Ce travail de thèse propose de réaliser un nanofil électrique auto-assemblé constitué de protéines. L'unité de base de ce nanofil est une protéine chimère comprenant un domaine capable de former des fibres amyloïdes (Het-s 218-289) et un domaine capable d'effectuer des transferts d'électrons (une rubrédoxine). Le premier domaine permet la réalisation d'une fibre par auto-assemblage tandis que le deuxième est exposé à la surface de cette structure. Les caractéristiques redox du domaine exposé permettent aux électrons de se déplacer d'un bout à l'autre de la fibre par sauts successifs. Un tel nanofil a été créé et caractérisé par différentes techniques biophysiques. Ensuite, la preuve de la conduction des nanofils a été apportée sur des ensembles d'objets, de manière indirecte par électrochimie, et de manière directe par des mesures tension/courant. Ces travaux ouvrent la voie à la réalisation d'objets biocompatibles, biodégradables, possédant des propriétés électroniques exploitables dans des dispositifs technologiques. / The research described in this thesis aims at creating a self-assembled nanowire only made of proteins. The building block of this wire is a chimeric protein that comprises an amyloid fibril forming domain (Het-s 218-289) and an electron transfer domain (rubredoxin). The first one self-assembles in amyloid fibrils which display the second at their surface. Redox characteristics of the exposed domain allow electrons to move from one extremity of the fibril to the other by successive jumps. Such a nanowire has been created and characterized by various biophysical experiments. Then, the conductivity of the nanowires has been demonstrated on sets of wires by electrochemistry and by direct current measurements. These experiments pave the way for future design of biocompatible and biodegradable objects that possess usable electronic properties.

La polyneuropathie amyloïde familiale à transthyrétine (FAP-TTR) est une maladie rare héréditaire à transmission autosomique dominante liée à la production de formes mutantes de la transthyrétine (TTR). Ces mutations sont à l’origine d’un changement de conformation de la protéine qui, in vivo, se présente sous forme de tétramère. Celui-ci est alors déstabilisé et évolue vers la formation de fibrilles amyloïdes qui s'accumulent au niveau du système nerveux autonome, des nerfs périphériques et des organes. Ces dépôts sont responsables de la pathologie. Dans le but d’évaluer l’efficacité des thérapies pouvant être mises en œuvre, nous avons développé des stratégies analytiques visant à concevoir un système « point of care » à usage hospitalier permettant de quantifier les formes mutante et native circulantes de la TTR. La méthodologie développée consiste à réaliser la séparation électrocinétique de fragments ciblés de la TTR, obtenus par digestion enzymatique de la protéine. Cette approche analytique a été développée en se focalisant sur une mutation fréquente en France : la TTR Thr49Ala où une thréonine est remplacée par une alanine en position 49. Au cours de cette thèse, deux types de microréacteurs enzymatiques ont été étudiés, i.e. (i) un lit fluidisé contenant des particules magnétiques fonctionnalisées par des molécules de trypsine et (ii) une puce monolithique à base de thiol-ène fonctionnalisée également par la trypsine. Le pouvoir catalytique de ces microsystèmes a été comparé en mesurant l’efficacité de digestion du BApNA (substrat modèle) et de la TTR à l’aide de méthodes analytiques telles que la spectrophotométrie d’absorption UV-Visible, l’électrophorèse capillaire couplée à une détection UV (EC-UV) et la chromatographie liquide couplée à la détection par spectrométrie de masse (UHPLC-SM). Les résultats obtenus ont montré que le microréacteur enzymatique monolithique à base de thiol-ène était le plus performant pour digérer la TTR. Par ailleurs, nous avons réalisé, au cours de cette étude, l’optimisation d’une méthode EC-UV, adaptée à l’analyse des digestats recueillis en sortie de microréacteur. Elle a permis de séparer et de quantifier les peptides d’intérêt pour déterminer le rapport de TTR mutante (Thr49Ala) sur TTR native. / Transthyretin familial amyloid polyneuropathy (TTR-FAP) is a hereditary rare disease with an autosomal dominant transmission, related to the production of mutant forms of transthyretin (TTR). These mutations lead to a conformational change of the protein whose in vivo form is a tetramer. As a consequence, this tetramer is destabilized and evolves towards the formation of amyloid fibrils that aggregate on the autonomic nervous system, peripheral nerves, and organs. These deposits are responsible for the pathology. In order to evaluate the efficiency of possible therapies, we developed analytical strategies aiming at designing a “point of care” system for hospital use, which would enable the quantification of circulating mutant and native forms of TTR. The methodology that we developed consists in undertaking the electrokinetic separation of targeted TTR fragments obtained through the enzymatic digestion of the protein. This analytical approach has been developed while focusing on a frequent mutation in France: the TTR Thr49Ala mutation in which a threonine is substituted by an alanine in position 49. In this thesis, two types of enzymatic microreactors have been studied, i.e. (i) a fluidized bed containing magnetic particles functionalized by trypsin molecules and (ii) a thiol-ene-based monolithic chip also functionalized by trypsin. The catalytic power of these microsystems has been compared by measuring the digestion efficiency of BApNA (model substrate) and TTR through analytical methods such as UV-visible absorption spectrophotometry, capillary electrophoresis with UV detection (CE-UV), and liquid chromatography with mass spectrometry detection (UHPLC-MS). The results showed that the thiol-ene-based monolithic enzymatic microreactor was the most efficient system to digest TTR. Besides, during this study, we undertook the optimization of a CE-UV method which is adapted to the analysis of digested sample collected directly out of the microreactor. This allowed us to isolate and quantify the peptides of interest to measure the ratio of mutant TTR (Thr49Ala) versus the wild one.

