La preuve de concept d‟une approche theranostique pour la Maladie de Alzheimer basée sur les nanotechnologies a été explorée. Des nouvelles nanoparticules polymeriques fluorescentes on été conçus, et leur internalisation et aptitude à traverser un nouveau modèle in vitro de barrière hémato-encéphalique humaine on été étudiées en détails. Une petite librairie de nanoparticules polymerique a été préparés, et leur capacité de capturer le peptide β-Amyloïde1-42, considéré comme une des principales causes de la dégénérescence neuronale, a été évaluées et quantifiées en utilisant une méthode expressément conçus. / The proof of concept of an original nanotechnology-based theranostic approach for Alzheimer‟s disease has been explored. Novel fluorescently tagged nanoparticles have been designed and employed for internalization and transcytosis studies across a recently developed human in vitro blood-brain barrier model. A small library of polymeric nanoparticles have been designed and their ability to capture the Amyloid β1-42 peptide, considered one of the causes of the Alzheimer‟s disease, has been investigated and quantified using an on purpose designed method.

Ces travaux de recherche s’intéressent à la conception de nouvelles méthodologies analytiques destinées à mesurer le bénéfice d’une transplantation hépatique ou bien encore à l’évaluation de nouvelles voies thérapeutiques à l’essai pour des patients atteints de la polyneuropathie amyloïde familiale à transthyrétine (TTR). Cette maladie rare se caractérise par une déstabilisation structurale du tétramère de TTR qui aboutit à l’agrégation de fibrille dans les tissus du système nerveux autonome, au niveau des nerfs périphériques et autour de certains organes dont le cœur. Dans le cadre d’une collaboration entre hospitalo-universitaires, chimistes analystes, électrochimistes, physico-chimistes et technologues, nous nous sommes attachés à développer des séparations en électrophorèse capillaire couplée avec une détection optique de peptides natif et muté qui sont directement associés à une variente de cette maladie rare. La difficulté première de cette recherche concerne le choix même de ces biomarqueurs qui s’est finalement révélé pertinent grâce de la réalisation de cartes peptidiques à partir du sérum. Ensuite deux voies ont été explorées : une séparation électrocinétique avec une détection spectrométrique d’absorbance dans l’ultra-violet et l’autre nécessitant le marquage préalable de peptides par des molécules fluorophores ou fluorogènes pour ensuite faire une séparation en électrophorèse couplée LIF (laser induced fluorescence). Dans les deux cas le critère principal de séparation, la résolution, autorise une quantification et surtout les validations analytiques associées montrent une réelle robustesse des méthodologies développées. L’autre signe encourageant pour la transposition des ces méthodes à l’analyse de prélèvements issus de patients, concerne la limite de quantification qui est inférieure à celle couramment mesuré dans le sérum. La spectrométrie de masse, moyen d’investigation physico-chimique puissant à permis de suivre et de comprendre d’un point vue plus fondamental le produit des réactions de chimie organique de dérivation des peptides par trois marqueurs fluorescents : le TAMRA-SE, le NDA et le FQ. La possibilité de proposer un outil d’analyse miniaturisé et simple d’utilisation pour le monde hospitalier a également été étudiée. Un poste d’analyse sur puce microfluidique permettant l’analyse quantitative et qualitative a été installé pour permettre la réalisation de premiers essais expérimentaux de séparations électrocinétiques sur puce microfluidique. Ces travaux jettent les bases d’une nouvelle voie analytique pour séparer et quantifier les différents biomarqueurs caractéristiques de la polyneuropathie amyloïde familliale à TTR. / The purpose of our work was the development of new analytical methodologies to measure the benefit of liver transplantation and also the evaluation of new therapeutic approaches under testing on patients