INTRODUÇÃO: O papilomavírus humano (HPV) encontra-se amplamente distribuído na população mundial. Apesar da grande maioria das infecções serem transientes, assintomáticas e passíveis de regressão espontânea, a infecção persistente por tipos de alto risco de HPV é necessária para o desenvolvimento de neoplasias intraepiteliais cervicais. Uma vez que apenas uma pequena parcela das infecções progride à lesões malignas após um longo período desde o diagnóstico inicial de lesões precursoras, tem-se iniciado a busca por fatores que possam influenciar na progressão ou na eliminação destas manifestações iniciais. A variabilidade genética viral tem sido apontada como um dos fatores que interagem neste processo. Embora virtualmente todos os tumores da cérvice uterina apresentem o DNA viral, neoplasias em outros sítios anatômicos têm sido apenas em parte correlacionadas com a presença viral, sendo o HPV proposto como um dos agentes causadores de tumores em sítios de cabeça e pecoço. MÉTODOS: Espécimens clínicos de tumores de cabeça e pescoço, fixados em formalina e contidos em parafina (FFPE), provenientes do Instituto do Câncer do Estado de São Paulo (n=79) e da Santa Casa de Misericórida de São Paulo (n=94), tiveram seu DNA extraído, seguido de diagnóstico e genotipagem de HPV pela metodologia de Inno-LiPA. Análises de linhagens moleculares foram realizadas nas amostras HPV-16 positivas. Análise imunohistoquímica de P16INK4a foi realizada em todas as amostras. RESULTADOS: A presença do DNA viral foi encontrada em 24,1% (19/79) dentre a série de tumores provenientes do ICESP, sendo a cavidade oral o sítio em que foi observada a maior proporção de DNA viral (27,1%), enquanto que 13,8% (13/94) dentre os espécimens provenientes da Santa Casa apresentaram-se positivos para HPV, sendo a cavidade oral o sítio em que foi observada a maior proporção do DNA viral (18,1%). O HPV-16 foi o tipo mais prevalente, detectado em 73,4% das amostras HPV positivas provenientes do ICESP e 61,5% das amostras provenientes da Santa Casa. Independente da Instituição, as amostras foram alocadas no clado das linhagens Asiático-Americana e Europeia em 50%, cada uma, entre os 18 tumores HPV-16 positivos em que as análises de linhagem foram possíveis. Não foi observada, nestas séries, correlação entre a superexpressão de P16INK4a e a presença do DNA viral. CONCLUSÃO: Nas amostras analisadas, o DNA de HPV foi detectado em 18,5% dos 173 espécimens. O HPV-16 foi o tipo mais prevalente. Isolados da linhagem Europeia e da linhagem Asiatico-Americano foram detectados em 50% dos casos, cada uma, dentre as amostras HPV-16 analisadas por este estudo / INTRODUCTION: Human papillomaviruses (HPV) are widely distributed worldwide. Although the majority of infections are usually transient, asymptomatic and frequently regress spontaneously, persistent infections by high-risk HPVs are necessary for the development of cervical intraepithelial neoplasia. Once only a small proportion of infections progress to malignant lesions after a long period of time since the initial diagnosis of precursor lesions, the search for factors that might influence the progression or clearence of these early manifestations are currently under way. Viral genetic variability has been proposed as one of the factors interacting in this process. Although virtually all cervix tumors present the viral DNA, neoplasias from other anatomical sites have been only in part correlated with viral presence, and HPV has been proposed as one causative agent in tumors from head and neck sites. METHODS: Clinical specimens of formalin-fixed paraffin embedded head and neck tumors, provided by the Cancer Institute of São Paulo (n=79) and also by the Santa Casa de Misericórdia de São Paulo (n=94), were submitted to DNA extraction and further HPV diagnostic and genotyping by the Inno-LiPA methodology. Molecular lineages analyses were performed in all HPV-16 positive samples. P16INK4a immunohistochemical analyses were conducted in all samples. RESULTS: HPV DNA was detected among 24.1% (19/79) of samples provided by ICESP, tumors from oral cavity presented the highest viral positivity (27.1%), whereas 13,8% (13/94) of the samples from Santa Casa presented HPV DNA, tumors from the oral cavity also presented the highest HPV positivity with 18.1% of viral DNA presence. HPV-16 was the most prevalent type detected in 73.4% and 61.5% of HPV positive ICESP and Santa Casa samples, respectively. Irrespective of the Institution, samples submitted to lineage analyzes were allocated in the Asiatic-American and European phylogenetic branches in 50%, each one, among the 18 tumors HPV-16 positive for which lineage analysis was possible. No correlation between P16INK4a overexpression and HPV DNA presence was observed. CONCLUSION: In this study, HPV DNA was detected in 18.5% among 173 head and neck tumor specimens. HPV-16 was the most prevalent type. The European and the Asiatic-American lineage were detected in 50% of the cases, each one, among the cases HPV-16 positive analyzed

A cardiomiopatia hipertrófica (CMH) é uma doença geneticamente determinada, caracterizada por hipertrofia ventricular primária, com prevalência estimada de 0.2% na população geral. Qualquer portador tem 50% de chance de transmitir esta doença para seus filhos, o que torna cada vez mais relevante a importância do estudo genético dos indivíduos acometidos e de seus familiares. Já foram descritas diversas mutações genéticas causadoras de CMH, a maioria em genes que codificam proteínas do sarcômero, e algumas mutações mais raras em genes não sarcoméricos. O objetivo desse estudo é sequenciar as regiões exônicas de genes candidatos, incluindo os principais envolvidos na hipertrofia miocárdica, utilizando o sequenciamento de nova geração (Generation Sequencing); testar a aplicabilidade e viabilidade deste sistema para identificar mutações já confirmadas e propor as prováveis novas mutações causadoras de CMH. Métodos e resultados: 66 pacientes não aparentados portadores de CMH foram estudados e submetidos à coleta de sangue para obtenção do DNA para analisar as regiões exômicas de 82 genes candidatos, utilizando a plataforma MiSeq (Illumina). Identificou-se 99 mutações provavelmente patogênicas em 54 pacientes incluídos no estudo (81,8%) relacionadas ou não a CMH, e distribuídas em 42 genes diferentes. Destas mutações 27 já haviam sido publicadas, sendo que 17 delas descritas como causadoras de CMH. Em 28 pacientes (42,4%) identificou-se mutação nos três principais genes sarcoméricos relacionados à CMH (MYH7, MYBPC3, TNNT2). Encontrou-se também um grande número de variantes não sonôminas de efeito clínico incerto e algumas mutações relacionadas a outras enfermidades. Conclusão: a análise da sequencia dos exônos de genes candidatos, demonstrou ser uma técnica promissora para o diagnóstico genético de CMH de forma mais rápida e sensível. A quantidade de dados gerados é o um fator limitante até o momento, principalmente em doenças geneticamente complexas com envolvimento de diversos genes e com sistema de bioinformática limitado. / Hypertrophic Cardiomyopathy (HCM) is a genetically determined disease, estimated prevalence of 0.2% in the general population. Any of its carriers has 50% likelihood to pass it on to their children, and that makes the genetic study of these individuals and their relatives even more relevant. There have been several studies describing genetic mutations that cause HCM - the vast majority in genes responsible for sarcomere protein coding - and other rarer mutations in non-sarcomeric genes. The aim of this research is study exonic areas of specific genes, including the most important ones related to myocardial hypertrophy, identifying the genetic mutations that have already been documented, and possible new pathogenic mutations, using the high throughput DNA sequencing (NGS); testing the pplicability and viability to identify HCM-causing mutations. Methods and results: 66 unrelated patients with CM were studied and subject to blood sample in order to extract their genomic DNA to analyze exomic regions of 82 candidates genes, using the high throughput sequencing technology on MiSeg (Illumina) platform. In this study we identified 99 possible damaging mutations in 54 patients (81.8%) that could be related or not to HCM, and distributed in 42 different genes. 27 of this variants have already been published, and 17 of them have been described as HCM causes. 42,4% of the patients (28 individuals) have genetic mutations in the three main sarcomeric genes related to HCM (MYH7, MYBPC3, TNNT2). We also identified a large number of non-synonymous variants of uncertain clinical significance and some mutations related to other diseases. Conclusion: The exome analysis in candidates genes using NGS has demonstrated to be promising for the genetic diagnosis of HCM, in a short time with sensivity. The amount of data obtained in a short period of time is the main limiting factor, especially for genetically complex diseases that involve multiple genes.

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No Brasil, sete espécies estão envolvidas com a etiologia da doença, distribuídas em todas as regiões geográficas e responsáveis por diferentes manifestações clínicas. Diante disso, o diagnóstico em conjunto com a identificação da espécie é de grande importância clínico-terapêutica. Este trabalho tem por objetivo avaliar a aplicabilidade da técnica de PCR quantitativa em tempo real (qPCR) para identificação de espécies de Leishmania envolvidas com a etiologia da LTA. Foram realizados ensaios de qPCR para padronização da Temperatura de melting (Tm) utilizando cepas de referência de diferentes espécies de Leishmania. Após o diagnóstico em amostras de sangue de animais domésticos utilizando a qPCR, as amostras positivas foram analisadas através de suas Tm, e os produtos de qPCR foram purificados e sequenciados. Dez amostras previamente caracterizadas por isoenzimas, também foram analisadas através da Tm. Ainda como teste de referência, foi padronizada uma Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) utilizando as cepas de referência e testada nas amostras. Através da padronização da Tm das espécies, foram criados dois intervalos de análise: 1 (Tm = 78-79,99°C), que compreende: Leishmania (V.) braziliensis, Leishmania (V.) panamensis, Leishmania (V.) lainsoni, Leishmania (V.) guyanensis e Leishmania (V.) shawi; e 2 (Tm = 80-82,2°C), que compreende: Leishmania (V.) naiffi, Leishmania (L.) amazonensis e Leishmania (L.) mexicana. Um total de 223 amostras positivas foi analisado, destas, 58 incluídas no intervalo 1 e 165 no intervalo 2. O sequencimento de 94 destas amostras foi correspondente à L. (V.) braziliensis, L. (V.) panamensis e L. (V.) guyanensis. A RFLP em 173 amostras identificou 167 L. (V.) braziliensis, 05 L. (L.) mexicana e 01 L. (V.) panamensis. A análise da Tm das dez amostras caracterizadas por isoenzimas demonstrou 80 por cento de concordância (p = 0,6499) entre o padrão-ouro (isoenzimas) e os intervalos desenvolvidos neste estudo. Os resultados do sequenciamento foram concordantes com a qPCR em 43,62 por cento (n= 41) das amostras. A RFLP e qPCR tiveram 27,74 por cento (n= 48) de concordância. Análise estatística mostrou que a qPCR e sequenciamento são testes sem diferenças estatísticas significantes (p = 0,2566). Sendo assim, é possível concluir que a Tm da qPCR pode ser utilizada como um método para direcionamento da espécie de Leishmania presente na amostra em análise, sendo necessário a realização de métodos clássicos de caracterização, quando a precisão na identificação do parasito for crucial para implementação do tratamento, como em casos de resistência e/ou recidiva da doença. A utilização desta tecnologia pode ser ainda mais precisa quando for utilizada a metodologia com sondas desenhadas para cada espécie de Leishmania, sendo necessários estudos futuros para comprovar esta perspectiva (AU) / The American Cutaneous Leishmaniasis (ACL) is caused by protozoa of the genus Leishmania, involved in a complex biological cycle. In Brazil, seven species are involved in the etiology of the disease, distributed in all geographic regions and responsible for different clinical manifestations. Therefore, the diagnosis together with the identification of the species is of great clinical and therapeutic importance. This work aims to evaluate the applicability of the technique of real-time quantitative PCR (qPCR) for the identification of Leishmania species involved in the etiology of ACL. qPCR assays for standardizing the melting temperature (Tm) using reference strains of different species of Leishmania were performed. After the diagnosis on blood samples of domestic animals using the qPCR positive samples were analyzed by their Tm and qPCR products were purified and sequenced. Ten samples previously characterized by isoenzymes were also analyzed by Tm. Also as a reference test was standardized as Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) using the reference strains and tested on samples. Through standardization of Tm species two ranges of analysis were created: 1 (Tm = 78-79,99°C), comprising: Leishmania (V.) braziliensis, Leishmania (V.) panamensis, Leishmania (V.) lainsoni, Leishmania (V.) guyanensis e Leishmania (V.) shawi; and, 2 (Tm = 80-82,2°C), comprising: Leishmania (V.) naiffi, Leishmania (L.) amazonensis e Leishmania (L.) mexicana. A total of 223 positive samples were analyzed, of these, 58 included in the range 1 and 165 in the range 2 to 94 and the sequence of these samples corresponded to L. (V.) braziliensis, L. (V.) panamensis and L. (V.) guyanensis. By RFLP in 173 samples were identified 167 L. (V.) braziliensis, 05 L. (L.) mexicana and 01 L. (V.) panamensis The analysis of Tm of the ten samples characterized by isoenzymes showed 80 per cent agreement (p = 0.6499) between the gold standard (isoenzymes) and intervals developed in this study. The sequencing results were concordant with qPCR in 43.62 per cent (n= 41) of the samples. The RFLP and qPCR had 27.74 per cent (n= 48) agreement. Statistical analysis showed that qPCR and sequencing tests are no statistically significant differences (p = 0.2566). Thus, we conclude that the Tm of qPCR can be used as a method for direction of Leishmania species present in the sample under analysis, performing classic methods of characterization is necessary when the accuracy in identifying the parasite is crucial for implementation treatment, such as in cases of resistance and / or recurrence of the disease. The use of this technology can be even more precise when the methodology with probes designed for every Leishmania species is used; future studies are needed to confirm this view (AU)

Aeromonas spp. são bastonetes Gram negativos amplamente distribuídos nos ambientes aquáticos, com relatos de isolamento em água de abastecimento público e alimentos. Este micro-organismo possui potencial de causar doenças intestinais e extraintestinais cuja patogenicidade está associada a sua virulência multifatorial. Diversos determinantes de virulência de Aeromonas já foram identificados, incluindo sistemas de secreção de proteínas. O sistema de secreção tipo VI (SST6) é o mais recente sistema de secreção de proteínas identificado em bactérias cuja presença em estirpes no gênero Aeromonas pode implicar atividades de citotoxicidade para o hospedeiro, pois esse sistema é capaz de injetar moléculas efetoras dentro da célula, interferindo diretamente nos processos celulares. A fim de determinar a presença e analisar a distribuição dos genes hcp e vgrG codificadores das proteínas efetoras do SST6 em Aeromonas spp. o presente estudo examinou 119 cepas isoladas de diversas origens pela técnica da PCR após o desenho de oligonucleotídeos iniciadores específicos. Objetivamos ainda analisar a variabilidade genética interespecífica dos genes hcp e vgrG a partir de dados de sequenciamento. Os resultados obtidos indicaram a distribuição dos genes vgrG e hcp em 46% das cepas de Aeromonas hydrophila e Aeromonas caviae de diferentes origens. Entre as cepas de A. hydrophila a maior frequência foi observada nas cepas isoladas de humanos, onde todas foram positivas para os iniciadores que amplificaram um produto de 541 pb do gene vgrG e 418 pb do gene hcp. Entre as cepas de A. caviae, a incidência de genes vgrG e hcp foi mais elevada nas cepas isoladas de alface (60%) e peixes (50%). As cepas analisadas de origem ambiental apresentaram índice total de 36% de positividade, apresentando frequência de 60% e 22% em A. hydrophila e A. caviae, respectivamente. Os dados obtidos da análise de cepas de origem alimentar mostraram a presença dos genes vgrG e hcp em 67% (A. hydrophila) e 60% (A. caviae) das cepas isoladas de folhas de alface. Nas cepas isoladas de queijo os genes foram encontrados em 67% e 12,5% das cepas de A. hydrophila e de A. caviae, respectivamente. O alinhamento múltiplo entre as sequências dos segmentos dos genes hcp e vgrG obtidas no sequenciamento indicou grau de identidade nucleotídica de 75 a 100% entre as sequências de hcp e 80 a 100% entre as sequências de vgrG. Em conclusão, nossos resultados indicaram que os iniciadores desenhados foram capazes de detectar suas sequências alvo em cepas de A. caviae e outras espécies de Aeromonas, sugerindo a existência de homologia entre os genes nas diferentes espécies, confirmada após sequenciamento de DNA. Os dados indicaram que esses genes estão distribuídos em várias espécies de Aeromonas e em cepas isoladas de diversas fontes. Ressaltamos a prevalência de cepas de A. hydrophila PCR-positivas em isolados clínicos, sugerindo a participação do SST6 no complexo universo da virulência multifatorial que permeia esse micro-organismo / Aeromonas species are Gram negative bacilli distributed widely in aquatic environments, with reports of isolation of this microorganism in water for public supply and food. Aeromonas have the potential to cause intestinal and extra intestinal infections whose pathogenicity is associated with multifactorial virulence. A number of virulence determinants have already been identified in Aeromonas, including protein secretion systems. The type VI secretion system (T6SS) is the most recent pathway to secrete proteins identified in bacteria. The presence of T6SS in Aeromonas strains may involve activities of cytotoxicity to the host, since this system is capable of injecting effectors molecules into the cell, interfering directly with a variety of cellular processes. The present study examined 119 strains of different origins by PCR, after the design of specific primers, to determine the distribution of vgrG and hcp genes encoding the effector proteins of T6SS in Aeromonas spp. We aimed to further analyze the interspecific sequence variation of hcp and vgrG genes based on sequencing data. The results show the presence of hcp and vgrG genes in 46% of A. hydrophila and A. caviae strains from different sources. All A. hydrophila strains isolated from humans were positive for the primers used to amplify a product of 541 bp and 418 bp of vgrG and hcp genes, respectively. Among A. caviae strains, the incidence of hcp and vgrG genes was high in the strains isolated from lettuce (60%) and fish (50%). The overall PCR-positive rate of strains from environmental source was 36%, with a frequency of 60% and 22% in A. hydrophila and A. caviae, respectively. The data obtained from analysis of food-borne strains showed the presence of hcp and vgrG genes in 67% (A. hydrophila) and 60% (A. caviae) of strains isolated from lettuce, while in the strains isolated from cheese the frequency was 67% (A. hydrophila) and 12.5% (A. caviae). The multiple alignment of hcp and vgrG sequences obtained revealed nucleotide identity rate between 75-100% among the hcp sequences and 80-100% in vgrG sequences. In conclusion, our results indicate that the primers designed were able to detect their target sequences in strains of A. caviae and other Aeromonas species, suggesting the existence of homology between genes in different species, as confirmed after DNA sequencing. The data indicate that these genes are distributed in various Aeromonas species from different sources. We emphasize the prevalence of PCR-positive A. hydrophila strains in clinical samples suggesting the involvement of T6SS in the complex universe of multifactorial virulence, which permeates this microorganism

O diagnóstico da doença de Wilson (DW) é realizado por exames clínicos, laboratoriais, anatomopatológicos e de imagem. Mais de 500 mutações no gene ATP7B foram descritas como causadoras da DW. Para avaliar a importância da detecção de mutações no diagnóstico da DW em nosso meio, analisamos 35 pacientes com DW, 20 familiares de wilsonianos a partir de rastreamento familiar, 18 com hepatite crônica criptogênica e sete com insuficiência hepática aguda grave. Para o diagnóstico da DW foi utilizado o sistema de escore sugerido pela Sociedade Europeia para o Estudo do Fígado de 2012. Os dados demográficos, clínicos, laboratoriais e histológicos foram obtidos retrospectivamente. Obteve-se o DNA genômico de cada paciente a partir de sangue periférico e realizou-se o sequenciamento direto dos 21 éxons e suas bordas intrônicas do gene ATP7B. Todos os pacientes com DW apresentavam no mínimo quatro pontos. No grupo de rastreamento familiar o sequenciamento foi importante para o diagnóstico de DW em 14 familiares; no grupo de hepatite crônica criptogênica em oito pacientes e no grupo de insuficiência hepática aguda grave em três pacientes. Foi caracterizada uma família com cinco genótipos diferentes (dois homozigotos p.A1135Qfs/p.A1135Qfs e p.M645R/p.M645R), um heterozigoto composto (p.A1135Qfs/p.M645R) e dois heterozigotos simples (p.A1135Qfs/0 e p.M645R/0) com fenótipos variados. Foram detectadas duas mutações em heterozigose simples em pacientes com insuficiência hepática aguda grave. A mutação p.A1135Qfs e p.L708P foram as mais frequentes em todos os grupos. Foi identificada pela primeira vez a mutação p.M645R em homozigose. Concluímos que os resultados confirmaram que o sequenciamento do gene ATP7B foi útil: 1) para confirmar que as mutações p.A1135Qfs e p.L708P são as mais importantes na população brasileira; 2) para demonstrar que a mutação tida como a mais frequente na Europa, a p.H1069Q, tem bem menor importância em nosso meio, embora mais frequentemente do que o observado anteriormente; 3) para confirmar (ou excluir) precocemente o diagnóstico e evitar a realização de exames desnecessários e invasivos e iniciar (ou não realizar) o tratamento, com base mais sólida, em pacientes com hepatopatia crônica idiopática e em familiares de portadores de DW; 4) para definir o diagnóstico de DW em casos de insuficiência hepática aguda grave, diagnóstico ainda que tardio, mas de suma importância para realização de estudo familiar subsequente, 5) para identificação não esperada de heterozigotos simples e polimorfismos de significado ainda não esclarecido em pacientes com insuficiência hepática aguda grave; 6) para identificação de casos inusitados de três genótipos diferentes causadores da doença na mesma família (homozigose de duas mutações diferentes e heterozigose composta); 7) para melhor definir que a mutação p.M645R em homozigose tem potencial para desenvolver a DW, embora resultados de estudos em in vitro sugiram função normal da proteína defeituosa sintetizada; 8) para definir que há casos de doentes com a mutação p.M645R em heterozigose composta de evolução extremamente benigna, com diagnóstico após a quinta década de vida, com discretas alterações hepáticas. Porém há casos com evolução mais grave tanto do ponto de vista hepático quanto neurológico, possivelmente influenciados pelas mutações que a acompanham / Wilson\'s disease (WD) is an autosomal recessive disorder secondary to mutations in the ATP7B gene resulting in toxic accumulation of copper in various tissues. The diagnosis of WD is made by the analysis of clinical, laboratory, histological findings and imaging tests. More than 500 mutations have been described in the ATP7B gene as the cause of WD. In order to expand the knowledge of the importance of mutation detection in the diagnosis of WD, we analyzed 36 patients with WD, 20 individuals from family screening, 18 with cryptogenic chronic hepatitis and seven with severe acute liver failure. For the diagnosis of WD the International Scoring System suggested by the European Association for the Study of the Liver (EASL) in 2012 was used. Demographic, clinical, laboratory and histological data were obtained retrospectively. Direct sequencing of 21 exons and intron boundaries of ATP7B gene was performed in genomic DNA extracted from peripheral blood leucocytes of all subjects. All patients with WD have at least four points of the scoring system without considering the DPA challenge test. In the family screening group, sequencing was important for the diagnosis of DW in fourteen patients; eight patients in the group of cryptogenic chronic hepatitis, and three patients in the group of severe acute liver failure. Five different genotypes were identified in one family (two homozygous, p.A1135Qfs/p.A1135Qfs and p.M645R/p.M645R, one compound heterozygous p.A1135Qfs/p.M645R, and two simple heterozygous p.A1135Qfs/0 and p.M645R/0). Two patients with acute liver failure were detected as simple heterozygous. The p.A1135Qfs and p.L708P were the most frequent mutations in all groups. It is the first time p.M645R mutation was detected in homozygosity. The ATP7B gene sequencing was useful: 1) to confirm that p.A1135Qfs and p.L708P mutations are the most frequent in the Brazilian population; 2) to confirm that the most common mutation in Europe, p.H1069Q has lower frequency in our area; 3) to confirm (or exclude) an early diagnosis and to avoid unnecessary and invasive tests and to initiate (or not) the specific treatment with a stronger basis in patients with chronic liver disease and individuals from family screening of patients with Wilson disease; 4) to confirm the diagnosis, although late, of cases with severe acute liver failure, but very important to perform family screening; 5) to identify simple heterozygotes in patients with severe acute liver failure; 6) to describe unusual cases of three different genotypes of WD patients in a same family (two different homozygous mutations and one compound heterozygous); 7) to better define that p.M645R mutation in homozigosity develops WD, although the results from in vitro studies suggested a normal function for the defective synthesized protein; 8) to define that there are patients with p.M645R mutations in compound heretozigosity with a very benign clinical picture, with late diagnosis, after the fifth decade of life, with mild liver alterations. However, there are patients with a more severe clinical evaluation, hepatic or neurologic, probably secondary to the influence of the other mutation

Diabetes melito ou intolerância à glicose estão presentes em até 80% dos pacientes com adenocarcinoma de pâncreas. Portadores desta neoplasia têm resistência à insulina e alteração na secreção de insulina em resposta à glicose, o que pode levar ao aparecimento ou piora de diabetes. Para identificar genes diferencialmente expressos, que podem representar fatores diabetogênicos produzidos pelo adenocarcinoma de pâncreas, utilizou-se a comparação de microarranjos de oligonucleotídeos hibridizados com RNA complementar (cRNA) de tumores pancreáticos de pacientes com e sem diabetes melito no pré-operatório. Uma lâmina foi hibridizada com cRNA de dois pacientes portadores de diabetes melito, e outra com cRNA de dois pacientes com tolerância normal à glicose pelo teste oral. Considerando a expressão ajustada para os controles internos dos microarranjos, 293 genes estavam duas ou mais vezes mais expressos na lâmina dos portadores de diabetes melito; destes, 25 genes estavam pelo menos cinco vezes mais expressos. Duzentos e noventa e sete genes estavam pelo menos duas vezes mais expressos na lâmina dos pacientes com tolerância normal à glicose, dos quais 54 genes estavam cinco ou mais vezes mais expressos nestes indivíduos. Dos genes mais expressos nos tumores dos indivíduos portadores de diabetes melito, três deles, FAM3D, do inglês Family with Sequence Similarity number 3 member D, neuropeptídeo Y (NPY), e proteína de ligação do cálcio S100A8, foram estudados por reação em cadeia da polimerase em tempo real. A expressão do FAM3D foi 4070 (1000-37588) nas amostras de tumores de pacientes com diabetes melito, contra 109 (10-1112) nas de pacientes não-diabéticos (com intolerância à glicose ou com tolerância normal à glicose) (p<0,05). A expressão do NPY foi 0,46 (0,19-0,91) nos tumores dos portadores de diabetes, contra 0,32 (0,21- 0,58) nos tumores dos não-diabéticos (p = NS). Quanto à expressão de S100A8, foi 0,52 (0,27-0,60) nos tumores dos diabéticos, e 0,34 (0,16-1,44) nos não-diabéticos. Estudo imunohistoquímico mostrou que o FAM3D está expresso no núcleo e no citoplasma de células de tumores pancreáticos, tanto de indivíduos com diabetes melito quanto de não-diabéticos, assim como no citoplasma de células de ilhotas pancreáticas e de células ductais normais do pâncreas. Concluímos que o FAM3D é uma proteína expressa em tecido pancreático normal e tumoral, e que existe maior conteúdo do mRNA do FAM3D nos adenocarcinomas de pâncreas de portadores de diabetes melito do que nos de não-diabéticos. / Pancreatic ductal adenocarcinoma is closely related to diabetes mellitus; up to 80% of pancreas adenocarcinoma patients have diabetes or impaired glucose tolerance. Pancreas adenocarcinoma patients have both insulin resistance and altered insulin secretion in response to glucose, and impaired glucose metabolism has been reported in muscle of tumor patients, involving glycogen metabolism and post-receptor insulin signaling. But despite progress in research about this issue, precise mechanisms responsible for the interaction of pancreatic adenocarcinoma and diabetes mellitus remain unknown. The aim of this study was to identify differentially expressed genes between pancreas adenocarcinoma of patients who had and who did not have diabetes mellitus before surgery. Clinical and laboratorial data of 33 patients with pancreatic adenocarcinoma were evaluated, and tumor gene expression was analyzed by microarray method between two patients who had diabetes mellitus and two who did not have glycemic homeostasis impairment, and later used quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-qPCR) in twelve tumor fragments mRNA to confirm obtained data. Pancreatic adenocarcinoma patients who had diabetes mellitus had higher HOMA-IR (p < 0.05) and a trend to lower HOMA-beta indexes than non-diabetic patients. icroarray revealed 293 genes twice more expressed in the pool of diabetic patients as compared to the pool of normal glucose tolerance patients. Of these, 25 were five times more expressed in diabetic patients? pancreatic adenocarcinomas. Three genes were chosen for RT-qPCR: Family with Sequence Similarity number 3 member D (FAM3D), neuropeptide Y (NPY), and calcium-binding protein S100A8. FAM3D expression was 4070 (1000-37588) in diabetic patients tumors versus 109 (10-1112) in non-diabetic (impaired glucose and normal glucose tolerance) patients? tumors (p<0.05). NPY expression was 0.46 (0.19- 0.91) in diabetic patients and 0.32 (0.21-0.58) in non-diabetic patients? tumors (p=NS). Calcium-binding protein S100A8 expression was 0.52 (0.27-0.60) in diabetic and 0.34 (0.16-1.44) in non-diabetic patients (p=NS). Immunohistochemistry revealed that FAM3D protein was expressed in pancreatic adenocarcinoma cells in a diffuse nuclear and cytoplasmic pattern. It was also expressed in the cytoplasm of islets of Langerhans and normal pancreatic ducts cells. The present study indicates that cytokine-like FAM3D protein is expressed in normal and tumoral pancreatic tissue, and that FAM3D mRNA content is higher in pancreatic adenocarcinoma in diabetic than in non-diabetic patients.

A cardiomiopatia hipertrófica (CMH) é uma doença geneticamente determinada, caracterizada por hipertrofia ventricular primária, com prevalência estimada de 0.2% na população geral. Qualquer portador tem 50% de chance de transmitir esta doença para seus filhos, o que torna cada vez mais relevante a importância do estudo genético dos indivíduos acometidos e de seus familiares. Já foram descritas diversas mutações genéticas causadoras de CMH, a maioria em genes que codificam proteínas do sarcômero, e algumas mutações mais raras em genes não sarcoméricos. O objetivo desse estudo é sequenciar as regiões exônicas de genes candidatos, incluindo os principais envolvidos na hipertrofia miocárdica, utilizando o sequenciamento de nova geração (Generation Sequencing); testar a aplicabilidade e viabilidade deste sistema para identificar mutações já confirmadas e propor as prováveis novas mutações causadoras de CMH. Métodos e resultados: 66 pacientes não aparentados portadores de CMH foram estudados e submetidos à coleta de sangue para obtenção do DNA para analisar as regiões exômicas de 82 genes candidatos, utilizando a plataforma MiSeq (Illumina). Identificou-se 99 mutações provavelmente patogênicas em 54 pacientes incluídos no estudo (81,8%) relacionadas ou não a CMH, e distribuídas em 42 genes diferentes. Destas mutações 27 já haviam sido publicadas, sendo que 17 delas descritas como causadoras de CMH. Em 28 pacientes (42,4%) identificou-se mutação nos três principais genes sarcoméricos relacionados à CMH (MYH7, MYBPC3, TNNT2). Encontrou-se também um grande número de variantes não sonôminas de efeito clínico incerto e algumas mutações relacionadas a outras enfermidades. Conclusão: a análise da sequencia dos exônos de genes candidatos, demonstrou ser uma técnica promissora para o diagnóstico genético de CMH de forma mais rápida e sensível. A quantidade de dados gerados é o um fator limitante até o momento, principalmente em doenças geneticamente complexas com envolvimento de diversos genes e com sistema de bioinformática limitado. / Hypertrophic Cardiomyopathy (HCM) is a genetically determined disease, estimated prevalence of 0.2% in the general population. Any of its carriers has 50% likelihood to pass it on to their children, and that makes the genetic study of these individuals and their relatives even more relevant. There have been several studies describing genetic mutations that cause HCM - the vast majority in genes responsible for sarcomere protein coding - and other rarer mutations in non-sarcomeric genes. The aim of this research is study exonic areas of specific genes, including the most important ones related to myocardial hypertrophy, identifying the genetic mutations that have already been documented, and possible new pathogenic mutations, using the high throughput DNA sequencing (NGS); testing the pplicability and viability to identify HCM-causing mutations. Methods and results: 66 unrelated patients with CM were studied and subject to blood sample in order to extract their genomic DNA to analyze exomic regions of 82 candidates genes, using the high throughput sequencing technology on MiSeg (Illumina) platform. In this study we identified 99 possible damaging mutations in 54 patients (81.8%) that could be related or not to HCM, and distributed in 42 different genes. 27 of this variants have already been published, and 17 of them have been described as HCM causes. 42,4% of the patients (28 individuals) have genetic mutations in the three main sarcomeric genes related to HCM (MYH7, MYBPC3, TNNT2). We also identified a large number of non-synonymous variants of uncertain clinical significance and some mutations related to other diseases. Conclusion: The exome analysis in candidates genes using NGS has demonstrated to be promising for the genetic diagnosis of HCM, in a short time with sensivity. The amount of data obtained in a short period of time is the main limiting factor, especially for genetically complex diseases that involve multiple genes.

A Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) é a doença neurodegenerativa do neurônio motor que acomete indivíduos adultos e promove a perda progressiva das funções motoras. A evolução é rápida (2 a 5 anos) e culmina na morte por complicações e falência dos músculos respiratórios. Descrições recentes sugerem a contribuição de tipos celulares não neuronais, particularmente o astrócito e a microglia, para a morte do neurônio motor. O camundongo transgênico SOD1G93A, que carrega a SOD1 humana mutada, foi utilizado neste trabalho. Estudos comportamentais apontaram alterações motoras importantes no animal transgênico a partir de 90 dias de vida e permitiram selecionar, então, as idades pré-sintomáticas de 40 dias e 80 dias para os estudos moleculares. A análise da expressão gênica nos animais transgênicos e selvagens destas duas idades foi realizada por microarray utilizando-se a plataforma que contém o genoma completo do camundongo e detectou 492 e 1105 transcritos diferencialmente expressos nos animais de 40 e 80 dias, respectivamente. Estes resultados foram validados por PCR quantitativa (qPCR). As análises bioinformáticas dos resultados identificaram 17 e 11 vias moleculares super-representadas nas idades de 40 dias e 80 dias, respectivamente. Destas, as vias endocitose, sinapse glutamatérgica, proteólise mediada por ubiquitina, via de sinalização de quimiocina, fosforilação oxidativa, processamento e apresentação de antígeno e junção oclusiva foram comuns a ambas as idades. Ainda, as vias sinapse glutamatérgica e fagossomo foram sugeridas como potencialmente mais importantes em animais transgênicos de 40 dias e 80 dias, respectivamente. Transcritos específicos foram analisados em amostras enriquecidas de células (astrócito, microglia e neurônio motor) microdissecadas a laser do corno anterior da medula espinal dos animais. Os transcritos Cxcr4, Slc1a2 e Ube2i foram avaliados por qPCR nas amostras enriquecidas de astrócitos dos animais de 40 dias, enquanto que Cxcr4 e Slc17a6 foram avaliados nas amostras de neurônios motores dos animais desta idade. Cxcr4 apresentou expressão diminuída nos astrócitos transgênicos e aumentada nos neurônios destes animais. Slc1a2, Ube2i e Slc17a6 estavam aumentados nos tipos celulares estudados nos animais transgênicos. Tap2 e Tuba1a foram avaliados nas amostras enriquecidas de microglias dos animais de 80 dias e mostraram-se aumentados nas amostras dos transgênicos. Finalmente, Akt1 apresentou expressão diminuída nos neurônios motores microdissecados dos animais transgênicos em comparação aos selvagens. Os resultados sugerem que alterações na sinalização glutamatérgica podem exercer papel essencial em fases pré-sintomáticas mais precoces da doença (40 dias), enquanto que em fases pré-clínicas mais próximas ao aparecimento dos sintomas (80 dias), as respostas mais importantes parecem estar relacionadas à neuroimmunomodulação. Dessa forma, este trabalho aponta para novas perspectivas para o estudo da ELA / Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) is an adult onset motor neuron neurodegenerative disease that leads to the progressive loss of muscular functions. It is a fast progression disorder (2 to 5 years) culminating in death by respiratory failure. Recent findings suggest that non neuronal cell types, especially astrocytes and microglia, might contribute to the neuronal death. The transgenic mouse SOD1G93A, carring human mutant SOD1, was used in this study. Behavioral studies pointed to the onset of the clinical symptoms occurring at 90 days in the animal model, thus, allowing the selection of the pre-symptomatic ages of 40 and 80 days to the molecular studies. Gene expression analysis of transgenic mice and their non-transgenic littermates at those ages was performed by using a microarray platform containing the whole mouse genome and has detected 492 and 1105 differentially expressed genes at 40 days and 80 days old mice, respectively. These results were validated by quantitative PCR (qPCR). Bioinformatic analysis of the results identified 17 and 11 over-represented molecular pathways at 40 days and 80 days, respectively. Of these, endocytosis, glutamatergic synapse, ubiquitin-mediated proteolysis, chemokine signaling pathway, oxidative phosphorylation, antigen processing and presentation and also tight junction were common to both ages. Furthermore, glutamatergic synapse and fagosome were suggested as potentially more important at 40 and 80 days, respectively. Specific transcripts were analyzed on enriched samples of cells (astrocytes, microglia and motor neuron) obtained by laser microdissection from the ventral horn of mouse spinal cord. The transcripts Cxcr4, Slc1a2 and Ube2i were evaluated by qPCR in enriched samples of astrocytes of the 40 days old mice, and Cxcr4 and Slc17a6 were analyzed in motor neuron samples at this age. Cxcr4 has been found decreased in astrocytes from transgenic mice and increased in the motor neurons of these animals. Slc1a2, Ube2i and Slc17a6 have increased in the cell type in which they were evaluated in the transgenic mice. Tap2 and Tuba1a were evaluated at microglia enriched samples of 80 days old mice and were found to be increased. Finally, Akt1 has decreased in enriched samples of motor neurons from 80 days old mice. The results suggest that glutamatergic signaling might play essential role in early stages of the disease (40 days), while in phases closer to the appearance of the symptoms (80 days), the neuroimmunomodulation takes place. Thus, this study points to new perspectives for ALS study

O gene SPARC (secreted protein, acidic, cysteine-rich; também denominado de Osteonectina; BM-40) codifica uma proteína de 42kDa, membro de uma família de proteínas matricelular, que interagem com receptores de superfície celular, fatores de crescimento e componentes da matriz extracelular (ECM). SPARC desempenha importante papel no remodelamento de tecidos, migração celular, angiogênese, desenvolvimento embrionário, tumorigênese e quimiosensibilidade. O Docetaxel é um agente anti-microtúbulo pertencente à classe do taxanos, sendo utilizado como uma droga quimioterápica eficaz para o tratamento do câncer da mama avançado. No entanto, é considerável o número de pacientes que não respondem ou adquirem resistência ao tratamento com os taxanos. Os mecanismos envolvidos na resistência ao docetaxel ainda não estão completamente estabelecidos. Em um estudo prévio de nosso grupo, identificamos os transcritos do gene SPARC como diferencialmente expressos em células epiteliais mamárias expressando diferentes níveis de HER-2. No presente estudo, nós avaliamos o efeito da expressão do SPARC na sensibilidade de células de câncer de mama ao Docetaxel. As células MCF-7 foram transfectadas com o vetor de expressão pCMV6-SPARC ou pCMV6-Neo. PCR em tempo real, western blot e imunofluorescência foram utilizados para caracterizar os clones de células com expressão de SPARC. A taxa proliferativa não foi alterada de forma significativa pela expressão de SPARC. No entanto, observou-se um aumento da sensibilidade ao docetaxel em células MCF7 expressando SPARC em comparação com as células MCF7 controle sem expressão de SPARC, indicando que a expressão de SPARC tem propriedades de aumentar a quimiosensibilidade em células de câncer de mama. Utilizamos a técnica de cDNA microarray, para avaliar o perfil de expressão de células MCF7 com expressão de SPARC em comparação com células MCF7 sem expressão de SPARC antes e após tratamento com docetaxel 5nM e 100nM por 24h. Identificamos diversos genes potencialmente envolvidos na quimiosensibilidade ao docetaxel mediada por SPARC. Setenta genes mais diferencialmente expressos (expressão aumentada ou reduzida) foram selecionados a partir dos diferentes tratamentos e várias redes moleculares foram identificadas utilizando o Ingenuity Pathway Analysis (IPA). Após anotação gênica seis genes, SPANXA1, ALDH1A3, TPM4, TARP, XAF1, e WNT5A foram selecionados e validados por qPCR. Utilizando análise proteômica quantitativa livre de marcação avaliamos ainda a ocorrência de alterações proteômicas na comparação das células MCF-7 com super-expressão de SPARC antes e após tratamento com docetaxel. Entre as redes de interação molecular, a via de remodelamento de citoesqueleto foi a via mais abundante observada na comparação entre as células MCF-7 com expressão de SPARC e as células controle sem expressão de SPARC antes do tratamento com docetaxel; e a via do metabolismo de GTP foi a via mais abundante observada na comparação entre as células MCF7 com expressão de SPARC e as células controle sem expressão de SPARC após tratamento com docetaxel. Na integração dos dados de transcriptoma e proteoma identificamos quarenta genes diferencialmente expressos pelas duas abordagens, sendo a via WNT representada entre eles. Nossos resultados sugerem que a expressão SPARC pode influenciar a quimiosensibilidade ao Docetaxel em células MCF-7, modulando genes envolvidos em diversos processos biológicos que podem estar relacionados com a sensibilidade a drogas / The SPARC (secreted protein, acidic, cysteine-rich) gene encodes a 42kDa protein that belongs to a family of matricellular proteins, which interact with cell-surface receptors, growth factors and the ECM (extracellular matrix) components. SPARC plays a role in tissue remodeling, cell migration, angiogenesis, embryonic development, tumorigenesis and chemiosensitivity. Docetaxel, which is an antimicrotubulin agent, is an effective chemotherapeutic drug for the treatment of advanced breast cancer. However, a considerable proportion of breast cancer patients do not respond positively to docetaxel. The mechanisms of docetaxel resistance are poorly understood. In a previous study, we identified SPARC as differentially expressed in mammary epithelial cells expressing different levels of HER-2. In the present study, we evaluate the effects of SPARC over-expression on the sensitivity of breast cancer cells to docetaxel. MCF7 cells were transfected with the expression vector pCMV6-SPARC or pCMV6-Neo. Real time PCR, western blot and immunofluorescence were used to characterize the clones over-expressing SPARC. Proliferation was not significantly affected by SPARC over-expression. However, we observed an increased sensitivity to docetaxel when comparing the MCF7 control cells with the MCF7 cells overexpressing SPARC, indicating that SPARC expression has chemosensitive properties in breast cancer cells. We used cDNA microarray to evaluate the expression profile of MCF7 cells with SPARC overexpression in comparison with MCF7 control cells before and after docetaxel treatment for 24h.We have identified several differentially expressed genes potentially involved in SPARC-mediated chemosensibility to docetaxel. Seventy of the highly expressed genes were selected from all treatments and several molecular networks were identified using the Ingenuity Pathway Analysis (IPA). After manual annotation, six genes, SPANXA1, ALDH1A3, TPM4, TARP, XAF1, and WNT5A, potentially associated with SPARC mediated chemiosensitivity were selected and validated by qPCR. Using label-free approach for quantitative proteomic analysis, we further evaluated the proteomic changes in the comparison of the MCF7 cells control and over-expressing SPARC before and after docetaxel treatment. Among the molecular interaction networks, cytoskeleton remodeling pathway was the top pathway map observed in the comparison between MCF7 cells over-expressing SPARC and the control cells before docetaxel treatment and GTP metabolism pathway was the top pathway map observed in the comparison between MCF7 cells over-expressing SPARC and the control cells after docetaxel treatment. Transcriptome and proteome integrated data, resulted in forty commonly up and down regulated genes, being the WNT pathway represented among them. Our findings suggest that SPARC expression can influence Docetaxel sensitivity in MCF7 cells by modulating genes involved in diverse biologic process that might be related to drug sensitivity

INTRODUÇÃO: O papilomavírus humano (HPV) encontra-se amplamente distribuído na população mundial. Apesar da grande maioria das infecções serem transientes, assintomáticas e passíveis de regressão espontânea, a infecção persistente por tipos de alto risco de HPV é necessária para o desenvolvimento de neoplasias intraepiteliais cervicais. Uma vez que apenas uma pequena parcela das infecções progride à lesões malignas após um longo período desde o diagnóstico inicial de lesões precursoras, tem-se iniciado a busca por fatores que possam influenciar na progressão ou na eliminação destas manifestações iniciais. A variabilidade genética viral tem sido apontada como um dos fatores que interagem neste processo. Embora virtualmente todos os tumores da cérvice uterina apresentem o DNA viral, neoplasias em outros sítios anatômicos têm sido apenas em parte correlacionadas com a presença viral, sendo o HPV proposto como um dos agentes causadores de tumores em sítios de cabeça e pecoço. MÉTODOS: Espécimens clínicos de tumores de cabeça e pescoço, fixados em formalina e contidos em parafina (FFPE), provenientes do Instituto do Câncer do Estado de São Paulo (n=79) e da Santa Casa de Misericórida de São Paulo (n=94), tiveram seu DNA extraído, seguido de diagnóstico e genotipagem de HPV pela metodologia de Inno-LiPA. Análises de linhagens moleculares foram realizadas nas amostras HPV-16 positivas. Análise imunohistoquímica de P16INK4a foi realizada em todas as amostras. RESULTADOS: A presença do DNA viral foi encontrada em 24,1% (19/79) dentre a série de tumores provenientes do ICESP, sendo a cavidade oral o sítio em que foi observada a maior proporção de DNA viral (27,1%), enquanto que 13,8% (13/94) dentre os espécimens provenientes da Santa Casa apresentaram-se positivos para HPV, sendo a cavidade oral o sítio em que foi observada a maior proporção do DNA viral (18,1%). O HPV-16 foi o tipo mais prevalente, detectado em 73,4% das amostras HPV positivas provenientes do ICESP e 61,5% das amostras provenientes da Santa Casa. Independente da Instituição, as amostras foram alocadas no clado das linhagens Asiático-Americana e Europeia em 50%, cada uma, entre os 18 tumores HPV-16 positivos em que as análises de linhagem foram possíveis. Não foi observada, nestas séries, correlação entre a superexpressão de P16INK4a e a presença do DNA viral. CONCLUSÃO: Nas amostras analisadas, o DNA de HPV foi detectado em 18,5% dos 173 espécimens. O HPV-16 foi o tipo mais prevalente. Isolados da linhagem Europeia e da linhagem Asiatico-Americano foram detectados em 50% dos casos, cada uma, dentre as amostras HPV-16 analisadas por este estudo / INTRODUCTION: Human papillomaviruses (HPV) are widely distributed worldwide. Although the majority of infections are usually transient, asymptomatic and frequently regress spontaneously, persistent infections by high-risk HPVs are necessary for the development of cervical intraepithelial neoplasia. Once only a small proportion of infections progress to malignant lesions after a long period of time since the initial diagnosis of precursor lesions, the search for factors that might influence the progression or clearence of these early manifestations are currently under way. Viral genetic variability has been proposed as one of the factors interacting in this process. Although virtually all cervix tumors present the viral DNA, neoplasias from other anatomical sites have been only in part correlated with viral presence, and HPV has been proposed as one causative agent in tumors from head and neck sites. METHODS: Clinical specimens of formalin-fixed paraffin embedded head and neck tumors, provided by the Cancer Institute of São Paulo (n=79) and also by the Santa Casa de Misericórdia de São Paulo (n=94), were submitted to DNA extraction and further HPV diagnostic and genotyping by the Inno-LiPA methodology. Molecular lineages analyses were performed in all HPV-16 positive samples. P16INK4a immunohistochemical analyses were conducted in all samples. RESULTS: HPV DNA was detected among 24.1% (19/79) of samples provided by ICESP, tumors from oral cavity presented the highest viral positivity (27.1%), whereas 13,8% (13/94) of the samples from Santa Casa presented HPV DNA, tumors from the oral cavity also presented the highest HPV positivity with 18.1% of viral DNA presence. HPV-16 was the most prevalent type detected in 73.4% and 61.5% of HPV positive ICESP and Santa Casa samples, respectively. Irrespective of the Institution, samples submitted to lineage analyzes were allocated in the Asiatic-American and European phylogenetic branches in 50%, each one, among the 18 tumors HPV-16 positive for which lineage analysis was possible. No correlation between P16INK4a overexpression and HPV DNA presence was observed. CONCLUSION: In this study, HPV DNA was detected in 18.5% among 173 head and neck tumor specimens. HPV-16 was the most prevalent type. The European and the Asiatic-American lineage were detected in 50% of the cases, each one, among the cases HPV-16 positive analyzed