De nombreuses protéines associées aux maladies neurodégénératives humaines sont intrinsèquement désordonnées. Ce sont des protéines qui sont dépourvues de structure tertiaire ou secondaire stable dans des conditions physiologiques. Plus précisément, les protéines intrinsèquement désordonnées (IDPs) subissent diverses changements conformationnels entre la pelote aléatoire, des conformations hélicoïdales et des structures en feuillet-β, ces deux dernières étant généralement impliquées dans la reconnaissance protéine-protéine. Parmi une vingtaine de peptides amyloïdogènes connus liés aux maladies dégénératives humaines, notre étude porte sur deux protéines désordonnées: le peptide Amyloïde-β (Aβ) associé à la maladie d'Alzheimer et l'Islet Amyloid Polypeptide (IAPP) impliqué dans le diabète de type II. Aβ possède deux alloformes courants de 40 et 42 résidus, tandis que IAPP est une hormone peptidique de 37 résidus. Les agrégats de Aβ sont toxiques pour les cellules du cerveau, tandis que la fibrillisation de IAPP affecte les cellules-β du pancréas. Le mécanisme d'agrégation de ces deux peptides reste encore mal connu, mais il a été proposé qu’en solution, ces peptides visitent différentes conformations, l'une d'entre elles étant riche en feuillets-β. Cela conduirait à l’oligomérisation de ces peptides, par le biais d’interactions feuillet-β / feuillet-β et, éventuellement, à la formation de fibrilles. Le but de notre étude est de mieux caractériser la dynamique conformationnelle de ces deux peptides, dans leur forme monomérique et oligomérique. Comprendre les premières étapes de leur agrégation est crucial pour le développement de nouvelles molécules thérapeutiques efficaces contre ces protéines amyloïdes. / Many proteins associated with human neurodegenerative diseases are intrinsically disordered. They are proteins which lack stable tertiary or secondary structure under physiological conditions. More specifically, intrinsically disordered proteins (IDPs) undergo various structural conversions between random coil, helical conformations and β-strand structures, these two latter being generally involved in protein-protein recognition. Among about twenty known amyloidogenic peptides related to human degenerative diseases, we focus our study on two disordered proteins: the Amyloid-β peptide (Aβ) associated to the Alzheimer’s disease and the Islet Amyloid Polypeptide (IAPP) involved in type II diabetes. Aβ has two common alloforms of 40 and 42 residues in length, meanwhile IAPP is a 37-residues peptide hormone. Aggregates of Aβ are toxic to the brain cells, meanwhile IAPP fibrillization affects the pancreatic β-cells. The aggregation mechanism of these two peptides is not known in detail, but it was proposed that in solution, these peptides visit various conformations, one of them being rich in β-strands. This would lead to peptide oligomerization, through β-strand / β-strand interactions and eventually to the fibril formation. The aim of our study is to provide insights into the conformational dynamics of these two peptides in monomeric and oligomeric forms. Understanding the early steps of their aggregation is crucial for the development of new effective therapeutic molecules against these amyloid proteins.De nombreuses protéines associées aux maladies neurodégénératives humaines sont intrinsèquement désordonnées. Ce sont des protéines qui sont dépourvues de structure tertiaire ou secondaire stable dans des conditions physiologiques. Plus précisément, les protéines intrinsèquement désordonnées (IDPs) subissent diverses changements conformationnels entre la pelote aléatoire, des conformations hélicoïdales et des structures en feuillet-β, ces deux dernières étant généralement impliquées dans la reconnaissance protéine-protéine. Parmi une vingtaine de peptides amyloïdogènes connus liés aux maladies dégénératives humaines, notre étude porte sur deux protéines désordonnées: le peptide Amyloïde-β (Aβ) associé à la maladie d'Alzheimer et l'Islet Amyloid Polypeptide (IAPP) impliqué dans le diabète de type II. Aβ possède deux alloformes courants de 40 et 42 résidus, tandis que IAPP est une hormone peptidique de 37 résidus. Les agrégats de Aβ sont toxiques pour les cellules du cerveau, tandis que la fibrillisation de IAPP affecte les cellules-β du pancréas. Le mécanisme d'agrégation de ces deux peptides reste encore mal connu, mais il a été proposé qu’en solution, ces peptides visitent différentes conformations, l'une d'entre elles étant riche en feuillets-β. Cela conduirait à l’oligomérisation de ces peptides, par le biais d’interactions feuillet-β / feuillet-β et, éventuellement, à la formation de fibrilles. Le but de notre étude est de mieux caractériser la dynamique conformationnelle de ces deux peptides, dans leur forme monomérique et oligomérique. Comprendre les premières étapes de leur agrégation est crucial pour le développement de nouvelles molécules thérapeutiques efficaces contre ces protéines amyloïdes.

