INTRODUÇÃO: As osteocondrodisplasias constituem um grupo heterogêneo de doenças que comprometem a formação, crescimento e desenvolvimento do sistema esquelético. O diagnóstico definitivo, principalmente nas formas com acometimento de coluna, epífise e/ou metáfise, é desafiador, devido à heterogeneidade genética, raridade de algumas formas específicas e da sobreposição de fenótipos clínico-radiológicos. OBJETIVOS: avaliar as características clínico-radiológicas e as bases moleculares de um grupo de pacientes com osteocondrodisplasias com envolvimento do esqueleto axial associado a anomalias epifisárias e/ou metafisárias. MÉTODOS: Foram avaliados clínica-radiologicamente 65 pacientes de 58 famílias (com mediana de idade de 9 anos e 2 meses) com osteocondrodisplasias de acometimento espôndilo-epi-metafisários pertencentes a 15 diferentes grupos da Nosologia de anomalias ósseas genéticas. Os pacientes foram classificados em cinco categorias (I,IIA,IIB,III,IV), levando-se em consideração a certeza do diagnóstico de uma determinada displasia esquelética pelos aspectos clínico-radiológicos (I,IIA,IIB,IV), o conhecimento (I,IIA,IIB) ou não (III,IV) da base molecular e o tamanho/número de éxons a serem analisados. De acordo com esta classificação, um fluxograma foi estabelecido para a decisão de qual técnica de sequenciamento seria empregada: Sanger (I) ou sequenciamento de nova geração, sob a forma de um painel de genes customizado (IIA,III) ou do exoma (IIB,III,IV). RESULTADOS: dentre os 64 pacientes analisados por um teste molecular, variantes consideradas causativas do fenótipo foram encontradas em 61 (95%). De acordo com as categorias estabelecidas, a positividade do teste genético inicial e o número de indivíduos analisados foram: categoria I (13/17), IIA (32/36), IIB (2/2), III (1/3), IV (6/6). Em sete casos (três na categoria I, dois na categoria IIA e dois na categoria III), nos quais a estratégia molecular inicial não obteve sucesso, testes moleculares adicionais foram realizados como complementação, possibilitando a identificação da base molecular das osteocondrodisplasias em questão. Em um paciente na categoria I e nos dois indivíduos da categoria IIA, nos quais não foi possível identificar uma variante patogênica, nenhum teste genético adicional foi realizado. Dentre os casos com resultados positivos, em um paciente na categoria IIB, o resultado final mudou a hipótese diagnóstica inicial; dois pacientes classificados como IIA e III, o quadro clínico presente era leve, contrastando com o quadro típico descrito nas osteocondrodisplasias causadas por mutações nos genes INPPL1 e HSPG2. No grupo de osteocondrodisplasias sem etiologia conhecida (categoria IV), foram identificadas variantes em três novos genes (PCYT1A, FN1 e LONP1). Uma re-análise nos casos negativos permitiu a identificação de mais um paciente com mutação em FN1. Mutações novas em genes previamente conhecidos foram encontradas nos genes COL2A1, COL11A1, CHST3, SLC26A2, HSPG2, ACAN, TRPV4, COMP, SMARCAL1, INPPL1, NPR2, LIFR e CANT1. CONCLUSÕES: o presente estudo mostrou que uma caracterização clínico-radiológica bem elaborada permite uma maior concordância com os testes moleculares. Em algumas situações, a sobreposição fenotípica impediu que o diagnóstico definitivo fosse estabelecido apenas por critérios clínico-radiológicos, exigindo o emprego de testes moleculares adicionais para o correto diagnóstico e, consequentemente, um aconselhamento genético mais preciso. Os achados clínico-radiológicos e moleculares contribuíram para ampliar o espectro fenotípico de algumas osteocondrodisplasias, particularmente aquelas decorrentes de variantes nos genes HSPG2 e INPPL1, além de desvendar as bases genéticas de três osteocondrodisplasias / INTRODUCTION: Osteochondrodysplasias comprise a heterogeneous group of bone disorders affecting formation, growth, and development of the skeleton. An accurate diagnosis could be challenging due to the genetic heterogeneity, rarity of specific types, and overlapping of clinical and radiographic phenotypes. OBJECTIVES: to evaluate the clincal and radiographic characteristics, as well as the molecular basis of a group of patients with spondylo-epi and/or metaphyseal osteochondrodyplasias. METHODS: Sixty-five patients from 58 families (with a median age of 9 years 2 