A variação no número de cópias gênicas (CNVs) é a alteração estrutural mais prevalente no genoma humano. Estas alterações estão presentes em alta proporção nos subtelômeros, quando comparados com o resto do genoma. Isso ocorre principalmente porque essas regiões são ricas em genes e porque apresentam sequências repetitivas que as tornam suscetíveis a rearranjos genômicos. Na literatura os rearranjos subteloméricos, como deleções, duplicações e translocações estão associados à etiologia da deficiência intelectual (DI), do atraso no desenvolvimento neuropsicomotor (ADNPM) e das malformações congênitas (MC). Estudos prévios com pacientes com DI revelaram taxas de CNVs patogênicas em regiões subteloméricas variando de 2,4% a 4,8%. Os objetivos desse trabalho foram: investigar a presença das CNVs subteloméricas nos pacientes portadores de malformações congênitas e deficiência intelectual, caracteriza-las quanto a extensão e patogenicidade e sugerir os mecanismos produtores dessas alterações. Foram analisadas 105 amostras de DNA de pacientes com DI/ADNPM associada a MC. Utilizamos a técnica de MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) com kits específicos para regiões subteloméricas (P036 e P070). Dentre os pacientes que apresentaram alterações pela técnica de MLPA, 7 pacientes foram submetidos à técnica de array, utilizando as plataformas Agilent SurePrint G3 Genoma Humano microarray 180 K e HumanCytoSNP-12 BeadChip Illumina®. O MLPA permitiu identificar alterações subteloméricas em 14,28% dos casos, sendo 7 pacientes com uma deleção isolada, 7 pacientes apresentaram uma deleção concomitante a uma duplicação e um paciente apresentou duas duplicações. A análise por array confirmou as alterações encontradas por MLPA e permitiu a delimitação acurada dos pontos de quebra genômicos. A análise combinada utilizando bioinformática com diferentes ferramentas: DGV (Database of Genomic Variants), DECIPHER (Database of Chromosomal Imbalance and Phenotype in Humans Using Ensembl Resources), UCSC Genome Bioinformatics e DAVID (Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery), revelou um total de 8 genes sugestivos de serem responsáveis por fenótipos clínicos distintos. Dentre eles, o gene DIAPH1 foi relacionado à microcefalia, o gene CTNND2 à DI e o gene OTOS à surdez. O array revelou elementos repetitivos, sequências teloméricas e/ou STRs nas regiões próximas aos pontos de quebra estudados. Também nos permitiu inferir que os pontos de quebra com deleção simples são sugestivos de NHEJ ou MMEJ e os casos que apresentaram rearranjos complexos: FoSTeS ou MMBIR. A estratégia teve sucesso em identificar CNVs subteloméricas e associá-las ao fenótipo dos pacientes e, adicionalmente, possibilitou a sugestão dos mecanismos que as produziram / Copy number variation (CNV) is the most prevalent structural changes in the human genome. These changes are present in a high rate in subtelomere compared with the rest of the genome. This is primarily because these regions are gene rich and because of the presence of repetitive sequences that make them susceptible to genomic rearrangements. Subtelomeric rearrangements, such as deletions, duplications and translocations are associated with the etiology of intellectual disability (ID), the developmental delay (DD) and congenital malformations (CM). Previous studies with patients with ID have revealed rates of pathogenic CNVs in subtelomeric regions ranging from 2.4% to 4.8%. The objectives of this study were to investigate the presence of subtelomeric CNVs in patients with congenital malformations and intellectual disability, characterized them as the extent and pathogenicity and suggest mechanisms of formation. DNA samples from 105 patients with ID/DD associated with CM were analysed. We use the MLPA (Multiplex Ligationdependent Probe Amplification) technique with specific subtelomeric regions (P036 and P070) kits. Among patients with CNVs changes by MLPA, seven were submitted to array technique, using Agilent SurePrint G3 Human Genome microarray HumanCytoSNP or 180 K-12 BeadChip Illumina® platforms. The subtelomeric MLPA analysis identified alterations in 14.28% of cases, 7 patients presented an isolated deletion, 7 patients presented a concomitant deletion and duplication and 1 patient presented two duplications. The array analysis confirmed the alterations found by MLPA and allowed the accurate delineation of the genomic break points. The analysis combined with bioinformatics using different tools: DGV (Database of Genomic Variants), Decipher (Database of Chromosomal Imbalance and Phenotype in Humans Using Ensembl Resources), UCSC Genome Bioinformatics and DAVID (Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery), revealed a total of eight genes that are suggestible responsible for distinct clinical phenotypes. Among them, DIAPH1 gene was related to microcephaly, CTNND2 gene to ID and OTOS gene to deafness. Array revealed repetitive elements, telomeric sequences and / or STR close to breakpoints regions. We propose that the breakpoints with single deletions are suggestive of NHEJ or MMEJ and cases with complex rearrangements: FoSTeS or MMBIR. This strategy could identify subtelomeric CNVs, improve the genotype-phenotype association and also allowed the investigation of mechanisms for formation

Rearranjos genômicos são alterações estruturais na molécula de DNA e podem ser a causa de inúmeras doenças genéticas. O mecanismo gerador dessas alterações é bem variável. Ele pode ser recorrente, por intermédio de low copy repeats (LCRs), resultando num rearranjo causado por recombinação homóloga não-alélica (NAHR), ou não recorrente, ou seja, sem intermédio de um hotspot. Dentre os mecanismo não recorrentes temos: a junção das extremidades não-homólogas (NHEJ - non-homologous end joining) e a junção mediada por micro-homologia (MMEJ - microhomology-mediated end joining), a replicação em série por deslizamento (SRS), a SRS induzida por quebra (BISRS), a replicação induzida pela quebra de DNA por homologia (MMBIR - microhomology-mediated break induced replication), o enrolamento da forquilha de replicação e mudança de molde de DNA (FoSTeS - fork stalling and template switching). A análise dos pontos de quebra dos rearranjos genômicos pode fornecer informações importantes para uma maior compreensão da arquitetura genômica e seu papel na geração das anormalidades estruturais. O objetivo deste trabalho foi sequenciar os pontos de quebra genômicos a fim de identificar o mecanismo formador das alterações encontradas. Para isso, investigamos o panorama estrutural de 10 pacientes por sequenciamento por meio de linked reads (10X Genomics) e sequenciamos os pontos de quebra previamente identificados por array CytoSNP-12 (Illumina) de 12 pacientes com rearranjos genômicos estruturais por utilizando a captura por Nextera Rapid Capture (Illumina). A investigação por linked reads revelou rearranjos estruturais em 5 pacientes, destacando translocações encontradas em dois pacientes, impossíveis de serem detectadas por metodologias de sequenciamento que não envolva long reads. Foi possível sugerir os mecanismos causadores dessas alterações como NHEJ. O sequenciamento após a captura por Nextera foi capaz de identificar elementos que permitiram definir o mecanismo em três pacientes (NAHR E FoSTeS/MMBIR) e sugerir em mais dois pacientes (NHEJ). Com a estratégia utilizada foi possível sequenciar pontos de quebra por meio do flanqueamento das regiões identificadas por array, identificar os elementos genômicos presentes nos pontos de quebra e os mecanismos formadores dessas alterações / Genomic rearrangements are structural changes in the DNA molecule and can be the cause of numerous genetic diseases. The mechanisms that generate these alterations can occur in different ways. It can be recurrent, mediated by low copy repeats (LCRs), resulting in a rearrangement cause by non-alellic homologue recombination (NAHR), or non-recurrent, without a hotspot. Among non-recurrent mechanisms there are: non-homologous end joining (NHEJ), microhomology-mediated end joining (MMEJ), serial replication slippage (SRS), break-induced serial replication slippage (BISRS), microhomology-mediated break induced replication (MMBIR) and fork stalling and template switching (FoSTeS). Analysis of the breakpoints of genomic rearrangements may provide important information for a better understanding of genomic architecture and its role in generating structural abnormalities. The aim of this work was to sequence the genomic breakpoints in order to identify the mechanism that formed the alterations found. To do this, we investigated the genomic structure of 10 patients by linked reads (10X Genomics) sequencing and sequenced the breakpoints previously identified by Illumina CytoSNP-12 array of 12 patients with structural genomic imbalances by using Nextera Rapid Capture (Illumina). The research by linked reads revealed structural rearrangements in 5 patients, highlighting translocations found in two patients, impossible to be detected by sequencing methodologies that did not involve long reads. It was possible to suggest the mechanisms causing these changes as NHEJ. The sequencing after capture by Nextera was able to identify elements that allowed us to determine the formation mechanism in three patients (NAHR and FoSTeS / MMBIR) and to suggest in two patients (NHEJ). With the approach employed here, it was possible to sequencing breakpoints by flanking the regions identified by array, identifying the genomic elements present at breakpoints and the formation mechanisms of the alterations

O gene SPARC (secreted protein, acidic, cysteine-rich; também denominado de Osteonectina; BM-40) codifica uma proteína de 42kDa, membro de uma família de proteínas matricelular, que interagem com receptores de superfície celular, fatores de crescimento e componentes da matriz extracelular (ECM). SPARC desempenha importante papel no remodelamento de tecidos, migração celular, angiogênese, desenvolvimento embrionário, tumorigênese e quimiosensibilidade. O Docetaxel é um agente anti-microtúbulo pertencente à classe do taxanos, sendo utilizado como uma droga quimioterápica eficaz para o tratamento do câncer da mama avançado. No entanto, é considerável o número de pacientes que não respondem ou adquirem resistência ao tratamento com os taxanos. Os mecanismos envolvidos na resistência ao docetaxel ainda não estão completamente estabelecidos. Em um estudo prévio de nosso grupo, identificamos os transcritos do gene SPARC como diferencialmente expressos em células epiteliais mamárias expressando diferentes níveis de HER-2. No presente estudo, nós avaliamos o efeito da expressão do SPARC na sensibilidade de células de câncer de mama ao Docetaxel. As células MCF-7 foram transfectadas com o vetor de expressão pCMV6-SPARC ou pCMV6-Neo. PCR em tempo real, western blot e imunofluorescência foram utilizados para caracterizar os clones de células com expressão de SPARC. A taxa proliferativa não foi alterada de forma significativa pela expressão de SPARC. No entanto, observou-se um aumento da sensibilidade ao docetaxel em células MCF7 expressando SPARC em comparação com as células MCF7 controle sem expressão de SPARC, indicando que a expressão de SPARC tem propriedades de aumentar a quimiosensibilidade em células de câncer de mama. Utilizamos a técnica de cDNA microarray, para avaliar o perfil de expressão de células MCF7 com expressão de SPARC em comparação com células MCF7 sem expressão de SPARC antes e após tratamento com docetaxel 5nM e 100nM por 24h. Identificamos diversos genes potencialmente envolvidos na quimiosensibilidade ao docetaxel mediada por SPARC. Setenta genes mais diferencialmente expressos (expressão aumentada ou reduzida) foram selecionados a partir dos diferentes tratamentos e várias redes moleculares foram identificadas utilizando o Ingenuity Pathway Analysis (IPA). Após anotação gênica seis genes, SPANXA1, ALDH1A3, TPM4, TARP, XAF1, e WNT5A foram selecionados e validados por qPCR. Utilizando análise proteômica quantitativa livre de marcação avaliamos ainda a ocorrência de alterações proteômicas na comparação das células MCF-7 com super-expressão de SPARC antes e após tratamento com docetaxel. Entre as redes de interação molecular, a via de remodelamento de citoesqueleto foi a via mais abundante observada na comparação entre as células MCF-7 com expressão de SPARC e as células controle sem expressão de SPARC antes do tratamento com docetaxel; e a via do metabolismo de GTP foi a via mais abundante observada na comparação entre as células MCF7 com expressão de SPARC e as células controle sem expressão de SPARC após tratamento com docetaxel. Na integração dos dados de transcriptoma e proteoma identificamos quarenta genes diferencialmente expressos pelas duas abordagens, sendo a via WNT representada entre eles. Nossos resultados sugerem que a expressão SPARC pode influenciar a quimiosensibilidade ao Docetaxel em células MCF-7, modulando genes envolvidos em diversos processos biológicos que podem estar relacionados com a sensibilidade a drogas / The SPARC (secreted protein, acidic, cysteine-rich) gene encodes a 42kDa protein that belongs to a family of matricellular proteins, which interact with cell-surface receptors, growth factors and the ECM (extracellular matrix) components. SPARC plays a role in tissue remodeling, cell migration, angiogenesis, embryonic development, tumorigenesis and chemiosensitivity. Docetaxel, which is an antimicrotubulin agent, is an effective chemotherapeutic drug for the treatment of advanced breast cancer. However, a considerable proportion of breast cancer patients do not respond positively to docetaxel. The mechanisms of docetaxel resistance are poorly understood. In a previous study, we identified SPARC as differentially expressed in mammary epithelial cells expressing different levels of HER-2. In the present study, we evaluate the effects of SPARC over-expression on the sensitivity of breast cancer cells to docetaxel. MCF7 cells were transfected with the expression vector pCMV6-SPARC or pCMV6-Neo. Real time PCR, western blot and immunofluorescence were used to characterize the clones over-expressing SPARC. Proliferation was not significantly affected by SPARC over-expression. However, we observed an increased sensitivity to docetaxel when comparing the MCF7 control cells with the MCF7 cells overexpressing SPARC, indicating that SPARC expression has chemosensitive properties in breast cancer cells. We used cDNA microarray to evaluate the expression profile of MCF7 cells with SPARC overexpression in comparison with MCF7 control cells before and after docetaxel treatment for 24h.We have identified several differentially expressed genes potentially involved in SPARC-mediated chemosensibility to docetaxel. Seventy of the highly expressed genes were selected from all treatments and several molecular networks were identified using the Ingenuity Pathway Analysis (IPA). After manual annotation, six genes, SPANXA1, ALDH1A3, TPM4, TARP, XAF1, and WNT5A, potentially associated with SPARC mediated chemiosensitivity were selected and validated by qPCR. Using label-free approach for quantitative proteomic analysis, we further evaluated the proteomic changes in the comparison of the MCF7 cells control and over-expressing SPARC before and after docetaxel treatment. Among the molecular interaction networks, cytoskeleton remodeling pathway was the top pathway map observed in the comparison between MCF7 cells over-expressing SPARC and the control cells before docetaxel treatment and GTP metabolism pathway was the top pathway map observed in the comparison between MCF7 cells over-expressing SPARC and the control cells after docetaxel treatment. Transcriptome and proteome integrated data, resulted in forty commonly up and down regulated genes, being the WNT pathway represented among them. Our findings suggest that SPARC expression can influence Docetaxel sensitivity in MCF7 cells by modulating genes involved in diverse biologic process that might be related to drug sensitivity

A síndrome de Bloom (SB) é uma síndrome de instabilidade cromossômica rara, transmitida por herança autossômica recessiva. Caracteriza-se por deficiência de crescimento pré e pós-natal, microcefalia, hipoplasia malar, eritema telangiectásico em face e comprometimento do sistema imunológico, entre outras manifestações clínicas. Os pacientes com SB apresentam predisposição aumentada para o desenvolvimento de neoplasias em idade precoce, sendo esta, a principal causa de óbito. Ao estudo citogenético observa-se aumento de quebras cromossômicas espontâneas e trocas entre cromátides irmãs (TCI), que são utilizadas como marcador diagnóstico para a SB. Além disso, a literatura mostra que a maioria dos pacientes também apresenta mutações no gene BLM, que estão relacionadas a defeitos no mecanismo de reparo do DNA. No entanto, os mecanismos fisiopatológicos não são completamente compreendidos. Nesse sentido estudamos o transcriptoma de duas pacientes portadoras da síndrome de Bloom e de três controles utilizando a metodologia RNA-seq (Illumina, Inc., San Diego, CA). A análise de expressão diferencial revelou 216 genes diferencialmente expressos relacionados a vias relacionadas à resposta imune como replicação negativa da regulação da replicação do genoma viral, regulação positiva da proliferação de células B, via de sinalização mediada por interferon gama, ativação de células B, resposta a vírus, resposta imune adaptativa e processo efetor imune, e nenhuma diferença da expressão em genes de reparo de DNA. Concomitantemente, observamos a hiperexpressão do gene BLM para ambas as pacientes, contribuindo para a desestabilização de genes envolvidos em vias imunológicas, fenômeno também observado em alguns tumores. Dessa forma, sugerimos que a combinação de defeitos de proliferação linfocitária e defeitos de sinalização celular somados a outros, como perda celular e expressão alterada do gene BLM, podem contribuir diretamente para as principais características observadas na síndrome de Bloom, como a deficiência de crescimento e o elevado risco de câncer. Futuramente, o estudo do transcriptoma, aplicado a outros portadores da SB e outras síndromes de instabilidade, possibilitará uma análise mais acurada das interações gênicas relevantes para a desestabilização do genoma / Bloom Syndrome (BS) is a rare chromosome instability syndrome, with recessive autosomal inheritance. The main clinical manifestations are pre and postnatal growth deficiency, microcephaly, malar hypoplasia, telangiectasic facial erythema and compromised immune system, among others. Patients with BS present increased risk to the development of neoplasias at an early age, which is the main cause of death. Cytogenetic test is used as a diagnostic marker for BS since the patient\'s cells present increase in spontaneous chromosomal breaks and sister chromatid exchange (SCE). In addition, the literature reveals that most patients also present mutations in the BLM gene, which are related to defects in the DNA repair mechanism; however, it is still not completely understood. In this sense, we studied the transcriptome of two patients with Bloom\'s syndrome and three controls using the RNA-seq methodology (Illumina, Inc., San Diego, CA). Differential expression analysis revealed 216 differentially expressed genes related to immunological pathways such as: negative replication of the regulation of the viral genome replication, positive regulation of B cells proliferation, gama-interferon mediated signalization pathway, B cells activation, virus response, adaptive immune response and immune effector process, and absence of difference of DNA repair genes expression. At the same time, we observed the hyperexpression of the BLM gene for both patients contributing for the destabilization of genes involved in immunological pathways, a phenomenon also observed in some tumors. Thus, we suggest that the combination of lymphoid proliferation defects and cell signaling defects added to others such as cell loss and altered expression of the BLM gene may contribute directly to the main characteristics observed in Bloom\'s syndrome, such as growth failure and high risk of cancer. In the future, the study of the transcriptome applied to other BS carriers and other instability syndromes, will allow a more accurate analysis of the relevant gene interactions to the destabilization of the genome

A Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) é a doença neurodegenerativa do neurônio motor que acomete indivíduos adultos e promove a perda progressiva das funções motoras. A evolução é rápida (2 a 5 anos) e culmina na morte por complicações e falência dos músculos respiratórios. Descrições recentes sugerem a contribuição de tipos celulares não neuronais, particularmente o astrócito e a microglia, para a morte do neurônio motor. O camundongo transgênico SOD1G93A, que carrega a SOD1 humana mutada, foi utilizado neste trabalho. Estudos comportamentais apontaram alterações motoras importantes no animal transgênico a partir de 90 dias de vida e permitiram selecionar, então, as idades pré-sintomáticas de 40 dias e 80 dias para os estudos moleculares. A análise da expressão gênica nos animais transgênicos e selvagens destas duas idades foi realizada por microarray utilizando-se a plataforma que contém o genoma completo do camundongo e detectou 492 e 1105 transcritos diferencialmente expressos nos animais de 40 e 80 dias, respectivamente. Estes resultados foram validados por PCR quantitativa (qPCR). As análises bioinformáticas dos resultados identificaram 17 e 11 vias moleculares super-representadas nas idades de 40 dias e 80 dias, respectivamente. Destas, as vias endocitose, sinapse glutamatérgica, proteólise mediada por ubiquitina, via de sinalização de quimiocina, fosforilação oxidativa, processamento e apresentação de antígeno e junção oclusiva foram comuns a ambas as idades. Ainda, as vias sinapse glutamatérgica e fagossomo foram sugeridas como potencialmente mais importantes em animais transgênicos de 40 dias e 80 dias, respectivamente. Transcritos específicos foram analisados em amostras enriquecidas de células (astrócito, microglia e neurônio motor) microdissecadas a laser do corno anterior da medula espinal dos animais. Os transcritos Cxcr4, Slc1a2 e Ube2i foram avaliados por qPCR nas amostras enriquecidas de astrócitos dos animais de 40 dias, enquanto que Cxcr4 e Slc17a6 foram avaliados nas amostras de neurônios motores dos animais desta idade. Cxcr4 apresentou expressão diminuída nos astrócitos transgênicos e aumentada nos neurônios destes animais. Slc1a2, Ube2i e Slc17a6 estavam aumentados nos tipos celulares estudados nos animais transgênicos. Tap2 e Tuba1a foram avaliados nas amostras enriquecidas de microglias dos animais de 80 dias e mostraram-se aumentados nas amostras dos transgênicos. Finalmente, Akt1 apresentou expressão diminuída nos neurônios motores microdissecados dos animais transgênicos em comparação aos selvagens. Os resultados sugerem que alterações na sinalização glutamatérgica podem exercer papel essencial em fases pré-sintomáticas mais precoces da doença (40 dias), enquanto que em fases pré-clínicas mais próximas ao aparecimento dos sintomas (80 dias), as respostas mais importantes parecem estar relacionadas à neuroimmunomodulação. Dessa forma, este trabalho aponta para novas perspectivas para o estudo da ELA / Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) is an adult onset motor neuron neurodegenerative disease that leads to the progressive loss of muscular functions. It is a fast progression disorder (2 to 5 years) culminating in death by respiratory failure. Recent findings suggest that non neuronal cell types, especially astrocytes and microglia, might contribute to the neuronal death. The transgenic mouse SOD1G93A, carring human mutant SOD1, was used in this study. Behavioral studies pointed to the onset of the clinical symptoms occurring at 90 days in the animal model, thus, allowing the selection of the pre-symptomatic ages of 40 and 80 days to the molecular studies. Gene expression analysis of transgenic mice and their non-transgenic littermates at those ages was performed by using a microarray platform containing the whole mouse genome and has detected 492 and 1105 differentially expressed genes at 40 days and 80 days old mice, respectively. These results were validated by quantitative PCR (qPCR). Bioinformatic analysis of the results identified 17 and 11 over-represented molecular pathways at 40 days and 80 days, respectively. Of these, endocytosis, glutamatergic synapse, ubiquitin-mediated proteolysis, chemokine signaling pathway, oxidative phosphorylation, antigen processing and presentation and also tight junction were common to both ages. Furthermore, glutamatergic synapse and fagosome were suggested as potentially more important at 40 and 80 days, respectively. Specific transcripts were analyzed on enriched samples of cells (astrocytes, microglia and motor neuron) obtained by laser microdissection from the ventral horn of mouse spinal cord. The transcripts Cxcr4, Slc1a2 and Ube2i were evaluated by qPCR in enriched samples of astrocytes of the 40 days old mice, and Cxcr4 and Slc17a6 were analyzed in motor neuron samples at this age. Cxcr4 has been found decreased in astrocytes from transgenic mice and increased in the motor neurons of these animals. Slc1a2, Ube2i and Slc17a6 have increased in the cell type in which they were evaluated in the transgenic mice. Tap2 and Tuba1a were evaluated at microglia enriched samples of 80 days old mice and were found to be increased. Finally, Akt1 has decreased in enriched samples of motor neurons from 80 days old mice. The results suggest that glutamatergic signaling might play essential role in early stages of the disease (40 days), while in phases closer to the appearance of the symptoms (80 days), the neuroimmunomodulation takes place. Thus, this study points to new perspectives for ALS study

Aeromonas spp. são bastonetes Gram negativos amplamente distribuídos nos ambientes aquáticos, com relatos de isolamento em água de abastecimento público e alimentos. Este micro-organismo possui potencial de causar doenças intestinais e extraintestinais cuja patogenicidade está associada a sua virulência multifatorial. Diversos determinantes de virulência de Aeromonas já foram identificados, incluindo sistemas de secreção de proteínas. O sistema de secreção tipo VI (SST6) é o mais recente sistema de secreção de proteínas identificado em bactérias cuja presença em estirpes no gênero Aeromonas pode implicar atividades de citotoxicidade para o hospedeiro, pois esse sistema é capaz de injetar moléculas efetoras dentro da célula, interferindo diretamente nos processos celulares. A fim de determinar a presença e analisar a distribuição dos genes hcp e vgrG codificadores das proteínas efetoras do SST6 em Aeromonas spp. o presente estudo examinou 119 cepas isoladas de diversas origens pela técnica da PCR após o desenho de oligonucleotídeos iniciadores específicos. Objetivamos ainda analisar a variabilidade genética interespecífica dos genes hcp e vgrG a partir de dados de sequenciamento. Os resultados obtidos indicaram a distribuição dos genes vgrG e hcp em 46% das cepas de Aeromonas hydrophila e Aeromonas caviae de diferentes origens. Entre as cepas de A. hydrophila a maior frequência foi observada nas cepas isoladas de humanos, onde todas foram positivas para os iniciadores que amplificaram um produto de 541 pb do gene vgrG e 418 pb do gene hcp. Entre as cepas de A. caviae, a incidência de genes vgrG e hcp foi mais elevada nas cepas isoladas de alface (60%) e peixes (50%). As cepas analisadas de origem ambiental apresentaram índice total de 36% de positividade, apresentando frequência de 60% e 22% em A. hydrophila e A. caviae, respectivamente. Os dados obtidos da análise de cepas de origem alimentar mostraram a presença dos genes vgrG e hcp em 67% (A. hydrophila) e 60% (A. caviae) das cepas isoladas de folhas de alface. Nas cepas isoladas de queijo os genes foram encontrados em 67% e 12,5% das cepas de A. hydrophila e de A. caviae, respectivamente. O alinhamento múltiplo entre as sequências dos segmentos dos genes hcp e vgrG obtidas no sequenciamento indicou grau de identidade nucleotídica de 75 a 100% entre as sequências de hcp e 80 a 100% entre as sequências de vgrG. Em conclusão, nossos resultados indicaram que os iniciadores desenhados foram capazes de detectar suas sequências alvo em cepas de A. caviae e outras espécies de Aeromonas, sugerindo a existência de homologia entre os genes nas diferentes espécies, confirmada após sequenciamento de DNA. Os dados indicaram que esses genes estão distribuídos em várias espécies de Aeromonas e em cepas isoladas de diversas fontes. Ressaltamos a prevalência de cepas de A. hydrophila PCR-positivas em isolados clínicos, sugerindo a participação do SST6 no complexo universo da virulência multifatorial que permeia esse micro-organismo / Aeromonas species are Gram negative bacilli distributed widely in aquatic environments, with reports of isolation of this microorganism in water for public supply and food. Aeromonas have the potential to cause intestinal and extra intestinal infections whose pathogenicity is associated with multifactorial virulence. A number of virulence determinants have already been identified in Aeromonas, including protein secretion systems. The type VI secretion system (T6SS) is the most recent pathway to secrete proteins identified in bacteria. The presence of T6SS in Aeromonas strains may involve activities of cytotoxicity to the host, since this system is capable of injecting effectors molecules into the cell, interfering directly with a variety of cellular processes. The present study examined 119 strains of different origins by PCR, after the design of specific primers, to determine the distribution of vgrG and hcp genes encoding the effector proteins of T6SS in Aeromonas spp. We aimed to further analyze the interspecific sequence variation of hcp and vgrG genes based on sequencing data. The results show the presence of hcp and vgrG genes in 46% of A. hydrophila and A. caviae strains from different sources. All A. hydrophila strains isolated from humans were positive for the primers used to amplify a product of 541 bp and 418 bp of vgrG and hcp genes, respectively. Among A. caviae strains, the incidence of hcp and vgrG genes was high in the strains isolated from lettuce (60%) and fish (50%). The overall PCR-positive rate of strains from environmental source was 36%, with a frequency of 60% and 22% in A. hydrophila and A. caviae, respectively. The data obtained from analysis of food-borne strains showed the presence of hcp and vgrG genes in 67% (A. hydrophila) and 60% (A. caviae) of strains isolated from lettuce, while in the strains isolated from cheese the frequency was 67% (A. hydrophila) and 12.5% (A. caviae). The multiple alignment of hcp and vgrG sequences obtained revealed nucleotide identity rate between 75-100% among the hcp sequences and 80-100% in vgrG sequences. In conclusion, our results indicate that the primers designed were able to detect their target sequences in strains of A. caviae and other Aeromonas species, suggesting the existence of homology between genes in different species, as confirmed after DNA sequencing. The data indicate that these genes are distributed in various Aeromonas species from different sources. We emphasize the prevalence of PCR-positive A. hydrophila strains in clinical samples suggesting the involvement of T6SS in the complex universe of multifactorial virulence, which permeates this microorganism

O Hespesvírus 8 humano (HHV-8) é hiperendêmico na população indígena, mas os seus mecanismos de transmissão ainda são desconhecidos. Método: Os anticorpos contra o antígeno LANA e lítico do HHV-8 foram detectados por imunofluorescência, em 339 indígenas e 181 não-indígenas da Amazônia brasileira. Marcadores sorológicos de transmissão oro-fecal (hepatite A), parenteral (hepatites B e C) e sexual (herpes simples 2 e sífilis) foram detectados por Elisa específicos. O DNA do HHV-8, extraído da saliva, foi detectado por nested-PCR e sequenciado. Resultados: Os anticorpos contra o antígeno LANA ou lítico foram detectados em 79,1% nos indígenas e 6,1% nos não-indígenas. A soroprevalência do HHV-8 aumentou com a idade entre os indígenas sendo que as crianças já apresentavam alta prevalência, mas não houve diferença com relação ao sexo em nenhuma das populações. As populações indígenas e nãoindígenas não apresentaram diferenças na soroprevalência para os marcadores de transmissão oro-fecal e parenteral, entretanto a soroprevalência de marcadores de transmissão sexual foi menor entre os indígenas. O DNA do HHV-8 na saliva foi detectado em 23 % dos indígenas soropositivos. A detecção de DNA do HHV-8 diminuiu com a idade e foi mais comum em homens. As amostras positivas foram sequenciadas e agrupadas como subtipo E. Conclusão: Os dados sugerem a hipótese de transmissão horizontal e precoce, via saliva, do subtipo E do HHV- 8 na população indígena. / Human herpes virus type 8 (HHV-8) is hyperendemic in Amerindian populations, but its modes of transmission are unknown. Objectives: 1. Study the Human Herpesvirus-8 Infection and Oral Shedding in Amerindian and Non-Amerindian Populations in the Brazilian Amazon Region. 2. Methods: Antibodies against either HHV-8 latency-associated nuclear antigen (LANA) or HHV-8 lytic antigen were detected, by immunofluorescence assays, in 339 Amerindians and 181 non-Amerindians from the Brazilian Amazon. Serological markers of oro-fecal (hepatitis A), parenteral (hepatitis B and C), and sexual (herpes simplex virus type 2 and syphilis) transmission were measured by specific ELISA. Salivary HHV-8 DNA was detected by use of a nested polymerase chain reaction assay and was sequenced. Results: Antibodies against either LANA antigen or lytic were detected in 79.1% of Amerindians and in 6.1% of non-Amerindians. HHV-8 seroprevalence increased with age among Amerindians and already had high prevalence in childhood but was not sex specific in either population. The 2 populations did not differ in seroprevalence of oro-fecal or parenteral markers, but seroprevalence of markers of sexual transmission was lower among Amerindians. HHV-8 DNA in saliva was detected in 23 % of HHV-8 seropositive Amerindians. Detection of HHV-8 decreased with age and was more common in men. HHV-8 DNA samples were sequenced, and all clustered as subtype E. Conclusion: The data support the hypothesis of early acquisition and horizontal transmission, via saliva, of HHV-8 subtype E in Amerindian populations.

A variação no número de cópias gênicas (CNVs) é a alteração estrutural mais prevalente no genoma humano. Estas alterações estão presentes em alta proporção nos subtelômeros, quando comparados com o resto do genoma. Isso ocorre principalmente porque essas regiões são ricas em genes e porque apresentam sequências repetitivas que as tornam suscetíveis a rearranjos genômicos. Na literatura os rearranjos subteloméricos, como deleções, duplicações e translocações estão associados à etiologia da deficiência intelectual (DI), do atraso no desenvolvimento neuropsicomotor (ADNPM) e das malformações congênitas (MC). Estudos prévios com pacientes com DI revelaram taxas de CNVs patogênicas em regiões subteloméricas variando de 2,4% a 4,8%. Os objetivos desse trabalho foram: investigar a presença das CNVs subteloméricas nos pacientes portadores de malformações congênitas e deficiência intelectual, caracteriza-las quanto a extensão e patogenicidade e sugerir os mecanismos produtores dessas alterações. Foram analisadas 105 amostras de DNA de pacientes com DI/ADNPM associada a MC. Utilizamos a técnica de MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) com kits específicos para regiões subteloméricas (P036 e P070). Dentre os pacientes que apresentaram alterações pela técnica de MLPA, 7 pacientes foram submetidos à técnica de array, utilizando as plataformas Agilent SurePrint G3 Genoma Humano microarray 180 K e HumanCytoSNP-12 BeadChip Illumina®. O MLPA permitiu identificar alterações subteloméricas em 14,28% dos casos, sendo 7 pacientes com uma deleção isolada, 7 pacientes apresentaram uma deleção concomitante a uma duplicação e um paciente apresentou duas duplicações. A análise por array confirmou as alterações encontradas por MLPA e permitiu a delimitação acurada dos pontos de quebra genômicos. A análise combinada utilizando bioinformática com diferentes ferramentas: DGV (Database of Genomic Variants), DECIPHER (Database of Chromosomal Imbalance and Phenotype in Humans Using Ensembl Resources), UCSC Genome Bioinformatics e DAVID (Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery), revelou um total de 8 genes sugestivos de serem responsáveis por fenótipos clínicos distintos. Dentre eles, o gene DIAPH1 foi relacionado à microcefalia, o gene CTNND2 à DI e o gene OTOS à surdez. O array revelou elementos repetitivos, sequências teloméricas e/ou STRs nas regiões próximas aos pontos de quebra estudados. Também nos permitiu inferir que os pontos de quebra com deleção simples são sugestivos de NHEJ ou MMEJ e os casos que apresentaram rearranjos complexos: FoSTeS ou MMBIR. A estratégia teve sucesso em identificar CNVs subteloméricas e associá-las ao fenótipo dos pacientes e, adicionalmente, possibilitou a sugestão dos mecanismos que as produziram / Copy number variation (CNV) is the most prevalent structural changes in the human genome. These changes are present in a high rate in subtelomere compared with the rest of the genome. This is primarily because these regions are gene rich and because of the presence of repetitive sequences that make them susceptible to genomic rearrangements. Subtelomeric rearrangements, such as deletions, duplications and translocations are associated with the etiology of intellectual disability (ID), the developmental delay (DD) and congenital malformations (CM). Previous studies with patients with ID have revealed rates of pathogenic CNVs in subtelomeric regions ranging from 2.4% to 4.8%. The objectives of this study were to investigate the presence of subtelomeric CNVs in patients with congenital malformations and intellectual disability, characterized them as the extent and pathogenicity and suggest mechanisms of formation. DNA samples from 105 patients with ID/DD associated with CM were analysed. We use the MLPA (Multiplex Ligationdependent Probe Amplification) technique with specific subtelomeric regions (P036 and P070) kits. Among patients with CNVs changes by MLPA, seven were submitted to array technique, using Agilent SurePrint G3 Human Genome microarray HumanCytoSNP or 180 K-12 BeadChip Illumina® platforms. The subtelomeric MLPA analysis identified alterations in 14.28% of cases, 7 patients presented an isolated deletion, 7 patients presented a concomitant deletion and duplication and 1 patient presented two duplications. The array analysis confirmed the alterations found by MLPA and allowed the accurate delineation of the genomic break points. The analysis combined with bioinformatics using different tools: DGV (Database of Genomic Variants), Decipher (Database of Chromosomal Imbalance and Phenotype in Humans Using Ensembl Resources), UCSC Genome Bioinformatics and DAVID (Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery), revealed a total of eight genes that are suggestible responsible for distinct clinical phenotypes. Among them, DIAPH1 gene was related to microcephaly, CTNND2 gene to ID and OTOS gene to deafness. Array revealed repetitive elements, telomeric sequences and / or STR close to breakpoints regions. We propose that the breakpoints with single deletions are suggestive of NHEJ or MMEJ and cases with complex rearrangements: FoSTeS or MMBIR. This strategy could identify subtelomeric CNVs, improve the genotype-phenotype association and also allowed the investigation of mechanisms for formation

INTRODUÇÃO: Na última década surgiu uma nova técnica, o sequenciamento de nova geração, que, contrário ao método tradicional de Sanger, permite o sequenciamento em paralelo e em larga escala de múltiplos genes, ou até mesmo todos os genes humanos, a menor custo e com uma análise mais acelerada. Essa técnica possibilitou a descoberta de novos genes responsáveis por diversas doenças mendelianas, sendo rapidamente incorporada no contexto clínico. OBJETIVOS: comparar os resultados das técnicas de Sanger e sequenciamento de nova geração em amostras controle; introduzir a técnica de sequenciamento de nova geração no contexto clínico nas casuísticas de doenças ósseas genéticas e RASopatias; avaliar a sensibilidade diagnóstica desta técnica em amostras sem dados clínicos fornecidos. MÉTODOS: o sequenciamento de nova geração (sob a forma de um painel de genes customizado ou do exoma) foi realizado em amostras com mutações identificadas previamente por Sanger e em dois grupos de doenças mendelianas, 144 pacientes com doenças ósseas e 79 com RASopatias, além de 90 amostras sem dados clínicos conhecidos (45 casos e 45 controles). A técnica de Sanger foi aplicada em 29 amostras de doenças ósseas e em 81 amostras para confirmação de variantes identificadas pelo sequenciamento de nova geração. RESULTADOS: A sensibilidade da técnica de sequenciamento de nova geração foi estimada em 95,92% e a especificidade em 98,77%. Na casuística de doenças ósseas, a sensibilidade diagnóstica das amostras sequenciadas por Sanger foi de 69% (20/29), por painel customizado, 60% (75/125) e por exoma, 63% (12/19). Na casuística de RASopatias, a sensibilidade diagnóstica através do exoma foi de 46% (36/79). Como resultado deste trabalho, dois genes novos associados a RASopatias (LZTR1 e SOS2) e um associado a uma displasia esquelética (PCYT1A) foram identificados. Na análise das amostras sem conhecimento prévio da hipótese clínica foi obtida uma sensibilidade diagnóstica de 46,67% (21/45), mas que chegou a 73,08% (14/26) para as hipóteses de erros inatos do metabolismo. CONCLUSÕES: Foi demonstrado que a sensibilidade e a especificidade da técnica do sequenciamento de nova geração são altas e correspondentes a valores encontrados por outros grupos na literatura. Essa técnica foi considerada apropriada não apenas no contexto de pesquisa, demonstrado aqui pela descoberta de três novos genes associados a doenças mendelianas, como também para análises clínicas. Neste estudo a técnica foi aplicada com sucesso no contexto clínico, seja pelo painel customizado, seja pelo exoma, com uma positividade semelhante à encontrada pela técnica de Sanger. Mesmo na análise de amostras sem história clínica prévia foi possível identificar variantes patogênicas em quase metade dos casos, e numa porcentagem ainda maior quando a doença era um erro inato do metabolismo. Essa sensibilidade é comparável à obtida pela espectroscopia de massas em Tandem aplicada à triagem de múltiplas condições simultaneamente, o que sugere que a técnica do sequenciamento de nova geração poderá ser incorporada ao programa de triagem neonatal no futuro, ampliando o emprego de testes genéticos em complementaridade aos testes bioquímicos tradicionais / INTRODUCTION: In the last decade a new technique, the next generation sequencing, has emerged, which, contrary to the traditional Sanger method, performs parallel and high-throughput sequencing of multiple genes, or even all human genes, at a lower cost and with a faster analysis. This technique allowed the discovery of new genes responsible for several Mendelian diseases and has been quickly incorporated into the clinical context. OBJECTIVES: to compare the results of Sanger technique and next generation sequencing in control samples; to apply the next generation sequencing technique in the clinical practice to the cases of genetic skeletal disorders and RASopathies; to evaluate the diagnostic yield of this technique in samples without clinical data provided. METHODS: Next generation sequencing (in the form of a customized gene panel or exome) was performed in samples with mutations previously identified by Sanger sequencing and in two groups of Mendelian diseases, 144 patients with skeletal disorders and 79 patients with RASopathies, besides 90 samples with unknown clinical data (45 cases and 45 controls). The Sanger technique was applied in 29 samples of skeletal disorders and in 81 samples for confirmation of variants identified by next generation sequencing. RESULTS: The sensitivity of the next generation sequencing technique was estimated at 95.92% and the specificity at 98.77%. In the case of skeletal disorders, the diagnostic yield of the samples sequenced by Sanger was 69% (20/29), by customized panel, 60% (75/125), and by exome, 63% (12/19). In the individuals with RASopathies, the diagnostic yield through exome sequencing was 46% (36/79). As a result of this study, two new genes associated with RASopathies (LZTR1 and SOS2) and one associated with a skeletal dysplasia (PCYT1A) were identified. In the analysis of the samples without previous knowledge of the clinical hypothesis, a total diagnostic yield of 46.67% (21/45) was obtained, but it was up to 73.08% (14/26) in the group with hypothesis of inborn errors of metabolism. CONCLUSIONS: It was demonstrated that the sensitivity and specificity of the next generation sequencing technique are high and are similar to values found by other groups in the literature. The technique was considered appropriate not only for research, as demonstrated here by the identification of three new genes associated to Mendelian diseases, but also for clinical analysis. In this study the technique was successfully applied in the clinical context, both by customized panel and by exome, with positivity similar to that obtained by the Sanger technique. Even in the analysis of samples with no previous clinical history, it was possible to identify pathogenic variants in almost half of the cases, and an even greater percentage was obtained when the disease was an inborn error of metabolism. This sensitivity is comparable to that obtained by Tandem mass spectroscopy applied to multi-condition screening, suggesting that the next generation sequencing technique may be incorporated in the future into the neonatal screening program, increasing the use of genetic testing in complementarity to the biochemical tests

Infecções invasivas por Trichosporon spp. ocorrem com maior frequência em pacientes neutropênicos, principalmente portadores de doenças hematológicas malignas, e estão associadas a elevados índices de mortalidade devido às dificuldades na identificação do patógeno e à resistência aos fármacos mais empregados na terapêutica antifúngica. A identificação das espécies de Trichosporon é importante tanto para estudos epidemiológicos, como para associar aspectos clínicos com as espécies causadoras das infecções. Além disso, auxilia no tratamento da enfermidade, uma vez que a suscetibilidades aos fármacos antifúngicos pode variar de acordo com a espécie. Além disso, as leveduras do gênero Trichosporon sintetizam a glucuronoxilomanana (GXM) em sua parede celular, que pode estar envolvida no mecanismo de virulência do patógeno. Este estudo teve como objetivo determinar, por identificação fenotípica e molecular, espécies isoladas de pacientes internados em unidades hospitalares, comparando os resultados obtidos por ambos os métodos; avaliar diferenças na distribuição dessas espécies em relação às formas invasivas e não invasivas da infecção; determinar o perfil de suscetibilidade dessas leveduras aos antifúngicos, empregando um método de micro-diluição de referência e um método comercial; e avaliar a presença de GXM na parede celular dos isolados. Foram avaliados 74 isolados obtidos de amostras clínicas de pacientes do Hospital das Clinicas da FMUSP e de outras unidades hospitalares do Estado de São Paulo, no período de 2003 a 2011. Dezenove amostras foram isoladas de sítios estéreis do organismo (infecções invasivas) e 55 foram isoladas de urina e cateter (isolados não invasivos). Para a identificação das espécies, os isolados foram submetidos a análises fenotípicas, que incluíram estudo macro e micromorfológico, provas fisiológicas e avaliação do perfil bioquímico por sistema automatizado VITEK 2. A identificação molecular foi realizada pelo sequenciamento das regiões IGS e D1/D2 do DNA ribossomal. O perfil de suscetibilidade dos 74 isolados foi analisado pelo método de micro-diluição EUCAST (referência) com os fármacos fluconazol (FCZ), itraconazol (ITZ), voriconazol (VCZ), cetoconazol (CTZ), anfotericina B (AMB) e 5-fluocitosina (5FC); e pelo método de micro-diluição comercial Sensititre YeastOne, com os mesmos fármacos empregados no EUCAST, acrescidos do posaconazol (POS) e caspofungina (CAS). Os valores das concentrações inibitórias mínimas (CIM), erros categórico e essencial, bem como outros parâmetros foram comparados entre os dois métodos. A presença de GXM na parede celular dos 74 isolados foi determinada por citometria de fluxo, empregando anticorpo monoclonal anti-GXM. Os resultados dos estudos morfológicos e fisiológicos foram insuficientes para definir as espécies dos 74 isolados. Pela assimilação de carboidratos analisada pelo sistema VITEK 2, verificou-se que 71 isolados foram identificados como T. asahii (17 de infecção invasiva e 54 não invasivos), um isolado como T. mucoides (invasivo), e para dois isolados (um invasivo e um não invasivo), a identificação não foi conclusiva. Para estes últimos foi realizado o auxanograma (método manual), e a identificação permaneceu inconclusiva, pois pelo perfil de assimilação, os isolados poderiam ser identificados como T. asahii ou T. faecale. Pela técnica de sequenciamento, 62 dos 74 isolados foram identificados como T. asahii, demonstrando 82,4% de concordância com o sistema VITEK 2. Onze isolados com identificações discordantes pertenciam às espécies T. inkin (8), T. faecale (2) e T. dermatis (1), como determinado por sequenciamento. Dos dois isolados com identificação inconclusiva pelo VITEK 2, um foi identificado pela técnica molecular como T. asahii, enquanto para o outro isolado não foi possível definir a espécie. Portanto, dos 74 isolados do estudo, 62 foram identificados como T. asahii, 8 como T. inkin, 2 como T. faecale e 1 T. dermatis; dois isolados permaneceram sem identificação conclusiva. Os resultados dos testes de suscetibilidade in vitro mostraram que, em ambos os métodos, VCZ apresentou a melhor atividade antifúngica. Pelo método EUCAST, foram obtidos valores elevados de CIM para AMB, enquanto o mesmo não foi observado no teste comercial. Neste último, foram observados valores elevados de CIM para FCZ, POS e CAS. Em relação à 5FC, os valores de CIM 90% por ambos os testes foram elevados (16mg/L). Diferenças significantes foram observadas entre os valores de CIM obtidas pelos dois métodos, e percentuais relativamente elevados de erros categóricos graves quando o método comercial foi comparado ao de referência. Não houve diferença estatística significante de valores de CIM entre isolados de infecção invasiva e não invasiva, exceto para ITZ e 5FC. Cerca de 30% dos isolados obtidos de casos de infecção invasiva e não invasivos apresentaram resistência cruzada entre os azóis FCZ e VCZ, e uma pequena porcentagem apresentou multirresistência. Para a análise de GXM na parede celular dos 74 isolados do estudo, foi avaliada a intensidade de fluorescência emitida pela citometria de fluxo, não tendo sido observada diferença estatística significante entre isolados invasivos e não invasivos. O estudo permitiu concluir que T. asahii foi a espécie mais isolada das amostras clínicas obtidas de sítios estéreis e não estéreis. A metodologia clássica de identificação fenotípica não foi suficiente para definir as espécies do gênero Trichosporon, e o sistema VITEK 2 apresentou discordância quando comparado à técnica molecular para as espécies não T. asahii. Em relação aos testes de suscetibilidade in vitro, VCZ apresentou-se mais adequado para a inibição das leveduras, enquanto os fármacos AMB, FCZ e POS não foram eficazes para a maior parte dos isolados. As discordâncias encontradas entre o método de referência e o comercial sugerem que, para o segundo, são necessárias mais avaliações para seu emprego em rotina laboratorial para o gênero Trichosporon. A detecção de GXM não resultou em diferenças entre os isolados de ambos os grupos; no entanto, para se determinar o efeito protetor do polissacarídeo contra a ação de macrófagos, ensaios de fagocitose devem ser realizados / Invasive Trichosporon spp. infections occur more frequently in neutropenic patients, especially those with hematologic malignancies, and are associated with high mortality rates due to difficulties in identifying the pathogen and treating patients with drugs most currently employed in antifungal therapy. Trichosporon species identification is important for epidemiological studies and to better define eventual species-specific clinical association. Additionally, antifungal susceptibility may vary according to the species. Furthermore, glucuronoxylomannan (GXM) is a cell wall-associated polysaccharide produced by genus Trichosporon, which may be involved in virulence mechanisms of this pathogen. This study aimed (i) to identify Trichosporon species isolated from hospitalized patients by both phenotypic and molecular methods, comparing results; (ii) to verify the distribution of these species in invasive and non-invasive infection episodes; (iii) to determine the in vitro activities of various antifungals agents against the Trichosporon spp. isolates, employing a reference micro-dilution method and a commercial system; (iv) and to analyze the surface expression of GXM. Seventy-four Trichosporon spp. isolates obtained from clinical specimens of patients admitted to the Hospital das Clínicas-FMUSP and to other hospitals in the state of São Paulo, from 2003 to 2011, were included in the study. Nineteen samples were isolated from sterile deep sites (invasive infections) and 55 were isolated from catheter and urine samples (non-invasive isolates). All isolates were submitted to phenotypic analysis, which consisted in morphological features observation, physiological tests and determination of the biochemical profile by VITEK 2 system. Molecular identification was performed by sequencing of IGS1 and D1/D2 regions from the ribosomal DNA. The susceptibility antifungal profiles of the 74 isolates were analyzed by both the EUCAST micro-dilution method (reference) employing fluconazole (FCZ), itraconazole (ITZ), voriconazole (VCZ), ketoconazole (CTZ), amphotericin B (AMB) and 5 - flucytosine (5FC), and the commercial micro-dilution test Sensititre YeastOne, with the same drugs employed in EUCAST plus posaconazole (POS) and caspofungin (CAS). The minimum inhibitory concentration values (MIC), categorical and essential errors as well as other susceptibility parameters were compared between both methods. The cell wall expression of GXM of all isolates was measured by flow cytometry employing an anti-GXM monoclonal antibody. The morphological and physiological features of the Trichosporon spp. isolates were insufficientto define species. The carbohydrate assimilation analysis, performed by VITEK 2 system, has resulted in 71 isolates identified as T. asahii (17 from invasive infections and 54 non-invasive isolates) and one isolate as T. mucoides (invasive). The species identification for the two remaining isolates (one invasive and one non-invasive) was inconclusive. For this reason, a manual auxanogram was performed with these isolates, resulting again in non-conclusive species identification. By the automated sequencing method, 62 of the 74 isolates were identified as T. asahii, showing 82.4% of agreement with the VITEK 2 identification. Eleven isolates were identified by sequencing as T. inkin (8), T. faecale (2) and T. dermatis (1), showing disagreement identification with the VITEK 2 system. Regarding the two isolates with inconclusive results by the carbohydrate assimilation, the molecular technique identified one as T. asahii, whereas for the other isolate the sequencing was also unable to define species. Therefore, among the 74 studied isolates, 62 were identified as T. asahii, eight as T. inkin, two as T. faecale and one as T. dermatis; and two isolates remained with unconclusive identification. Almost all Trichosporon spp. isolates displayed susceptibility to VCZ with both methods. By the EUCAST method, high values of MIC were observed for AMB, while by the commercial test especially the invasive isolates showed susceptibility to this drug. Additionally, the Sensititre kit provided elevated MIC values for FCZ, POS and CAS. In regards to 5FC, the MIC 90% values were consistently high (16 mg/L) in both methodologies. The MIC values obtained by both EUCAST and commercial methods were compared, resulting in significant differences of MIC values for all tested antifungal drugs; major categorical errors occurred at relatively high percentage with the commercial method. No statistically significant differences in MIC values were verified when invasive and non-invasive isolates were compared. Around 30% of both invasive and non-invasive isolates showed cross-resistance to FCZ and VCZ, while a small number of isolates was multiresistant. The GXM analysis by cytometry demonstrated no significant differences between invasive and non- invasive isolates. This study demonstrated that T. asahii was the most frequently isolated species from both deep and non-sterile sites of the patients. The classical phenotypic methodology was not able to define Trichosporon species, and the VITEK 2 system identification showed disagreement with the sequencing technique for the non-T. asahii species. Regarding the in vitro susceptibility tests, VCZ was the most effective drug against the isolates, whereas most of them appear to be less susceptible to AMB, FCZ and POS. The discrepancies in the Trichosporon spp. susceptibility results between the reference and commercial methods suggest that the latter requires further evaluation tests before it can be used in routine laboratory. Although the GXM expression seemed to be equal in both invasive and non-invasive Trichosporon spp. isolates, phagocytic assays should be performed in order to determine the protective effect of the polysaccharide against phagocytosis