with Transtyretin (TTR) familial amyloid polyneuropathy. This rare disease is characterized by a structural destabilization of TTR tetramer leading to it’s aggregation into amyloïd fibrils that accumulate in the tissues of the autonomous nervous system, peripheral nerves and around certain organs, including the heart. As part of a collaboration between university, hospital, analytical chemists, electrochemist, physical chemists and technologists, we are committed to develop separations in capillary electrophoresis coupled with optical detection of native and mutated peptides that are directly associated with a variant of this rare disease. The first challenge of this research is the choice of these biomarkers that ultimately proved relevant with the realization of peptide maps from the serum. Then two approaches have been explored: electrokinetic separation with absorbance spectrometric detection in the ultraviolet and the other requiring the prior labeling peptides with fluorescent molecules and then to a separation on electrophoresis coupled with LIF (Laser induced fluorescence). In both cases the main criterion of separation, resolution, allows quantification and especially analytical validations show actual strength associated methodologies developed. Another encouraging sign for the transposition of these methods to the analysis of samples from patients regarding the quantification limit is lower than commonly measured in serum. Mass spectrometry, using physico-chemical investigation powerful allowed to follow and understand a more fundamental viewpoint the product of organic chemistry reactions bypass peptides by three fluorescent dyes: TAMRA-SE, the NDA and FQ. The ability to provide a miniaturized analysis and easy to use tool for the hospital environment was also studied. A post analysis on microfluidic chip for quantitative and qualitative analysis was installed to allow the realization of the first experimental tests of electrokinetic separations on microfluidic chip. These studies lay the foundation for a new analytical way to separate and quantify the different characteristics biomarkers family TTR amyloid polyneuropathy.

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Les peptides et protéines amyloïdes sont impliqués dans de nombreuses pathologies regroupées sous le terme d'amyloses. Ces protéines, dans des conditions encore mal connues, se replient en feuillets β croisés et s'assemblent en fibres. Afin de comprendre les principes physico-chimiques impliqués dans ce processus, nous avons conçu des modèles de fibres amyloïdes par la synthèse d'édifices peptidiques basés sur la séquence du peptide β amyloïde. Ils se composent de deux ou quatre fragments amyloïdes mutés, linéaires ou cyclisés, que nous avons liés à un châssis décapeptide cyclique. Ces édifices se replient en feuillets β croisés et s'assemblent en protofilaments de 5 à 6 nm de diamètre. A l'aide de la modélisation moléculaire, nous avons montré que le repliement en boucle de type brin β-boucle-brin β et la création d'un cœur hydrophobe sont nécessaires pour la formation des feuillets β croisés parallèles. Ces édifices sont des modèles très prometteurs pour la compréhension du mécanisme de formation des fibres amyloïdes.<br />Parmi les stratégies thérapeutiques développées récemment pour lutter contre les amyloses, l'inhibition de la formation des dépôts amyloïdes a été largement étudiée. Au cours de nos travaux, nous avons développé des inhibiteurs de la fibrillogénèse par la présentation de plusieurs exemplaires de molécules hydrophobes sur un cyclodécapeptide. Cette stratégie a pour but de créer une zone d'interaction avec le peptide β amyloïde suffisamment importante pour perturber son auto-association. Nous avons montré, par la réalisation d'expériences de polymérisation du peptide Aβ40, que ces composés sont des inhibiteurs très efficaces par comparaison avec les dérivés monomériques. Ces résultats confirment l'intérêt de cette stratégie pour interférer avec le phénomène de formation des fibres amyloïdes.

