific detection of the amyloid beta peptide in solution via recognition by antibodies grafted at the surface of functionalized germanium crystals. This new type of BIA-ATR (Biospecific Interaction Analysis - Attenuated Total Reflection) biosensor resorts on ATR-FTIR (Attenuated Total Reflection - Fourier Transform Infrared) spectroscopy, which is extremely sensitive to the secondary structure of proteins. The ATR mode uses germanium as optical transduction element combined to the evanescent wave principle to allow selective online monitoring of peptide-antibody binding events. <p>In the first part of this work, evaluation of the photochemistry on germanium optical elements have been the subject of intense research focus. Our investigations led to the elaboration of a quality control of functionalization efficiency based on infrared spectroscopy. We also set up in the lab an original ELISA method for selecting antibodies in terms of their true affinity for the Abeta peptide. <p>Thereafter binding experiments were carried out on the BIA-ATR sensor using different antibodies and Abeta isoforms, leading to the establishing of a standardized protocol for the detection of molecules of interest. Our results showed that Abeta detected on the biosensor corresponded precisely to antibody-bound peptide, whereas Abeta assemblies, and especially Abeta 1-42 oligomeric conformations, could be discriminated with respect to their spectral signature. This point, which was later confirmed by unsupervised statistical analysis, could be considered as particularly interesting and innovative, since to our knowledge, such conformation-sensitivity has never been observed with existing AD diagnostic methods. Moreover, effective recycling of the functionalized crystals has been demonstrated, which confers thereby a second major advantage to the biosensor. <p>In parallel to these experiments, a structural characterization study of Abeta species was undertaken in order to generate a database of IR spectra, as reference for future comparative analysis of physiological fluids on the biosensor. ATR-FTIR measurements revealed a strong dependency on the ratio between oligomers and fibrils within a mixture and their relative ratio in antiparallel and parallel beta-sheet content. Interestingly, separation trials of oligomeric entities demonstrated a specific effect of Cu2+ ions on Abeta aggregation. Stabilization of small oligomeric aggregates at equimolar Cu2+:Abeta ratios, which had never been clearly evidenced so far, could help to unravel some aspects of the complex role of copper in AD development. <p>These investigations illustrate the applicability of the so-called BIA-ATR methodology to online detection of different forms of the Abeta peptide in solution and the potential of this new sensor technology to fulfill current pitfalls in providing a reliable and comprehensive approach of AD diagnosis. / Doctorat en Sciences agronomiques et ingénierie biologique / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La maladie d’Alzheimer (MA) est un problème majeur de santé publique. Elle se traduit par des atteintes de la mémoire reposant sur des dysfonctionnements synaptiques induits par les oligomères de peptide ß-amyloïde (Aß). Ceux-ci activent la phospholipase A2 cytosolique (cPLA2) qui libère l’acide arachidonique (ARA) des phospholipides (PL) membranaires neuronaux. L’acyl-CoA synthétase 4 (ACSL4) peut limiter cette libération en favorisant la réincorporation d’ARA dans les PL. Dans l’alimentation occidentale, il constitue une part croissante des apports lipidiques. Contrairement à l’acide docosahexaénoïque (DHA), l’influence de l’ARA dans la MA a été peu étudiée. C’est pourquoi nous avons étudié la mobilisation de l’ARA et son effet sur la sensibilité au peptide Aß. Nous avons montré dans un premier temps qu’un apport alimentaire en ARA affecte la mémoire à court terme et sensibilise les capacités d’apprentissage au peptide Aß. Ces altérations sont associées à des diminutions d’expression des récepteurs AMPA et de l’ACSL4, une prolifération astrocytaire et une incorporation accrue en ARA dans les espèces de PL phosphatidylsérine et phosphatidyléthanolamine (PE). D’autre part, la différenciation des cellules HT22 nous a permis de montrer que l’ACSL4 intervient dans l’incorporation de l’ARA et dans l’équilibre ARA/DHA, notamment dans les espèces PE. Cela indique qu’un excès en ARA dans l’alimentation peut constituer un facteur d’aggravation de la MA et que les enzymes assurant sa mobilisation, comme la cPLA2 et l’ACSL4, peuvent moduler ce risque. La caractérisation de leurs niveaux d’expression pourrait permettre de définir des groupes d’individus à risque vis-à-vis de la MA / Alzheimer’s disease (AD) is a major public health problem. This disease is characterized by memory impairments which are caused by synaptic dysfunctions induced by the oligomers of amyloid-ß peptide (Aß). These activate the cytosolic phospholipase A2 (cPLA2) which releases arachidonic acid (ARA) from neuronal membrane phospholipids (PL) whereas acyl-CoA synthetase 4 (ACSL4) potentially counteracts this release by favoring ARA reincorporation into PL. Western diets contain growing amount of ARA. Contrary to docosahexaenoic acid (DHA), a few studies were devoted to the influence of ARA in AD. This is why we decided to study the mobilization of ARA and its effects on the sensitivity to Aß oligomers. First we showed that dietary ARA reduces short-term memory abilities and increases the deleterious effects of Aß on learning abilities. These alterations of cognitive abilities are associated to reductions of expression levels of AMPA receptors and ACSL4, an astrocyte proliferation, and greater incorporation of ARA in PL species phosphatidylethanolamine (PE) and phosphatidylserine. Secondly, we used differentiated HT22 to show that ACSL4 modulate ARA incorporation and ARA / DHA balance in the PE species. These results indicate that excessive dietary intake of ARA may be a worsening factor in AD and the enzymes regulating ARA mobilization, such as cPLA2 and ACSL4, can modulate this risk. The characterization of their enzymatic activities could allow the identification of groups of individuals at AD risk.

La maladie d'Alzheimer (MA) est caractérisée par un déclin progressif des fonctions cognitives avec une détérioration de la mémoire, une atrophie cérébrale et deux lésions histologiques caractéristiques retrouvées lors d'examens post-mortem : les plaques extracellulaires de peptide β-amyloïde et les enchevêtrements intracellulaires de la protéine Tau anormalement phosphorylée. De nombreux modèles animaux de la MA ont été développés afin de comprendre et de tester différents traitements dirigés contre cette pathologie. Cependant, aucun modèle de rongeur non transgénique, développant à la fois les plaques amyloïdes et la pathologie neurofibrillaire, n'est disponible à ce jour. L'objectif de cette étude est de développer le premier modèle non transgénique, développant les deux lésions histologiques caractéristiques de la MA chez le rat. Le principe consiste à réaliser une injection concomitante et intrahippocampale d'un AAV (virus associé aux adénovirus) recombinant contenant le gène humain de la protéine Tau présentant la mutation P301L, et du peptide Aβ1-42 qui est le principal composant des plaques amyloïdes. Après plusieurs expériences, nous avons obtenu un modèle animal représentatif des stades précoces de la MA, c'est-à-dire avec des lésions focalisées dans l'une des premières structures du cerveau affectée par la MA : l'hippocampe. La présence des deux lésions histopathologiques caractéristiques de la maladie, accompagnée d'une astrocytose, a été observée par immunohistofluorescence. Une détérioration de la mémoire concernant plus particulièrement la mémoire de travail, ainsi que des anormalités de l'activité électrique cérébrale et notamment durant les phases de sommeil paradoxal, enregistrées par électroencéphalographie, ont également été mises en évidence. / Alzheimer's disease (AD) is characterized by a progressive decline in cognitive function with a memory impairment, a brain atrophy, and two histological hallmarks observed from post-mortem examination: extracellular β-amyloid plaques and intracellular tangles of the Tau protein abnormally phosphorylated. Numerous animal models of AD have been developed to understand and to test drugs against this pathology. However, any non-transgenic model of rodent developing amyloid plaques and the neurofibrilary pathology is currently available. The aim of this study is to develop the first non-transgenic model producing the two histopathological features of AD in the rat. The principle is to perform a concomitant intrahippocampal injection of a recombinant AAV (Adeno-Associated Virus) containing the human transgene tau with the P301L mutation, and of Aβ1-42 peptide, the main component of the amyloid plaques. After several experiments, we have obtained an animal model representative of the early steps of AD, i.e. with lesions focalized in one of the first affected brain structures in the AD: the hippocampus. The presence of the two histopathological hallmarks has been observed by immunohistofluorescence and associated with an astrogliosis. A memory impairment concerning more particulary the working memory, and abnormalities of the electrical activity of the brain and of the rapid eye movement sleep recorded by electroencephalography, are also characterized.

Les maladies neurodégénératives représentent un défi sociétal majeur. Trouver des outils pour mieux comprendre et diagnostiquer ces maladies est donc nécessaire. La spectroscopie infrarouge (IR) et Raman semblent être de bons candidats puisqu’elles peuvent caractériser l’état physiopathologique d’un échantillon. Le but de cette thèse a été d’appliquer ces méthodes à l’étude de peptides modèles, de tissus cérébraux et de liquides céphalorachidiens (LCR). Dans le cadre de l’étude des tissus cérébraux, la spectroscopie IR et Raman ont été couplées à la microscopie afin de combiner des informations spectrales et spatiales. Cela a permis de mieux comprendre la formation et le rôle des plaques amyloïdes dans la maladie d’Alzheimer (MA). Egalement, cela a permis de montrer l’intérêt d’utiliser ces méthodes dans des études futures pour suivre l’effet de différents traitements contre la sclérose en plaques. Concernant l’étude des LCR, la spectroscopie IR en mode ATR et la spectroscopie Raman exaltée de surface ont été utilisées afin de mettre en évidence des marqueurs spectroscopiques de la MA et de la maladie à corps de Lewy qui pourraient permettre un diagnostic plus précoce de ces maladies et un diagnostic différentiel entre ces deux. / Neurodegenerative diseases represent a major societal challenge. So, it is necessary to develop new tools for a better understanding and diagnosing of these diseases. Infrared (IR) and Raman spectroscopies seem to be good candidates since they can characterize the physiopathological conditions of a biological sample. The purpose of this thesis was to apply these methods to the study of model peptides, brain tissues and cerebrospinal fluids (CSF). As a part of brain tissue analysis, IR and Raman spectroscopy were coupled to microscopy in order to combine spectral and spatial information. This methodology improved our understanding of the formation and the role of amyloid plaques in Alzheimer’s disease (AD). Moreover, it allowed to demonstrate the potential of these approaches in future studies on the effect of various treatments against multiple sclerosis. Concerning the study of CSF, IR-ATR and surface enhanced Raman spectroscopy were applied to identify spectroscopic markers of AD and Lewy body disease that could enable early diagnosis of these diseases and discrimination between them.