La maladie d'Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative liée à l’oligomérisation et à la fibrillation du peptide bêta amyloïde, avec Abêta 1-42 étant le plus agrégeant et neurotoxique. La cause exacte de la maladie d'Alzheimer n’est pas encore connue et donc il n'y a pas de traitement efficace contre cette maladie.Une stratégie prometteuse pourrait être l'inhibition de l'oligomérisation de monomères solubles d'Abêta;, en stabilisant la conformation non structurée native du peptide, à travers l’utilisation de composés capables d'empêcher la formation de feuillets bêta. En effet, les peu d'études structurales des espèces oligomériques et des fibrilles ont révélé que l'agrégation implique des structures en feuillet bêta.De nombreuses petites molécules ont été proposées pour leur capacité à inhiber ou moduler l'agrégation de Abêta 1-42 et sa toxicité. Cependant, le processus d'agrégation est très complexe et difficile à contrôler. Des études récentes indiquent que les oligomères solubles transitoires précédant la formation de fibrilles sont les espèces les plus toxiques. Ainsi, le développement d'inhibiteurs ciblant à la fois l’oligomérisation et la fibrillation reste difficile en dépit de son importance thérapeutique. Les peptides sont des alternatives raisonnables aux autres produits pharmaceutiques chimiques. En particulier, l'inhibition de l'agrégation de Abêta; a été ciblée en utilisant des éléments d'auto-reconnaissance (SRE), qui sont des séquences d'acides aminés clés impliqués dans les différentes espèces agrégées. À notre connaissance, l'utilisation de petites "bêta-hairpins" acycliques a été très rarement explorée comme ligands de feuillets-bêta et comme inhibiteurs de l'agrégation.Comme l’agrégation de Abêta est un processus dynamique et complexe, nous avons supposé que les "bêta-hairpins" flexibles pourraient mieux s'adapter dans l'interaction avec les différentes conformations de Abêta 1-42 présents pendant le processus d'agrégation, et en particulier dans les premiers stades de l'oligomérisation. Nous avons conçu des mimes de feuillets bêta acycliques basés sur un squelette semi-rigide de type pipéridine-pyrrolidine comme inducteur flexible de coude bêta, et sur différents SREs de Abêta 1-42. Le choix des SREs a été basée sur les structures d'oligomères et fibrilles.La capacité de tous les composés a été évaluée par spectroscopie de fluorescence à la thioflavine-T pour déterminer l'activité inhibitrice. Les résultats obtenus ont été complétés par microscopie à transmission électronique. Les composés les plus prometteurs ont également été étudiés par électrophorèse capillaire (EC) pour suivre les étapes très précoces du processus d'oligomérisation. Les meilleurs inhibiteurs ont été étudiés afin de déterminer leur capacité à réduire la toxicité de Abêta 1-42 sur des cellules de neuroblastome SH-SY5Y.Nous rapportons également dans cette thèse les études conformationnelles, effectuées par RMN et réalisées pour étudier et confirmer la capacité de composés de se structurer en solution comme des "bêta-hairpins".Enfin, nous avons développé une voie de synthèse pour obtenir de nouvelles chaînes peptidomimétiques composées par des résidus aza-aminoacides. Dans la littérature, seules des séquences peptidiques comportant un seul résidu aza-aminoacide au milieu, sont connues, mais les propriétés de liaison hydrogène d’un 2:1 [aza/alpha]-tripeptide ne sont pas encore, à notre connaissance, étudiées ni exploitées dans la conception d’inhibiteurs des interactions protéine-protéine. Nous présentons dans cette thèse les études conformationelles réalisées par RMN, cristallographie aux rayons X et modélisation moléculaire.On peut conclure que les éléments structurels décrits dans cette thèse fournissent des indications précieuses dans la compréhension du processus d'agrégation du peptide Abêta 1-42 et dans la conception de nouveaux " bêta-hairpins" acycliques ciblant des protéines amyloïdes. / Amyloidosis is the generic word to name a group of diseases that are caused by the misfolding and extracellular accumulation of various proteins. Alzheimer’s disease (AD) is a neurodegenerative disorder linked to oligomerization and fibrillization of amyloid β peptides, with Aβ 1-42 being the most aggregative and neurotoxic one. To date, the exactly cause of the Alzheimer's disease is not still known and so there is no effective treatment of the disease.An attractive strategy for treating AD could be the inhibition of the oligomerization of soluble Aβ monomers, by stabilizing the native unstructured conformation of the peptide, using compounds able to prevent the formation of β-sheets. Indeed, few structural studies of oligomeric species and fibrils revealed that the aggregation involves β-sheet structures.A large number of small molecules have been proposed for their ability to inhibit or modulate Aβ1-42 aggregation and toxicity. However, the aggregation process is highly complex, and extremely difficult to control. Recent studies indicate that soluble transient oligomers preceding fibril formation are highly toxic species. Thus, the development of inhibitors targeting both oligomerization and fibrillization remains challenging despite its therapeutic significance. Peptides are today reasonable alternatives to small molecule pharmaceuticals. In particular, inhibition of Aβ-aggregation has been targeted using self-recognition elements (SREs), which are key amino acid sequences involved in the different aggregated species. To our knowledge, the use of small acyclic β-hairpins has been very rarely explored as β-sheet binders and inhibitors of aggregation.As Aβ-aggregation is a dynamic and complex process, we hypothesized that flexible β-hairpins could adapt themselves in the interaction with the different Aβ1-42 conformations present during the aggregation process, and in particular in the early stages of oligomerization. We designed acyclic β-hairpin mimics based on a piperidine-pyrrolidine semi-rigid scaffold developed recently as a flexible β-turn inducer, and on different SREs of Aβ1-42. The choice of the SREs was based on oligomer and fibril structures.The ability of all compounds to influence the Aβ 1-42 fibrillization process was evaluated by thioflavin-T fluorescence spectroscopy, used as an evaluation tool to define the inhibitory activity. The obtained results were successively supplemented by transmission electron microscopy. The most promising compounds were also studied by Capillary Electrophoresis (CE) using a method we recently proposed to monitor the very early steps of the oligomerization process overtime. The best inhibitors were investigated to determine their ability to reduce the toxicity of aggregated Aβ1-42 to SH-SY5Y neuroblastoma cells.Together with the evaluation of these molecules, we report in this thesis the conformational studies performed by NMR. These structure investigations were performed to investigate and confirm the β-hairpin conformational preference of the compounds in solution.Finally, we performed a practical synthetic pathway to obtain new peptidomimetic chains composed by aza-amino acid residues. In the literature only peptide sequence, with just one aza-amino acid residue in the middle, are known, but the hydrogen-bonding properties of 2:1 [Aza/α]-tripeptides have not yet, to our knowledge, been exploited in the design of the inhibition of protein-protein interactions. We present in this thesis the conformational studies of the 2:1 [Aza/α]-tripeptide sequence by NMR analyses, X-ray crystallography and molecular modelling.In conclusion, the structural elements made in this thesis provide valuable insights in the understanding of the aggregation process of Aβ 1-42 peptide and to explore the design of novel acyclic β-hairpin targeting amyloid-forming proteins.

La maladie d'Alzheimer représente un défi mondial pour la société. Il n'y a pas à ce jour de traitement efficace pour traiter ou ralentir les symptômes de la maladie d'Alzheimer. Cette maladie est caractérisée par une perte de synapses, une augmentation du nombre de plaques extracellulaires d'Abêta et une augmentation de Tau hyperphosphorylée agrégée intracellulaire (neurodégénérescence fibrillaire). Il est communément admis que la maladie d'Alzheimer est principalement liée à l’oligomérisation et à la fibrillation de peptides amyloïdes bêta, et que les oligomères Abêta solubles et les fibres sont des espèces neurotoxiques. Une stratégie pour réduire la présence de ces espèces toxiques de Abêta est l'utilisation de peptides ou de peptidomimétiques pour inhiber l'agrégation de Abêta, soit par interaction avec les oligomères d'Abêta pour empêcher davantage son agrégation en fibres ou en stabilisant les conformations hélicoïdales transitoires de Abêta pour empêcher sa transition vers des structures en feuillets bêta. Dans un premier temps, sur la base des résultats encourageants de glycopeptides contenant un élément polaire casseur de feuillets bêta pour moduler l'agrégation du peptide Abêta, et des propriétés uniques du groupe trifluoromethylhydroxyle, nous avons conçu et synthétisé des mimes de pentapeptides contenant la séquence (Boc) Ala-Val-X-Val-Leu-OMe (X = Ser, Thr, (2S, 3R)-CF3 Thr et (2S, 3S)-CF3 Thr), pour interagir avec le site de nucléation du peptide Abêta dans sa forme monomérique ou oligomérique de manière à perturber l'auto-assemblage en oligomères toxiques. Des études conformationnelles par RMN 2D et par modélisation moléculaire ont indiqué que ces peptides adoptent des conformations étendues dans des solvants polaires (eau et méthanol). Nous avons constaté expérimentalement et théoriquement que les pentapeptides contenant l’acide aminé non naturel (2S, 3S)-CF3-thréonine sont plus étendus que les pentapeptides contenant les acides aminés naturels L-sérine et L-thréonine. Nous avons également observé que les pentapeptides (2S, 3S)-CF3-Thr ont une propension à s’auto-associer en formant des brins bêta intermoléculaires. La capacité de ces pentapeptides à inhiber la formation de fibres amyloïdes a été évaluée sur les peptides Abêta 1-42 et IAPP (impliqué dans le diabète de type II) par des essais de fluorescence à la thioflavine T (ThT). Il a été constaté qu'aucun de ces pentapeptides ont un effet d'inhibition de l'agrégation des peptides Abêta 1-42 et IAPP. Au contraire, certains composés ont montré un effet d'accélération de l'agrégation de IAPP. Accélérer l'agrégation est moins intuitif mais cette stratégie a plus récemment suscité un intérêt. Il pourrait être intéressant d'étudier plus en détail l’intérêt de cette accélération de l'agrégation de IAPP par des techniques complémentaires.Dans une deuxième partie de cette thèse, nous avons assemblé une unité amino acide basée sur un motif CF3-1,4 disubstituted-1,2,3-triazole en homo-oligomères (trimères et tétramères) et en peptidomimétiques. Des études conformationnelles de ces oligomères fluorés ont été menées par RMN 2D et par des simulations de modélisation moléculaire. Nos études préliminaires de modélisation moléculaire prévoient des structures hélicoïdales avec des trimères et des tétramères d'acides aminés à base de ces CF3-triazoles. L'analyse par RMN 2D du tétramère affiche des corrélations NOE très intéressantes, ce qui indique une structure repliée. La capacité de ces oligomères fluorés à moduler la formation de fibres amyloïdes des peptides Abêta 1-42 et IAPP a été évaluée par test de fluorescence à la ThT. Nous avons constaté que le trimère est un faible inhibiteur de l'agrégation de Abêta 1-42, mais aussi un promoteur d'agrégation de IAPP. Le tétramère a été trouvé capable de moduler l'agrégation de Abêta 1-42 et de IAPP, mais non d'une manière classique d'inhibition ou de promotion. / It has been widely recognized that Alzheimer’s disease (AD) represents an unsettling, worldwide challenge for society. By far, there has been no effective cure for AD. Pathologically, AD is characterized by a loss of synapses, an increase in the number of extracellular Abeta plaques and an increase in intracellular aggregated hyperphosphorylated Tau (neurofibrillary tangles). It is commonly believed that AD is primarily linked to oligomerization and fibrillization of amyloid beta peptides, and the soluble Abeta oligomers and fibrils are neurotoxic species.One strategy to reduce the Abeta fibrils is the use of peptides or peptidomimetics to inhibit the Abeta aggregation either by interaction with the Abeta oligomers to prevent its further aggregation into fibrils, or by stabilizing the transient Abeta α-helical conformations to prevent its transition to beta-sheet structures.In the first direction, based on the encouraging results of the glycopeptides containing the polar sugar beta-sheet breaker element to modulate Abeta peptide aggregation and the unique properties of trifluoromethylhydroxyl group, we designed and synthesized pentapeptide mimics with the sequence (Boc) Ala-Val-X-Val-Leu-OMe (X = Ser, Thr, (2S, 3R)-CF3-Thr and (2S, 3S)-CF3-Thr) to interact with the nucleation site of Abeta peptide in its monomeric or oligomeric form so as to disrupt the self-assembly into toxic oligomeric form. Both 2D NMR and molecular modelling studies indicated that these peptides in polar solvent (water and methanol) adopt mainly extended backbone conformations. It is found both experimentally and theoretically that, the (2S, 3S)-CF3-threonine-containing pentapeptides are more extended than the L-serine- and L- threonine-containing pentapeptides. It is also observed that the (2S, 3S)-CF3-Thr pentapeptides have a propensity to self-associate of by forming intermolecular beta-strand contacts. The ability of these pentapeptides to inhibit amyloid fibril formation was evaluated on Abeta1-42 and IAPP peptides by ThT fluorescence assay. It was found that none of these pentapeptides have any inhibition effect in Abeta1-42 peptide and IAPP aggregation. On the contrary, some compounds showed an acceleration effect in IAPP aggregation. Accelerating the aggregation pathways is less intuitive but this strategy has more recently aroused interest. It could be interesting to further study the effect of accelerating IAPP aggregation by complementary techniques.In the other direction, we have assembled novel a CF3-1,4-triazole-based amino acid mimic into homo-oligomers (trimer and tetramer) and peptidomimetics. The fluorinated oligomers were investigated both by NMR conformational studies and molecular modelling simulations. Our preliminary modelling studies predict helical structures with trimer and tetramers of CF3-1,4-disubstituted- 1,2,3- triazole-based amino acid. NMR analysis of tetramer displayed very interesting NOE correlations, indicating a folded structure. The ability of these fluorinated oligomers to modulate the amyloid fibril formation of Abeta1-42 and IAPP peptides were evaluated by ThT fluorescence assay. It was found that trimer was a weak inhibitor of Abeta1-42 aggregation but also a promoter of IAPP aggregation. The tetramer was found able to modulate the aggregation of Abeta1-42 and IAPP but not in a classical inhibition or promotion manner.

Le mauvais repliement et l’agrégation des protéines représentent une cause fondamentale des pathologies amyloïdes. Des dépôts de protéines sous la forme de fibrilles amyloïdes sont une composante caractéristique de plus de vingt maladies neurodégénératives incluant la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson et la maladie d’Huntington. Des nanotubes composés de peptides-α -D,L cycliques synthétiques peuvent mimer les propriétés structurelles et biochimiques des protéines amyloïdes. L’introduction de résidus aza-aminés dans des peptides α -D,L cycliques a été étudiée dans le but d’augmenter les interactions hydrogènes intermoléculaires entre les différents macrocycles superposés composant le nanotube. Les peptides aza-α-D,L cycliques devraient aussi posséder une meilleure capacité d’interaction avec les feuillets des oligomères amyloïdes. Le peptide d’intérêt CP-2 possède la séquence [l-J-w-H-s-K], où les lettres minuscules et majuscules font référence respectivement aux acides aminés D et L, les crochets indiquent une structure cyclique et la lettre « J » représente la norleucine. En exploitant la capacité des semicarbazides d’accroitre les ponts hydrogènes intermoléculaires, nous avons remplacés successivement chacun des acides aminés de la séquence CP-2 par un résidu aza-glycine, obtenant une librairie d’azapeptides cycliques. Ces peptides ont été testés pour leur propriété neuroprotectrice contre les amyloïdes en utilisant un essai de viabilité cellulaire (essai MTT). Le peptide où la D-serine a été remplacée par une aza-glycine, CP-2 (4), s’est avéré plus efficace que CP-2. Il s’agit du premier exemple d’introduction d’un résidu aza-aminé dans un peptide α-D,L cyclique, et ces résultats pourraient être extrapolés à d’autres peptides α-D,L cycliques d’intérêt thérapeutique. / Protein misfolding and aggregation are the fundamental causes of amyloid diseases. Deposits of proteins in the form of amyloid fibrils and plaques are the characteristic features of more than twenty degenerative conditions, including Alzheimer’s, Parkinson’s, and Huntington’s diseases. Synthetic cyclic D,L-α-peptide nanotubes can mimic the structural and biochemical properties of amyloid proteins. The introduction of aza-residues into cyclic D,L-α-peptides was studied to enhance intermolecular hydrogen bonding between stacked rings within the tube structures. The resulting cyclic aza-D,L-α-peptides were also expected to exhibit enhanced propensity to interact with the sheet structures of amyloid oligomers. The lead peptide CP-2 features the sequence [l-J-w-H-s-K] in which lower and upper-case letters indicate D- and L-amino acids, respectively, square brackets designate a cyclic structure, and J denotes norleucine. There are no reports for introduction of aza-residues into cyclic D,L-α-peptides. Considering the potential for semicarbazides to enhance intermolecular hydrogen bonding, we performed an aza-glycine scan of the CP-2 sequence by preparing a focused library of azapeptides. All the cyclic aza-glycine peptides were tested for neuroprotective activity against amyloid using cell viability assay (MTT assay). The aza-glycine replacing D-serine i.e., [azaG2]-CP-2 (4) was found to be more potent than CP-2. This is the first example of introducing an aza-amino residue into a cyclic D, L-α-peptide, and these results could be extrapolated to other cyclic D, L-α-peptides of therapeutic interest.

Les plaques amyloïdes, composées d’agrégats de protéines bêta-amyloïde, sont l’un des principaux marqueurs physiopathologiques de la maladie d’Alzheimer et peuvent s’accumuler jusqu’à trois décennies avant les premiers signes cliniques. Il n’est pas encore bien établi dans quelle mesure le vieillissement cognitif normal pourrait dépendre de la présence de cette pathologie cérébrale. Par ailleurs, la réserve cognitive reflète le décalage parfois observé entre le niveau de pathologie et les manifestations cliniques de démence. En plus d’être associée à un risque réduit de développer une maladie neurodégénérative, la réserve cognitive rend compte d’une susceptibilité réduite de présenter un déclin cognitif associé au vieillissement normal. Cependant, la littérature demeure mitigée quant à l’effet protecteur de la réserve cognitive face à une charge amyloïde élevée à un stade où la cognition est cliniquement normale. L’objectif général de cette thèse était donc d’acquérir une meilleure compréhension de la relation entre la charge amyloïde, la cognition et la réserve cognitive au sein du vieillissement normal. Cette question de recherche a été étudiée grâce à la participation d’un groupe de 104 personnes âgées (77 femmes, âge moyen de 73 ans). Suivant une procédure de dépistage permettant de recruter uniquement des aînés sans trouble cognitif, une batterie d’épreuves neuropsychologiques a été administrée à partir de laquelle une mesure de mémoire épisodique a été extraite. Puis, l’imagerie par résonance magnétique et la tomographie par émission de positons ont permis d’établir la charge amyloïde de chaque participant. La première étude avait comme objectif de documenter chez cette population, d’une part, l’impact de la charge amyloïde sur l’efficience de la mémoire épisodique, et d’autre part, l’effet de la scolarité sur cette relation. Les résultats de cette étude ont permis d’appuyer l’idée que la performance en mémoire épisodique est associée à la charge amyloïde, relation qui est modérée par la scolarité. Plus précisément, cette association demeure significative jusqu’à 13.5 années d'études, alors qu’au-delà de ce seuil, la pathologie n’a plus d’impact sur les performances en mémoire. Ce résultat est cohérent avec celui démontrant que les performances en mémoire épisodique des participants ayant un diplôme d’études secondaires et collégiales étaient significativement affectées par les dépôts amyloïdes comparativement au groupe d’universitaires. La deuxième étude visait à évaluer l’effet protecteur d’autres proxys de réserve cognitive reconnus comme pouvant compenser les effets de l’âge et d’une pathologie cérébrale, soit la profession, le vocabulaire et les activités cognitivement stimulantes liées au style de vie. L’effet de différents indexes composites de réserve ont aussi été examinés. Lorsque considérés individuellement, seule la profession modère significativement la relation entre la charge amyloïde et la mémoire épisodique. Enfin, la combinaison de la profession et de la scolarité démontre la plus grande taille d'effet relativement à la modération de l’impact du fardeau amyloïde sur la mémoire épisodique. Cette thèse met en évidence l’impact de la charge amyloïde sur l’efficience de la mémoire épisodique dans le vieillissement normal. Néanmoins, les personnes âgées cognitivement normales ayant une réserve cognitive mieux développée seraient protégées contre l’effet délétère qu’entraîne cette pathologie sur la mémoire épisodique. / Amyloid plaques, aggregates of beta-amyloid proteins, are one of the main pathophysiologic markers of Alzheimer's disease and can accumulate up to three decades before the first clinical signs. It is unclear to what extent normal cognitive aging might depend on the presence of this brain pathology. Furthermore, cognitive reserve reflects the discrepancy that can be observed between the level of pathology and the clinical manifestations of dementia. In addition to being associated with a reduced risk of developing a neurodegenerative disease, cognitive reserve accounts for the reduced susceptibility to cognitive decline associated with aging. However, whether cognitive reserve may help withstand the effect of high amyloid load among cognitively normal older adults is still unclear. The general objective of this thesis was therefore to gain a better understanding of the relationship between amyloid load, cognition and cognitive reserve in normal aging. This research question was investigated through a sample of 104 older adults (77 women, mean age 73 years). Following a screening procedure which allowed to recruit only older adults with clinically normal cognition, a battery of neuropsychological tests was administered from which a measure of episodic memory was extracted. Participants underwent magnetic resonance imaging and positron emission tomography in order to quantify beta-amyloid load in each participant. The first study aimed to better characterize in this population, on the one hand, the impact of amyloid deposition on the efficiency of episodic memory, and on the other hand, the effect of education against this pathology. Performance in episodic memory was significantly associated with amyloid load, and this relationship was moderated by education. More precisely, the association remained significant up to 13.5 years of education, whereas beyond this threshold, amyloid load no longer had an impact on episodic memory performances. This result is consistent with the fact that the episodic memory performance of participants with a high school and college diploma were significantly affected by amyloid deposits compared to participants with a university degree. The second study aimed to investigate the protective effect of cognitive reserve against amyloid burden by means of other well-documented proxies of cognitive reserve that help better cope with age or pathology, such as occupation, vocabulary and cognitively stimulating lifestyle activities. The effect of different composite indexes of cognitive reserve was also examined. Taken individually, only occupation significantly moderated the relationship between amyloid load and episodic memory. In addition, when combined with education, this composite index of cognitive reserve demonstrated the largest effect size relatively to the moderation of the impact of amyloid burden on episodic memory. This thesis highlights the impact of amyloid load on episodic memory efficiency in normal aging. Furthermore, cognitively normal older adults with higher cognitive reserve appear to be protected against the deleterious effect of amyloid load on episodic memory.

La maladie d’Alzheimer (MA) se présente souvent comme un déclin progressif des fonctions cognitives et comportementales. Au niveau biologique, on observe une accumulation de la protéine bêta-amyloïde (Aß) et de la protéine tau, une altération de la fonction synaptique ainsi qu’une mort neuronale. Des travaux récents ont démontré qu’une souche spécifique de probiotiques, Lacticaseibacillus rhamnosus HA-114 (HA-114), avait des propriétés neuroprotectrices dans plusieurs modèles de maladies neurodégénératives. Le projet de recherche présent visait à caractériser les aspects neurophysiologiques d’une souche de nématodes transgéniques exprimant l’Aß et valider la neuroprotection de HA-114 dans ce modèle ainsi que dans un modèle murin de la MA (APP/PS1). Les résultats présentés dans ce manuscrit montrent que les vers transgéniques exprimant le fragment 1-42 de l’Aß récapitulent des caractéristiques clés de la MA, soit une altération de la santé neuronale et de la mémoire liée à l’âge. Il s’agit donc d’un nouvel outil pour l’investigation de la physiopathologie de la MA et pour l’essai de molécules ayant un potentiel thérapeutique. Les données expérimentales montrent aussi que l’administration de HA-114 permet d’atténuer les phénotypes de neurodégénérescence et de paralysie liée à l’âge. Cela témoigne d’un potentiel en vue de l’amélioration de la qualité de vie des patients qui souffrent de la MA. L’étude des effets de HA-114 dans un modèle murin pourrait révéler de nouvelles avenues d’investigations pour la physiopathologie de la MA et les mécanismes par lesquels on pourrait un jour la traiter. / Alzheimer’s disease (AD) often presents itself as a progressive decline of behavioral and cognitive functions such as memory impairment. On a biological level, this disease presents extracellular accumulation of amyloid-beta (Aß), intracellular accumulation of tau, alteration of synaptic function and neuronal loss. Recent data showed that a supplementation with a specific probiotic strain of bacteria, Lacticaseibacillus rhamnosus HA-114 (HA-114), had a neuroprotective effect in several neurodegenerative disease models. This project aimed to characterize the neurophysiological aspects of a specific nematode strain expressing the Aß1-42 fragment and to validate the neuroprotective effect of HA-114 in this nematode strain as well as in the APP/PS1 murin model of AD. Following biochemical and behavioral experiments, data showed that this strain recapitulates key traits of AD: an age-dependent alteration of neuronal health and memory impairment. It was also observed that administrating HA-114 probiotic strain could attenuate age-related phenotypes of neurodegeneration and paralysis. This transgenic strain is therefore a new tool for drug screening and investigating AD’s pathogenesis. The neuroprotective effect of HA-114 observed in this strain shows potential towards an amelioration of the patient’s quality of life. Studying the effects of HA-114 in a murin model could reveal new investigation opportunities for AD’s pathogenesis and mechanisms that could one day cure this disease.

Les maladies neurodégénératives d’Alzheimer et de Parkinson sont caractérisées par des agrégats des peptides des amyloïdes-beta (Aβ) et l’alpha synucléine (αSyn), respectivement. L’agrégation de ces peptides solubles donne les matériels insolubles (les amyloïdes) sous forme de fibrilles et de plaques. L’agrégation de ces amyloïdes insolubles cause de la toxicité cellulaire dans le cerveau provoquant les effets neurodégénératifs. Les D, L-α-cyclopeptides synthétiques (e. g., CP-2, c-[leu-Nle-trp-His-ser-Lys]) furent synthétisés précédemment par le groupe de Rahimipour. Ils sont capables de former des nanotubes par pont hydrogène capables d’inhiber l’activité néfaste des amyloïdes. Les azapeptides utilisent de semicarbazide comme un substituant d’amide aminé. Insérés dans le D, L-α-cyclopeptide CP-2, les aza-résidus permettent d’améliorer la basicité de Lewis et l’acidité de Bronsted du peptide pour obtenir des ponts hydrogènes plus forts. Les azapeptides [azaNle3]-CP-2, [azaHse6]-CP-2 et [azaGly6]-CP-2 offrent d’excellents résultats au niveau des tests biologiques pour inhiber l’activité des amyloïdes ainsi que pour réduire la mortalité cellulaire en présence d’amyloïdes. À partir de ces résultats prometteurs, l’insertion de deux azapeptides dans un D, L-α-cyclopeptide a été effectué. En remplaçant l’histidine par l’alanine pour éviter des problèmes d’épimérisation, quatre nouveaux diazacyclopeptides ont été synthétisés en insérant les aza-résidus : l’aza-norleucine (azaNle), l’aza-homoserine (azaHse) et l’azaglycine (azaGly). Leur synthèse ainsi que leur caractérisation biophysique préliminaire seront présentés. / Alzheimer's and Parkinson's diseases are neurodegenerative diseases characterized by the aggregation of the peptides amyloid-beta (Aβ) and alpha-synuclein (Synα), respectively. The aggregation of these soluble peptides gives insoluble peptides (amyloids) in the forms of fibrils and plaques. Aggregation of insoluble amyloids can cause cellular toxicity in the brain resulting in neurodegenerative effects. Certain synthetic cyclic D,L-alpha-peptides (e.g., CP-2, c-[leu-Nle-trp-His-ser-Lys]) were previously synthesized by the Rahimipour laboratory and shown to form intermolecular hydrogen bonds and self-assemble into nanotubes capable of inhibiting the aggregation and harmful effects of amyloids. Azapeptides employ semicarbazides as amino amide surrogates. Insertion of aza-residues into the D,L-α-cyclopeptide CP-2 was explored to alter the Lewis basicity and Bronsted acidity of the peptide and improve hydrogen bonding potential. The azapeptides [azaNle3]-CP-2, [azaHse6]-CP-2, and [azaGly6]-CP-2 inhibited effectively amyloid aggregation and reduced amyloid-induced cell death. Based on the promising results of single aza-residue substitutions, the insertion of two aza-residues into D,L-α- cyclopeptide CP-2 analogs was investigated. Histidine was replaced with alanine to minimize epimerization. Four new diazacyclopeptides were synthesized by inserting aza-norleucine (azaNle), aza-homoserine (azaHse) and aza-glycine (azaGly). The syntheses and preliminary biophysical characterizations of the diazacyclopeptides will be presented.

Dans la maladie d'Alzheimer (MA), les altérations du sommeil sont parmi les premiers symptômes cliniques observés. Il existe une littérature croissante indiquant que les oligomères amyloïde-bêta (Aβo) sont particulièrement neurotoxiques et leur contribution spécifique aux troubles du sommeil reste à définir. Récemment, une dérégulation du métabolisme lipidique a été signalée dans le cerveau des patients atteints de la MA et des modèles animaux. De plus, l'inhibition de la stéaroyl-CoA désaturase (SCD), une enzyme de conversion lipidique, a montré qu'elle rétablissait la mémoire chez les souris triple transgénique (3xTg), modèle de la MA. Dans le cerveau, les astrocytes régulent la synthèse de lipides et des altérations des astrocytes et de leurs fonctions ont été signalées chez les patients atteints de la MA et les modèles animaux. De plus, les astrocytes ont été impliqués dans la régulation du sommeil. Cependant, la relation entre les troubles du sommeil, les astrocytes et le métabolisme lipidique reste à explorer dans la MA. Par conséquent, cette thèse avait deux objectifs : définir l'effet d'Aβo sur différentes variables de sommeil et vérifier si la SCD contribue aux troubles du sommeil chez les 3xTg et si cela s'associe à des modifications de la fonction astrocytaire. Pour cela, des injections chroniques (6 jours) d'Aβo dans l'hippocampe ont été réalisées chez des rats mâles de type sauvage (WT pour « Wild-type ») et des mesures électroencéphalographiques (EEG) ont été effectuées pour définir les altérations veille/sommeil. De plus, des souris femelles WT et 3xTg ont reçu un traitement intracérébroventriculaire de 28 jours avec un inhibiteur de la SCD (SCDi) ou un véhicule, et des enregistrements EEG ont été réalisés après les 28 jours de traitement. Des sections de cerveau ont été soumises à une coloration pour les marqueurs astrocytaires, tels que la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) et l’aldéhyde déshydrogénase 1 de type L1 (ALDH1L1), en vue de réaliser une quantification cellulaire et/ou une évaluation morphologique dans l'hippocampe, l'hypothalamus latéral et le thalamus. Les résultats montrent que le temps passé en éveil, en sommeil lent (SL) et en sommeil paradoxal (SP) a été préservé chez les rats injectés avec l'Aβo. Cependant, l'activité spectrale de l'EEG pendant l'éveil a été augmentée par l’Aβo pour l'activité des ondes lentes (0,5-5 Hz) et l'activité bêta de basse fréquence (16-20 Hz), tandis qu'elle a été diminuée pendant le SL pour l'activité thêta (5-9 Hz) et alpha (9-12 Hz). De plus, le ratio thêta/activité à ondes lentes a été diminué pendant l'éveil et le SL. De plus, six jours d’injection d’Aβo ont été nécessaires pour observer les changements spectraux chez le rat. Concernant le second objectif, le traitement SCDi n’a pas restauré la diminution du temps d'éveil et l'augmentation du temps passé en SL chez les souris 3xTg. L'activité EEG rythmique et arythmique a été considérablement altérée chez les souris 3xTg pour tous les états d'éveil/sommeil, et le SCDi a modifié significativement ces phénotypes de manière différente chez les souris mutantes par rapport aux souris WT. Les densités de cellules positives pour GFAP et ALDH1L1 ont été augmentés dans l'hippocampe et l'hypothalamus/thalamus, respectivement, et le SCDi a atténué l'augmentation dans la région CA1 en particulier. Les résultats confirment la présence d'altérations du sommeil dans les modèles de la MA et suggèrent que les phénotypes de sommeil pourraient servir de marqueur non invasif précoce de la MA. Cependant, malgré le ciblage du métabolisme lipidique par l'inhibition de la SCD, les diverses perturbations du cycle éveil/sommeil chez les souris 3xTg n’ont pas été significativement rétablies. Mais il semble que ce traitement soit capable de renverser les modifications astrocytaires observées dans l'hippocampe. Ce travail contribuera à la compréhension de la physiopathologie liée à la MA et aux troubles du sommeil associés. / In Alzheimer's disease (AD), sleep disturbances are among the earliest clinical symptoms observed. There is a growing body of evidence indicating that soluble amyloid-bêta oligomers (Aβo) are particularly neurotoxic, and their specific contribution to sleep disorders is yet to be defined. Recently, dysregulation of lipid metabolism has been reported in the brains of AD patient and animal models. Furthermore, inhibition of stearoyl-CoA desaturase (SCD), a lipid-converting enzyme, has shown to restore memory in triple transgenic (3xTg) mice, an AD model. In the brain, astrocytes regulate lipid synthesis, and alterations in astrocytes and their function have been reported in AD patient and animal models. Additionally, astrocytes have been implicated in the regulation of sleep. However, the relationship between sleep disturbances, astrocytes, and lipid metabolism remains to be explored in AD. Therefore, this thesis had two objectives: to define the effect of Aβo on various sleep variables and to investigate whether SCD contributes to sleep disturbances in 3xTg mice and if this is associated with changes in astrocytic function. For this purpose, chronic injections (6 days) of Aβo into the hippocampus were performed in male wild-type (WT) rats, and electroencephalographic (EEG) measurements were conducted to assess wake/sleep alterations. Additionally, female WT and 3xTg mice received a 28-day intracerebroventricular treatment with an SCD inhibitor (SCDi) or a control, and EEG recordings were made after the 28-day treatment. Brain sections were stained for astrocytic markers, such as glial fibrillary acidic protein (GFAP) and aldehyde dehydrogenase 1 family member L1 (ALDH1L1), to perform cell counting and/or morphological evaluation in the hippocampus, lateral hypothalamus, and thalamus. The results show that the time spent awake, in slow-wave sleep (SWS), and in rapid eye movement (REM) sleep was preserved in rats injected with Aβo. However, spectral EEG activity during wakefulness was increased by Aβo for slow-wave (0.5-5 Hz) and low-frequency beta (16-20 Hz) activity, while it was decreased during SWS for theta (5-9 Hz) and alpha (9-12 Hz) activity. Additionally, the theta/SWA ratio was decreased during wakefulness and SWS. Furthermore, six days of Aβo injection were required to observe spectral changes in rats. Regarding the second objective, SCDi treatment did not restore the reduction in wake time and the increase in SWS time in 3xTg mice. Rhythmic and arrhythmic EEG activity was significantly altered in 3xTg mice for all wake/sleep states, and SCDi significantly modified these phenotypes differently in mutant mice compared to WT mice. GFAP- and ALDH1L1-positive cell densities were increased in the hippocampus and lateral hypothalamus/thalamus, respectively, and SCDi attenuated the increase in the CA1 region only. The results confirm the presence of sleep alterations in Alzheimer's disease models and suggest that sleep phenotypes could serve as a non-invasive marker of early Alzheimer's disease. However, despite targeting lipid metabolism through SCD inhibition, the various disturbances in the wake/sleep in 3xTg mice were not significantly restored. Nevertheless, it appears that this treatment can reverse astrocytic changes observed in the hippocampus. This work will contribute to the understanding of the pathophysiology related to Alzheimer's disease and associated sleep disturbances.