Les caractéristiques structurales et les interactions intra et/ou intermoléculaires non-covalentes jouent un rôle primordial dans l'activité des molécules d'intérêt biologique, notamment lors de la reconnaissance moléculaire entre un médicament et son récepteur. Par ailleurs, on peut connaître par les études en phase gazeuse (sans les effets du solvant) les propriétés intrinsèques des systèmes moléculaires. Des calculs de chimie quantique élaborés peuvent ainsi être comparés aux résultats des expériences pour en tirer des informations précises. L'équipe AMIBES tente ainsi de décrire les structures de peptides, d'oligonucléotides ou de complexes d'intérêt pharmaceutiques. Pour cela, nous prenons appui sur deux techniques expérimentales complémentaires, la spectroscopie IRMPD et la spectrométrie de mobilité ionique, dont les résultats sont comparés avec des simulations. Dans ce travail de thèse, j'ai d'abord testé les prédictions d'une méthode QM/MM en ce qui concerne le calcul des spectres IR d'espèces d'intérêt biologique isolées. J'ai ensuite utilisé cette méthode pour simuler les spectres IR de brins de la protéine amyloïde β en phase gazeuse. Il ressort de ces études que leur structure secondaire varie selon l'état de protonation et le solvant dans lequel ils sont dissous: un solvant polaire favorise les structures globulaires, alors qu'une constante diélectrique plus basse permet de conserver une structure en hélice α. Je me suis également intéressé aux changements de structure induits par la complexation d'un antibiotique, la vancomycine, avec un modèle de son récepteur. En mode positif, le site de fixation de celui-ci est différent de celui révélé par la cristallographie, mais les interactions spécifiques responsables de la grande constante d'affinité en solution sont conservées dans le complexe déprotoné.

Le vieillissement de nos sociétés provoque une augmentation du nombre de personnes atteintes de maladies neuro-dégénératives telles que la maladie d'Alzheimer (5% des plus de 65 ans et 15% des plus de 85 ans) ou de Parkinson. Les personnes atteintes nécessitent un suivi et une prise en charge importante de la part de leurs proches ou d'organismes spécialisés. Face à ce constat, il apparaît nécessaire de mieux appréhender les mécanismes de développement de ces maladies qui sont encore méconnus, dans le but final de trouver des traitements efficaces. La maladie d'Alzheimer est caractérisée par des pertes neuronales et synaptiques dans des zones précises du cerveau ce qui induirait les troubles de la mémoire et du comportement observés chez les malades. L'une des hypothèses, pour expliquer ces lésions cérébrales, est l'agrégation d'une protéine au niveau neuronal, l'amyloïde-β. Ces agrégats vont conduire à la mort neuronale, probablement par divers mécanismes. L'agrégation de cette protéine forme des plaques séniles en surfaces des neurones, une des caractéristiques de la maladie d'Alzheimer. De nombreuses études, s'appuyant sur des méthodes classiques de la biochimie, ont permis de montrer que de multiples facteurs influaient sur le mécanisme d'agrégation (concentration en amyloïde-beta, pH, présence d'ions métalliques et autre composés, température, propriétés des surfaces). De plus, la cinétique d'agrégation est dynamique, complexe, difficilement contrôlable par les outils classiques de la biologie moléculaire. Dans ce contexte, cette thèse présente une approche originale, basée sur l'utilisation de l'outil microfluidique (manipulation de fluides au sein de systèmes microfabriqués), pour appréhender ce problème. Pour cela, nous avons développé deux types de puces microfluidiques complémentaires. La première a pour but de cribler différentes conditions réactionnelles afin de connaître les facteurs importants et les seuils de concentration critiques. Dans ce but, nous avons réalisé des systèmes permettant de réaliser des gradients de concentration linéaire, grâce auxquels nous avons essentiellement testé l'impact de la concentration en amyloïde-β sur l'agrégation. Ces expériences nous ont permis de montrer l'existence d'un seuil de concentration. La seconde approche est complémentaire de la première, elle a pour but de s'intéresser à la cinétique de réaction. Les puces sont basées sur le principe de réaction-diffusion, cela nous permet de mesurer tout d'abord le coefficient de diffusion du peptide seul (sans agrégation) puis durant l'agrégation. La comparaison des deux situations nous renseigne sur la taille des agrégats. Ces expériences nous ont permis de mesurer le coefficient de diffusion pour différentes molécules (fluorescéine, rhodamine B) et peptides modèles. Concernant l'agrégation, l'adsorption de la protéine sur les parois des canalisations limite encore l'interprétation de nos expériences préliminaires en termes de cinétique. A travers cette thèse, nous avons développé des outils microfluidiques permettant l'étude de l'agrégation de l'amyloïde-β. D'une part, nous avons réalisé un système permettant le criblage de nombreuses conditions réactionnelles qui peut être appliqué au domaine du génie chimique. D'autre part, une configuration de réaction-diffusion vise à remonter à la cinétique d'agrégation. La principale limitation actuelle des systèmes est le contrôle des conditions d'adsorption des protéines sur les parois.