months) with spondylo-epi-metaphyseal osteocondrodysplasias, from 15 different groups from the Nosology of Genetic Bone Disorders, were enrolled. Patients were classified into five categories (I,IIA,IIB,III,IV), considering the diagnostic certainty of a specific osteochondrodysplasia, based on clinical and radiographic findings (I,IIA,IIB,IV), the previous knowledge (I,IIA,IIB), or not (III,IV) of the molecular basis, as well as, the size/number of exons to be tested. According to this classification, a flowchart was established to aid on the molecular testing strategy: Sanger sequencing (I), or next generation sequencing, at the form of a custom targeted gene panel (IIA,III), or exome sequencing (IIB,III,IV). RESULTS: Phenotype causing variants were found in 61 out of 64 patients (95%). Based on the category system described above, the initial molecular testing positivity was: category I (13/17), IIA (32/36), IIB (2/2), III (1/3), and IV (6/6). In seven cases (three in category I, two in category IIA, and two in category III), additional genetic tests applied were able to find the causative mutation, when the initial testing strategy was not successful. For one patient in category I and two in category IIA, in whose no pathogenic mutation was found, no further molecular studies were performed. Among the positive cases, one patient in category IIB had his former clinical diagnosis changed through the molecular testing; two patients form categories IIA and III showed a milder phenotype, in contrast to the expected clinical findings in INPPL1 and HSPG2 osteochondrodysplasias. The molecular basis of three different osteochondrodysplasias (category IV) was unraveled by this study (genes PCYT1A, FN1 e LONP1). A re-analysis of the negative cases allowed the identification of another patient harboring mutation in FN1. Novel variants were found in previously known genes: COL2A1, COL11A1, CHST3, SLC26A2, HSPG2, ACAN, TRPV4, COMP, SMARCAL1, INPPL1, NPR2, LIFR, and CANT1. CONCLUSIONS: The present study showed that a well-elaborated clinical-radiological characterization allows greater correspondence with the molecular testing. In some cases, phenotypic overlap prevented the definitive diagnosis from being established only by clinical-radiological criteria, requiring the use of additional molecular tests for the correct diagnosis, and consequently, a more accurate genetic counseling. The clinical-radiographic, as well as the molecular findings, contributed to expand the clinical phenotype in certain groups, especially the variants found in patients with HSPG2 and INPPL1 osteochondrodysplasias, besides unraveling the molecular basis of three osteochondrodysplasias

INTRODUÇÃO: As osteocondrodisplasias constituem um grupo heterogêneo de doenças que comprometem a formação, crescimento e desenvolvimento do sistema esquelético. O diagnóstico definitivo, principalmente nas formas com acometimento de coluna, epífise e/ou metáfise, é desafiador, devido à heterogeneidade genética, raridade de algumas formas específicas e da sobreposição de fenótipos clínico-radiológicos. OBJETIVOS: avaliar as características clínico-radiológicas e as bases moleculares de um grupo de pacientes com osteocondrodisplasias com envolvimento do esqueleto axial associado a anomalias epifisárias e/ou metafisárias. MÉTODOS: Foram avaliados clínica-radiologicamente 65 pacientes de 58 famílias (com mediana de idade de 9 anos e 2 meses) com osteocondrodisplasias de acometimento espôndilo-epi-metafisários pertencentes a 15 diferentes grupos da Nosologia de anomalias ósseas genéticas. Os pacientes foram classificados em cinco categorias (I,IIA,IIB,III,IV), levando-se em consideração a certeza do diagnóstico de uma determinada displasia esquelética pelos aspectos clínico-radiológicos (I,IIA,IIB,IV), o conhecimento (I,IIA,IIB) ou não (III,IV) da base molecular e o tamanho/número de éxons a serem analisados. De acordo com esta classificação, um fluxograma foi estabelecido para a decisão de qual técnica de sequenciamento seria empregada: Sanger (I) ou sequenciamento de nova geração, sob a forma de um painel de genes customizado (IIA,III) ou do exoma (IIB,III,IV). RESULTADOS: dentre os 64 pacientes analisados por um teste molecular, variantes consideradas causativas do fenótipo foram encontradas em 61 (95%). De acordo com as categorias estabelecidas, a positividade do teste genético inicial e o número de indivíduos analisados foram: categoria I (13/17), IIA (32/36), IIB (2/2), III (1/3), IV (6/6). Em sete casos (três na categoria I, dois na categoria IIA e dois na categoria III), nos quais a estratégia molecular inicial não obteve sucesso, testes moleculares adicionais foram realizados como complementação, possibilitando a identificação da base molecular das osteocondrodisplasias em questão. Em um paciente na categoria I e nos dois indivíduos da categoria IIA, nos quais não foi possível identificar uma variante patogênica, nenhum teste genético adicional foi realizado. Dentre os casos com resultados positivos, em um paciente na categoria IIB, o resultado final mudou a hipótese diagnóstica inicial; dois pacientes classificados como IIA e III, o quadro clínico presente era leve, contrastando com o quadro típico descrito nas osteocondrodisplasias causadas por mutações nos genes INPPL1 e HSPG2. No grupo de osteocondrodisplasias sem etiologia conhecida (categoria IV), foram identificadas variantes em três novos genes (PCYT1A, FN1 e LONP1). Uma re-análise nos casos negativos permitiu a identificação de mais um paciente com mutação em FN1. Mutações novas em genes previamente conhecidos foram encontradas nos genes COL2A1, COL11A1, CHST3, SLC26A2, HSPG2, ACAN, TRPV4, COMP, SMARCAL1, INPPL1, NPR2, LIFR e CANT1. CONCLUSÕES: o presente estudo mostrou que uma caracterização clínico-radiológica bem elaborada permite uma maior concordância com os testes moleculares. Em algumas situações, a sobreposição fenotípica impediu que o diagnóstico definitivo fosse estabelecido apenas por critérios clínico-radiológicos, exigindo o emprego de testes moleculares adicionais para o correto diagnóstico e, consequentemente, um aconselhamento genético mais preciso. Os achados clínico-radiológicos e moleculares contribuíram para ampliar o espectro fenotípico de algumas osteocondrodisplasias, particularmente aquelas decorrentes de variantes nos genes HSPG2 e INPPL1, além de desvendar as bases genéticas de três osteocondrodisplasias / INTRODUCTION: Osteochondrodysplasias comprise a heterogeneous group of bone disorders affecting formation, growth, and development of the skeleton. An accurate diagnosis could be challenging due to the genetic heterogeneity, rarity of specific types, and overlapping of clinical and radiographic phenotypes. OBJECTIVES: to evaluate the clincal and radiographic characteristics, as well as the molecular basis of a group of patients with spondylo-epi and/or metaphyseal osteochondrodyplasias. METHODS: Sixty-five patients from 58 families (with a median age of 9 years 2 months) with spondylo-epi-metaphyseal osteocondrodysplasias, from 15 different groups from the Nosology of Genetic Bone Disorders, were enrolled. Patients were classified into five categories (I,IIA,IIB,III,IV), considering the diagnostic certainty of a specific osteochondrodysplasia, based on clinical and radiographic findings (I,IIA,IIB,IV), the previous knowledge (I,IIA,IIB), or not (III,IV) of the molecular basis, as well as, the size/number of exons to be tested. According to this classification, a flowchart was established to aid on the molecular testing strategy: Sanger sequencing (I), or next generation sequencing, at the form of a custom targeted gene panel (IIA,III), or exome sequencing (IIB,III,IV). RESULTS: Phenotype causing variants were found in 61 out of 64 patients (95%). Based on the category system described above, the initial molecular testing positivity was: category I (13/17), IIA (32/36), IIB (2/2), III (1/3), and IV (6/6). In seven cases (three in category I, two in category IIA, and two in category III), additional genetic tests applied were able to find the causative mutation, when the initial testing strategy was not successful. For one patient in category I and two in category IIA, in whose no pathogenic mutation was found, no further molecular studies were performed. Among the positive cases, one patient in category IIB had his former clinical diagnosis changed through the molecular testing; two patients form categories IIA and III showed a milder phenotype, in contrast to the expected clinical findings in INPPL1 and HSPG2 osteochondrodysplasias. The molecular basis of three different osteochondrodysplasias (category IV) was unraveled by this study (genes PCYT1A, FN1 e LONP1). A re-analysis of the negative cases allowed the identification of another patient harboring mutation in FN1. Novel variants were found in previously known genes: COL2A1, COL11A1, CHST3, SLC26A2, HSPG2, ACAN, TRPV4, COMP, SMARCAL1, INPPL1, NPR2, LIFR, and CANT1. CONCLUSIONS: The present study showed that a well-elaborated clinical-radiological characterization allows greater correspondence with the molecular testing. In some cases, phenotypic overlap prevented the definitive diagnosis from being established only by clinical-radiological criteria, requiring the use of additional molecular tests for the correct diagnosis, and consequently, a more accurate genetic counseling. The clinical-radiographic, as well as the molecular findings, contributed to expand the clinical phenotype in certain groups, especially the variants found in patients with HSPG2 and INPPL1 osteochondrodysplasias, besides unraveling the molecular basis of three osteochondrodysplasias

Introdução: Pearlman e colaboradores relacionou a presença de mutações ativadoras no gene MAP3K1 com o desenvolvimento testicular anormal em pacientes com disgenesia gonadal 46,XY familial, embora os estudos em camundongos tenham demonstrado que o gene Map3k1 não é essencial para a determinação testicular. No desenvolvimento gonadal masculino, a ligação do MAP3K1 à proteína RHOA promove uma fosforilação normal de p38 e ERK1/2, o que determina um bloqueio da via da beta-catenina pela MAP3K4. Já no desenvolvimento feminino, ocorre uma hiper fosforilação de p38 e ERK1/2, o que determina a ativação da via da beta-catenina e o bloqueio da via de retroalimentação positiva do SOX9 e o desenvolvimento testicular. Objetivos: Pesquisar a presença de variantes alélicas do gene MAP3K1 em pacientes portadores de distúrbios do desenvolvimento sexual (1) 46,XY por anormalidades do desenvolvimento gonadal e avaliar a repercussão funcional das variantes identificadas. Casuística e Métodos: Quarenta e sete pacientes com disgenesia gonadal 46,XY (17 com a forma completa e 29 com a forma parcial) e uma paciente com DDS 46,XY de causa etiológica não conhecida foram estudados. As regiões codificadoras do gene MAP3K1 foram amplificadas e sequenciadas pelo método de Sanger ou painel customizado de genes-alvo associados ao DDS. Estudo in vitro utilizando o método de detecção colorimétrica In-Cell ELISA com anticorpos específicos para detecção de ERK1/2 e AKT, fosforilado e não fosforilado foi realizado em fibroblastos obtidos por biópsia de pele e mantidos em cultura celular de 3 indivíduos portadores de variantes no MAP3K1. A quantificação da fosforilação de p38 e ERK por ensaio de citometria em células linfoblastóides mutadas foram realizados em amostras de 4 indivíduos portadores de variantes no MAP3K1 em estudo realizado em colaboração. Imunohistoquímica com anticorpos anti Caspase-3 foram realizadas em tecidos gonadais parafinados das pacientes portadoras de variantes alélicas nos genes MAP3K1 e FGFR2. Resultados: Vinte e uma variantes alélicas, sete das quais ainda não descritas na literatura, foram identificadas no gene MAP3K1. Quatro novas variantes alélicas exônicas e não sinônimas (p.Leu639Pro, p.Leu447Trp, p.Thr657Arg e p.Cys691Arg) foram identificadas em heterozigose; todas foram classificadas como deletérias para a proteína nos estudos de predição \"in silico\", não foram identificadas em indivíduos controles brasileiros estudados e não estão descritas nos bancos de dados populacionais. A variante p.Leu639Pro foi identificada em duas irmãs com disgenesia gonadal 46,XY portadoras da variante p.Ser453Leu no gene FGFR2 identificada previamente. A variante intrônica c.834+1G >T identificada em heterozigose foi classificada como deletéria à proteína na análise no site de predição para alteração de \"splicing\". Os ensaios colorimétricos para detecção de ERK1/2 e AKT, fosforilado e não fosforilado foram inconclusivos. Os estudos in vitro de avaliação dos níveis de fosforilação de p38 e ERK evidenciaram uma maior fosforilação nas culturas celulares mutantes para o MAP3K1 quando comparado com a linhagem celular selvagem, resultado estatisticamente significativo ( p < 0,001) e que corrobora com os dados publicados previamente. A imunohistoquímica com anticorpos anti Caspase-3 mostrou uma maior marcação em células germinativas nos tecidos gonadais das pacientes portadoras das variantes no MAP3K1 e FGFR2 do que no tecido testicular normal, porém marcações foram identificadas também em células germinativas de tecidos testiculares de indivíduos com DDS 46,XY de outras etiologias. Conclusões: Os achados sugerem fortemente a participação das mutações identificadas no MAP3K1 na etiologia dos distúrbios do desenvolvimento sexual dos pacientes estudados. Porém, uma melhor compreensão dos mecanismos de participação da via MAPK nas redes gênicas de regulação do processo de determinação testicular humano ainda é necessário / Introduction: Pearlman et al. associated the presence of activating mutations in MAP3K1 gene with abnormal testicular development in patients with familial 46,XY gonadal dysgenesis, although studies in mice have shown that the Map3k1 gene is not essential for testicular determination. In male gonadal development, the binding of MAP3K1 to the RHOA protein promotes a normal phosphorylation of p38 and ERK1/2, and a blockade of the beta- catenin pathway is determined by MAP3K4. In the female development, hyperphosphorylation of p38 and ERK1/2 occurs. p38 and ERK1/2 hyperphosphorylated determine the activation of the beta-catenin pathway, the blockade of the positive feedback pathway of SOX9 and the testicular development. Objectives: To investigate the presence of allelic variants of the MAP3K1 gene in patients with 46,XY disorders of sex development (DSD) due to abnormalities of gonadal development and to evaluate the functional repercussion of the identified variants. Patients and Methods: Forty-seven patients with 46,XY gonadal dysgenesis (17 patients with complete form and 29 with partial form) and one patient with 46,XY DSD of unknown cause were studied. The MAP3K1 coding regions were amplified and sequenced by Sanger method or by custom panel of target genes associated with DSD. In-Cell ELISA assay with specific antibodies for the detection of phosphorylated and non-phosphorylated ERK1/2 and AKT was performed on fibroblasts obtained by skin biopsy and kept in cell culture of 3 individuals with MAP3K1 variants. Quantification of p38 and ERK phosphorylation by cytometric assay on mutated lymphoblastoid cells were performed on samples from 4 subjects with MAP3K1 variants in a collaborative study. Immunohistochemistry with anti-Caspase-3 antibodies were performed on paraffinembedded gonadal tissues of patients with MAP3K1 and FGFR2 allelic variants. Results: Twenty-one allelic variants, seven of them have not yet been described in the literature, were identified in the MAP3K1. Four novel exonic and non-synonymous allelic variants (p.Leu639Pro, p.Leu447Trp, p.Thr657Arg and p.Cys691Arg) were identified in heterozygous state; all of them were classified as deleterious in silico prediction sites; they were not identified in Brazilian control subjects and they were not described in the human genetic variation databases. The p.Leu639Pro variant was identified in two sisters with 46,XY gonadal dysgenesis carrying the previously identified FGFR2 variant (p Ser453Leu). The intronic c.834+1G > T variant identified in heterozygous state was classified as deleterious in the prediction sites. Colorimetric assays for the detection of phosphorylated and nonphosphorylated ERK1/2 and AKT were not significant. In vitro studies to evaluate p38 and ERK phosphorylation levels evidenced increased phosphorylation in the MAP3K1 mutant cells when compared to the wild type cells line; a statistically significant result (p < 0.001) that confirmed previously published data. The immunohistochemistry study with anti-Caspase-3 antibodies showed that the gonadal tissues of patients with MAP3K1 and FGFR2 variants exhibited more apoptotic germ ceIls than normal testicular tissue, but stained germ cells were also identified in the testicular tissues of the 46,XY DSD controls.Conclusions: These findings strongly suggest the participation of MAP3K1 mutations in the etiology of the testicular abnormalities of the 46,XY DSD patients of this study. However, a better understanding of the mechanisms of MAPK pathway in the gene regulatory networks of the human testicular determination process is still necessary