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Contexte : Les hémorragies intracérébrales spontanées (HIC) sont grevées d’une mortalité élevée et d’un pronostic fonctionnel sombre. Les données concernant le pronostic à long terme des HIC sont rares. L’objectif principal de ce travail était d’étudier le pronostic au long cours des HIC en les abordant par le prisme de leur histoire naturelle.Méthodes : Nos populations d’étude sont issues de la cohorte prospective PITCH (Prognosis of IntraCerebral Haemorrhage) qui est une cohorte observationnelle ayant inclus de façon consécutive tous les patients admis au CHU de Lille pour une HIC spontanée entre 2004 et 2009. Nous avons étudié (i) l’incidence de la démence de novo post HIC ainsi que les facteurs prédictifs cliniques et neuroradiologiques associés à sa survenue ; (ii) la prévalence de la sidérose superficielle corticale (SSc) et les facteurs cliniques et radiologiques associés ; (iii) les facteurs prédictifs de récidive hémorragiques.Résultats : Nous avons mis en évidence qu’il existait un risque majeur de démence de novo chez les patients survivant à une HIC. Les facteurs prédictifs de démence identifiés tels que la localisation lobaire ou la SSc suggèrent une implication directe de l’angiopathie amyloïde cérébrale. Nous avons également montré qu’au sein de notre cohorte, un patient sur cinq avait de la SSc sur l’IRM cérébrale réalisée à l’admission. La SSc apparaissait être un facteur neuroradiologique prédictif majeur de récidive hémorragique.Conclusion : Les résultats de ce travail ont un impact important dans la prise en charge des patients ayant eu une HIC spontanée et permettront d’informer de façon adéquate les patients et leurs aidants. Ils apportent des informations nouvelles sur l’évaluation du risque de récidive hémorragique et sur d’éventuelles futures cibles thérapeutiques. / Background: The low frequency of spontaneous intracerebral haemorrhage (ICH) and its high mortality rate may explain the paucity of data in long term outcomes. The main objective was to study long term prognosis of ICH through the prism of their natural history.Methods: Our study populations were based on the PITCH (Prognosis of IntraCerebral Haemorrhage) cohort which is an observational study that included consecutively adults admitted at the Lille University Hospital for spontaneous ICH between 2004 and 2009. We aimed to determine (i) the incidence of new onset dementia and its clinical and radiological predictive factors; (ii) the prevalence of cortical superficial siderosis (cSS) and its associated factors; (iii) predictive factors of recurrent ICH.Results: We showed that the risk of new onset dementia is substantial after spontaneous ICH. Predictive factors of new onset dementia such as ICH lobar location and cSS suggest the implication of underlying cerebral amyloid angiopathy. We found that one out of five patients had cSS on baseline MRI. cSS was a strong predictive factor of recurrent ICH. Conclusion: These findings are of immediate clinical relevance in the management of ICH patients and will allow to adequately inform patients and caregivers. These results may provide additional information on ICH recurrence risk assessment and may contribute to the development of future therapeutic strategies.

La maladie d’Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative du système nerveux central qui se caractérise notamment par l’accumulation de peptide beta-amyloïde (Aβ) dans le tissus nerveux. Dans la première partie de cette thèse nous avons montré que l’interaction des oligomères Aβ1-42 de haut poids moléculaire avec la membrane plasmique des cellules PC12 différenciées ou des cellules nerveuses (neurones et astrocytes primaires) provoque des variations de la [Ca2+]i dépendant de l’activation des récepteurs NMDA. Dans la seconde partie nous avons montré qu’une pré-exposition des cellules PC12 et des cellules nerveuses à de faibles concentrations de peptide Aβ module l’interaction ultérieure des oligomères avec la membrane plasmique. Enfin dans le cadre d’une collaboration avec l’entreprise Innovative Health Diagnostics (IHD) nous avons participé à la caractérisation d’une sonde amyloïde fluorescente développée pour réaliser des tests de détection de la MA à partir d’échantillons sanguins. / Alzheimer’s disease (AD) is a neurodegenerative disease of the central nervous system which is characterized in particular by the accumulation of beta amyloïde peptide (Aβ) in nerve tissues. In the first part of this thesis we showed that the interaction of high molecular weight Aβ1-42 oligomers with the plasma membrane of differenciated PC12 or nerve cells (neurons and astrocytes) triggers variations of their depending on the activation of the NMDA receptors. In the second part we showed that a pre-exposure of PC12 and nerve cells with low concentrations Aβ1-42 of modulates the later interaction of oligomers with the plasma membrane. Finally in collaboration with the company Innovative Health Diagnostics (IHD) we participated in the characterization of a fluorescent amyloid probe developed to realize detection test of AD from blood samples.

La maladie d’Alzheimer (MA) est un désordre neuro-dégénératif chronique fatal et la forme la plus répandue des démences chez l’adulte qui touchent plus de 28 millions de personnes dans le monde. En absence de traitement pour les démences neurodégénérative dont la maladie d’Alzheimer, le coût de celles-ci est estimé à 1 trillion d’USD en 2018 ce qui représente des enjeux économiques et sociétaux majeurs au niveau national et mondial. La MA est une forme d’amylose qui est caractérisée par l’agrégation du peptide amyloïde beta (Aβ) dans le cerveau des patients. Le facteur de risque génétique principal de la forme tardive (après 65 ans) de cette maladie est l’isoforme E4 de l’apolipoprotéine E (apoE) qui intervient dans le transport et le métabolisme des lipides et interagit avec le peptide Aβ. La modulation de la structure des isoformes d’apoE et de leur interaction avec l’Aβ apparaît comme une cible prometteuse dans la conception rationnelle de thérapies de la maladie. Celle-ci nécessite néanmoins une compréhension approfondie des propriétés structurales et dynamiques des deux partenaires moléculaires. Dans le cadre de cette thèse, nous avons étudié la structure de trois isoformes (E2, E3 et E4) de l’apoE par différentes techniques de biologie structurale et principalement par la réticulation chimique couplée à la spectrométrie de masse (CXMS) quantitative et par la bioinformatique structurale. Ces données complémentées par la spectroscopie infrarouge ont permis de construire des modèles structuraux de l’apoE2, E3 et E4. Nous avons mis en évidence l’interaction des domaines N- et C-terminal et la présence de multiples conformations de l’apoE chez les trois isoformes. Nos données suggèrent un équilibre entre deux principales conformations de l’apoE dont la population relative diffère entre les trois isoformes. Nous proposons les interfaces à cibler dans le cadre de thérapie visant à moduler les propriétés structurales des isoformes de l’apoE.Nous avons également mis en évidence que chaque isoforme d’apoE (E2, E3 et E4) interfère avec l’agrégation d’Aβ. Le peptide interagit avec les deux domaines N- et C- terminal de l’apoE. L’étude quantitative de l’interaction par CXMS a révélé des différences entre les cross-links formés en présence des isoformes. La modélisation du complexe apoE-Aβ a permis de mettre en évidence les interfaces impliquées dans l’interaction. Celle-ci possède une composante hydrophobe et électrostatique qui diffère chez les isoformes d’apoE. Nous proposons un mécanisme de l’interaction apoE-Aβ qui est initié par les propriétés hydrophobes des deux partenaires et qui est stabilisé par la suite via des contacts électrostatiques. Par ailleurs, une étude permettant d’explorer le potentiel de la nouvelle chimie de réticulation des résidues acides de protéine dans des applications en protéomique structurale a été effectuée. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished