Orientador: Vera Lúcia Mores Rall / Abstract: Salmonella spp. é uma bactéria entérica, responsável por graves doenças de origem alimentar e um dos principais agentes envolvidos em surtos no mundo todo. A contaminação ocorre, principalmente pelo consumo de carne de frango e ovos, uma vez que esses animais podem ser portadores de vários sorovares patogênicos para o homem. O objetivo do estudo foi avaliar o potencial patogênico de 40 cepas de Salmonella spp., isoladas de esteiras de um abatedouro de aves, por testes fenotípicos de adesão, invasão e produção de biofilme e análise genotípica da presença de vários genes relacionados com fatores de virulência, além de verificar sua persistência no ambiente e sua susceptibilidade a antimicrobianos por disco-difusão. Foi observada resistência à tetraciclina (17,5%) ampicilina (10%), cefotaxima (7,5%), cotrimoxazol (5%) e cloranfenicol (2,5%). Todas as cepas apresentaram os genes invA, sipB, sipD, ssaR, sifA, sitC, iroN, tolC, flgK, fljB e flgL. Os genes sopB e sipA estavam presentes em 92,5% dos isolados, enquanto sopD e spvB foram observados em 90% e 32,5% das cepas, respectivamente. Todos os isolados aderiram e invadiram células HeLa, com índice de invasão variando de 1,4 a 73,8%. Com relação à produção de biofilme, 31 (77,5%) cepas foram capazes de produzir biofilme em microplacas de poliestireno. Pela técnica de eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE), detectou-se a persistência de clones no ambiente por até 18 semanas, entre as 20 amostradas. Não foi possível o estabelec... (Complete abstract click electronic access below) / Resumo: Salmonella spp. is an enteric bacterium responsible for serious foodborne disease, being one of the main agents involved in outbreaks worldwide. Contamination occurs mainly by poultry and egg consumption once these animals carry some pathogenic serotypes for the human being. Our aim was to evaluate the pathogenic potential of 40 strains of Salmonella spp., isolated from poultry slaughterhouse mats, by adhesion and invasion phenotypic tests, and biofilm production, and genotypic analysis to identify genes related to virulence factors, besides we verified its environment persistence and its antimicrobial susceptibility by disc-diffusion. We observed resistance to tetracycline (17.5%), ampicillin (10%), cefotaxime (7.5%), cotrimoxazole (5%) and chloramphenicol (2.5%). All strains possessed invA, sipB, sipD, ssaR, sifA, sitC, iroN, tolC, flgK, fljB and flgL genes. The genes sopB and sipA was present in 92.5% of the isolates, while sopD and spvB were observed in 90% and 32.5% of the strains, respectively. All strains adhered and invaded HeLa cells, with invasion index varying from 1.4 to 73.8%. Regarding to biofilm production, 31 (77.5%) strains were able to produce biofilm on polystyrene microplates. The Pulsed-field gel electrophoresis technique (PFGE) detected the existence of clones in the environment for up to 18 weeks, among de 20 sampled. It was not possible to establish a correlation between adhesion and invasion rates and the presence/absence of effector protein coding ge... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

A presente tese teve como objetivos analisar o padrão de resistência a antimicrobianos de bactérias isoladas de infecções endodônticas agudas por meio de uma revisão sistemática e meta-análise (capítulo 1); identificar e determinar a diversidade genotípica, a sensibilidade bacteriana e os fatores de virulência de anaeróbios facultativos isolados em casos de abscesso apical agudo (capítulo 2); e realizar, por meio de uma proposta de informativo, a difusão de informações geradas com orientações sobre o uso de agentes antibióticos em infecções endodônticas agudas para dentistas e pacientes (capítulo 3). A revisão sistemática foi realizada por meio de pesquisa em base de dados na internet e na literatura cinza até maio de 2015. As normas do PRISMA foram seguidas. Estudos clínicos em humanos que avaliaram o perfil de resistência a antimicrobianos de isolados de infecções endodônticas agudas primárias por meio de métodos laboratoriais foram incluídos. O efeito randômico da Meta-análise foi empregado, e o desfecho foi descrito reunindo as taxas de resistência para cada antibiótico testado. Os dados de sete estudos foram extraídos. A taxa de resistência para 15 diferentes agentes antibióticos foram avaliadas, variando entre 3,5% a 40%. Baixas taxas de resistência foram observadas para amoxicilina + clavulanato e amoxicilina, e altas taxas foram observadas para tetraciclina. No capítulo 2, amostras de canais radiculares foram coletadas de sete dentes com diagnóstico de abscesso apical agudo. Bactérias anaeróbias facultativas foram identificadas com o auxílio de métodos fenotípicos e MALDI-TOF MS. A sensibilidade antimicrobiana das cepas isoladas foi determinada para benzilpenicilina, eritromicina e clindamicina por meio da difusão em disco. Bactérias anaeróbias facultativas foram isoladas de 3 dentes. Streptococcus spp., Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, e Actinomyces viscosus foram identificados. Streptococcus spp. e S. aureus foram sensíveis à benzilpenicilina. E. faecalis (24 cepas) isolados de um mesmo paciente tiveram a sensibilidade antimicrobiana determinada por meio da concentração inibitória mínima para benzilpenicilina, amoxicilina e amoxicilina + clavulanato utilizando-se o E-test. A diversidade genotípica e a presença de fatores de virulência (ace, asa, gelE, efaA, cylA, esp) nas cepas de E. faecalis foi analisada por meio do PFGE e PCR, respectivamente. A expressão da gelatinase e da hemolisina foi testada, e a produção de biofilme quantificada. E. faecalis foram sensíveis aos antibióticos beta-lactâmicos. O mesmo perfil cromossonal de DNA foi revelado para cepas de E. faecalis isoladas. Os genes gelE, ace e efaA foram detectados em 18 cepas. A expressão da gelatinase e a produção de biofilme foram observadas. Cepas de E. faecalis tiveram o mesmo perfil de DNA cromossomal, porém parecem apresentar diferentes perfis de virulência. No capítulo 3 foram apresentadas duas propostas de textos informativos. A primeira com o objetivo de orientar o dentista sobre o uso correto dos antibióticos sistêmicos em endodontia. A segunda visa informar os pacientes sobre a utilização dos antibióticos e esclarecer possíveis dúvidas. / The present thesis aimed to analyze the antimicrobial resistance profile of bacteria isolated from acute endodontic infections through a systematic review and meta-analysis (Chapter 1); to identify and determine the genotypic diversity, antimicrobial susceptibility and virulence factors of isolated facultative anaerobes in isolates from acute apical abscess (Chapter 2); and to provide information for dentist and patients generated from guidelines on the use of antibiotic agents in acute endodontic infections (Chapter 3). The electronic databases and the gray literature were searched up to May 2015 for systematic review. PRISMA guidelines were followed. The clinical studies in of humans that have evaluated the antimicrobial resistance of the isolates of primary acute endodontic infections through laboratorial methods were included. A random effect meta-analysis was employed, and the outcome was described as being the pooled resistance rates for each antimicrobial agent. The data from 7 studies were extracted. The resistance rates for 15 different antimicrobial agents were evaluated, ranging from 3.5% to 40.0%. Lower resistance rates were observed for amoxicillin+clavulanate and amoxicillin, and higher resistant rates were detected for tetracycline. In Chapter 2, root canal samples were collected from seven teeth. Facultative anaerobic bacteria were identified by phenotypic methods and MALDI-TOF MS. Antimicrobial susceptibility of strains was determined to benzylpenicillin, erythromycin and clindamycin by disk-diffusion. Facultative anaerobic bacteria were isolated from 3 teeth. Streptococcus spp., Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, and Actinomyces viscosus were found. Streptococcus spp. and S. aureus were susceptible to benzylpenicillin. E. faecalis strains (n=24) isolated from the same patients had their susceptibility determined by minimum inhibitory concentration of benzylpenicillin, amoxicillin and amoxicillin + clavulanate using the E-test. The genotypic diversity and virulence factors (ace, asa, gelE, efaA, cylA, esp) were analyzed in E. faecalis strains by PFGE and PCR, respectively. Phenotypic expression of gelatinase and cytolysin were tested. Biofilm production was quantified. All the E. faecalis strains were susceptible to β-lactam antibiotics. The same chromosomal DNA fragmentation profile was revealed to E. faecalis strains isolated. The gelE, ace and efaA genes were detected in 18 E. faecalis strains. Gelatinase expression and biofilm production were observed. E. faecalis strains had the same chromosomal DNA profile, but showed virulence profiles different. In Chapter 3, two sugestion for information texts were presented. The first aims to guide dentists on the proper use of systemic antibiotics in endodontics. The second aims to inform patients about the use of antibiotics and clarify possible doubts.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Enterococcus faecalis (E. faecalis), conhecidamente patógeno oportunista, tem sido frequentemente associado a infecções sistêmicas graves. É também encontrado na cavidade oral, com destaque em infecção endodôntica refratária. O objetivo deste estudo foi avaliar características moleculares de E. faecalis isolados de infecção endodôntica primária no Brasil e comparar com isolados orais e não orais de pacientes do Reino Unido e do Japão, assim como E. faecalis resistentes à vancomicina. O presente estudo também investigou o relacionamento entre E. faecalis de diferentes origens (oral e não oral) e de diferentes áreas geográficas para obter uma melhor compreensão do envolvimento dos diferentes reservatórios no surgimento e propagação de clones virulentos, aqueles que possuem genes que conferem infectividade e virulência, assim como resistência aos antibióticos. Para tal, foram estudados E. faecalis isolados em infecções endodônticas no Brasil (n = 20) e orais no Reino Unido (n = 10), e em infecções não orais no Japão (n = 9). Além disso, 20 E. faecalis isolados ambientais do Hospital Universitário de Gales (Cardiff, Reino Unido), classificados como Enterococcus resistentes à vancomicina (VRE) também foram examinados. A Concentração Inibitória Mínima (CIM) dos isolados do Brasil foi obtida pelo método de diluição em agar de acordo com as recomendações do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Reação em cadeia da polimerase (inglês - PCR) foi a técnica empregada para detectar os genes de virulência e aqueles associados à resistência aos antibióticos, enquanto Reação de Amplificação Aleatória de DNA Polimórfico (inglês - RAPD-PCR) foi escolhida para a tipagem molecular. Dentre os genes de virulência examinados, o gene que codifica a gelatinase gelE foi o mais prevalente entre os isolados (77-100%). Entre isolados orais, foram detectados os genes agg de substâncias de agregação, esp de proteína de evasão imune, cylB de citolisina, genes de resistência à tetraciclina tetM e tetL e à eritromicina ermB com diferentes prevalências. Os isolados clínicos hospitalares do Japão apresentaram perfil genético similar aos isolados orais, mas com maior prevalência de ermB e cylB. Todas as amostras de VRE foram positivas para os genes gelE, esp, agg, vanA, ermB e tetM, 95% foram positivos para cylB e 17% positivo para tetL. Todas as amostras foram negativas para ermA, asa373, vanB, vanC1 e vanC2/3. RAPD-PCR revelou agrupamento de VRE em comparação com outros isolados. Neste estudo, os isolados de E. faecalis de infecções orais apresentaram genes de resistência à tetraciclina, um antimicrobiano frequentemente usado no tratamento local de infecções dentárias, abrindo um debate muito importante sobre o papel e a eficácia desta droga para infecções orais. Claramente, são necessários mais estudos nesta área principalmente em relação à expressão de fatores de virulência entre isolados endodônticos para melhor nortear as estratégias de tratamento. As pressões externas no microambiente dos canais radiculares podem ser responsáveis pela seleção de espécies mais resistentes e virulentas. Por fim, embora isolados orais apresentem genes de virulência fundamentais para a patogenicidade, estes foram detectados em menor incidência em comparação com os isolados não-orais e VRE. / Enterococcus faecalis is an opportunistic pathogen known to cause serious systemic infection. It is also encountered in the oral cavity and has been implicated in persistent root canal infection. The aim of this study was to evaluate a range of molecular characteristics of E. faecalis isolated from primary endondontic infections in Brazil and compare to isolates from oral and non-oral infections in patients from UK and Japan, as well as isolates of vancomycin resistant E. faecalis, VRE, from a hospital environment. The present study was undertaken to explore the relatedness of E. faecalis from different origins, oral and non oral, and from different geographic areas to gain a better understanding of the involvement of the different reservoirs in the emergence and spread of virulent clones, those that acquired a number of genes conferring infectivity and virulence and in addition antibiotic resistance. To do this, E. faecalis from oral infections in Brazilian (n=20) and UK patients (n=10), and non-oral infection in japanese patients (n=9) were studied. In addition, 20 environmental VRE isolates from the University Hospital of Wales (Cardiff, UK) were also examined. For braziliam isolates, antimicrobial susceptibility was ascertained by agar dilution, using the recommendations of the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). For all isolates, PCR with validated primers was used to detect genes associated with antibiotic resistance and virulence, whilst RAPD-PCR was used to fingerprint isolates. Of the virulence genes examined, gelatinase gene gelE was most prevalent amongst isolates (77-100%). In the case of oral isolates, the genes of aggregation substances agg, immune evasion protein esp, cytolysin cylB, tetracycline resistance tetM and tetL and erythromycin resistance ermB were detected with varying prevalence. Japanese hospital isolates had a similar genetic profile to oral isolates but with higher prevalence of ermB and cylB. All VRE strains were positive for gelE, esp, agg, vanA, ermB and tetM, 95% were positive for cylB and 17% positive for tetL. All isolates were negative for ermA, asa373 vanB, vanC1 and vanC2/3. RAPD-PCR revealed clustering of VRE compared with other isolates. In this study, isolates of E. faecalis from oral infections showed antibiotic resistance genes for tetracycline, an agent used in the local treatment of dental infection. This opens up a much-needed debate on the role and efficacy of this antibiotic for oral infections. Clearly, more research in this area is required particularly in relation to the possession and expression of virulence factors in the root canal environment, to better inform our management strategies. Environmental pressures in root canals may be responsible for the selection of more resistant species and the possession of virulence determinants. This knowledge is important in guiding procedures for controlling the increasing problem of antibiotic resistance amongst clinically relevant bacteria. Furthermore, whilst oral isolates had genes that could contribute to pathogenicity, these were detected at lower incidence compared with non-oral and VRE isolates.

A presente tese teve como objetivos analisar o padrão de resistência a antimicrobianos de bactérias isoladas de infecções endodônticas agudas por meio de uma revisão sistemática e meta-análise (capítulo 1); identificar e determinar a diversidade genotípica, a sensibilidade bacteriana e os fatores de virulência de anaeróbios facultativos isolados em casos de abscesso apical agudo (capítulo 2); e realizar, por meio de uma proposta de informativo, a difusão de informações geradas com orientações sobre o uso de agentes antibióticos em infecções endodônticas agudas para dentistas e pacientes (capítulo 3). A revisão sistemática foi realizada por meio de pesquisa em base de dados na internet e na literatura cinza até maio de 2015. As normas do PRISMA foram seguidas. Estudos clínicos em humanos que avaliaram o perfil de resistência a antimicrobianos de isolados de infecções endodônticas agudas primárias por meio de métodos laboratoriais foram incluídos. O efeito randômico da Meta-análise foi empregado, e o desfecho foi descrito reunindo as taxas de resistência para cada antibiótico testado. Os dados de sete estudos foram extraídos. A taxa de resistência para 15 diferentes agentes antibióticos foram avaliadas, variando entre 3,5% a 40%. Baixas taxas de resistência foram observadas para amoxicilina + clavulanato e amoxicilina, e altas taxas foram observadas para tetraciclina. No capítulo 2, amostras de canais radiculares foram coletadas de sete dentes com diagnóstico de abscesso apical agudo. Bactérias anaeróbias facultativas foram identificadas com o auxílio de métodos fenotípicos e MALDI-TOF MS. A sensibilidade antimicrobiana das cepas isoladas foi determinada para benzilpenicilina, eritromicina e clindamicina por meio da difusão em disco. Bactérias anaeróbias facultativas foram isoladas de 3 dentes. Streptococcus spp., Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, e Actinomyces viscosus foram identificados. Streptococcus spp. e S. aureus foram sensíveis à benzilpenicilina. E. faecalis (24 cepas) isolados de um mesmo paciente tiveram a sensibilidade antimicrobiana determinada por meio da concentração inibitória mínima para benzilpenicilina, amoxicilina e amoxicilina + clavulanato utilizando-se o E-test. A diversidade genotípica e a presença de fatores de virulência (ace, asa, gelE, efaA, cylA, esp) nas cepas de E. faecalis foi analisada por meio do PFGE e PCR, respectivamente. A expressão da gelatinase e da hemolisina foi testada, e a produção de biofilme quantificada. E. faecalis foram sensíveis aos antibióticos beta-lactâmicos. O mesmo perfil cromossonal de DNA foi revelado para cepas de E. faecalis isoladas. Os genes gelE, ace e efaA foram detectados em 18 cepas. A expressão da gelatinase e a produção de biofilme foram observadas. Cepas de E. faecalis tiveram o mesmo perfil de DNA cromossomal, porém parecem apresentar diferentes perfis de virulência. No capítulo 3 foram apresentadas duas propostas de textos informativos. A primeira com o objetivo de orientar o dentista sobre o uso correto dos antibióticos sistêmicos em endodontia. A segunda visa informar os pacientes sobre a utilização dos antibióticos e esclarecer possíveis dúvidas. / The present thesis aimed to analyze the antimicrobial resistance profile of bacteria isolated from acute endodontic infections through a systematic review and meta-analysis (Chapter 1); to identify and determine the genotypic diversity, antimicrobial susceptibility and virulence factors of isolated facultative anaerobes in isolates from acute apical abscess (Chapter 2); and to provide information for dentist and patients generated from guidelines on the use of antibiotic agents in acute endodontic infections (Chapter 3). The electronic databases and the gray literature were searched up to May 2015 for systematic review. PRISMA guidelines were followed. The clinical studies in of humans that have evaluated the antimicrobial resistance of the isolates of primary acute endodontic infections through laboratorial methods were included. A random effect meta-analysis was employed, and the outcome was described as being the pooled resistance rates for each antimicrobial agent. The data from 7 studies were extracted. The resistance rates for 15 different antimicrobial agents were evaluated, ranging from 3.5% to 40.0%. Lower resistance rates were observed for amoxicillin+clavulanate and amoxicillin, and higher resistant rates were detected for tetracycline. In Chapter 2, root canal samples were collected from seven teeth. Facultative anaerobic bacteria were identified by phenotypic methods and MALDI-TOF MS. Antimicrobial susceptibility of strains was determined to benzylpenicillin, erythromycin and clindamycin by disk-diffusion. Facultative anaerobic bacteria were isolated from 3 teeth. Streptococcus spp., Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, and Actinomyces viscosus were found. Streptococcus spp. and S. aureus were susceptible to benzylpenicillin. E. faecalis strains (n=24) isolated from the same patients had their susceptibility determined by minimum inhibitory concentration of benzylpenicillin, amoxicillin and amoxicillin + clavulanate using the E-test. The genotypic diversity and virulence factors (ace, asa, gelE, efaA, cylA, esp) were analyzed in E. faecalis strains by PFGE and PCR, respectively. Phenotypic expression of gelatinase and cytolysin were tested. Biofilm production was quantified. All the E. faecalis strains were susceptible to β-lactam antibiotics. The same chromosomal DNA fragmentation profile was revealed to E. faecalis strains isolated. The gelE, ace and efaA genes were detected in 18 E. faecalis strains. Gelatinase expression and biofilm production were observed. E. faecalis strains had the same chromosomal DNA profile, but showed virulence profiles different. In Chapter 3, two sugestion for information texts were presented. The first aims to guide dentists on the proper use of systemic antibiotics in endodontics. The second aims to inform patients about the use of antibiotics and clarify possible doubts.

O Actinobaculum suis é um dos principais micro-organismos relacionados a infecções de trato urinário em fêmeas suínas. As características de crescimento deste agente dificultam o isolamento bacteriano tradicional, o que pode tornar a sua prevalência subestimada. Este estudo teve por objetivos desenvolver a reação em cadeia pela polimerase (PCR) para detecção do A. suis, avaliar a sensibilidade e especificidade desta técnica e comparar seu desempenho com o isolamento bacteriano. Além disso, as cepas isoladas foram caracterizadas através do polimorfismo de comprimento de fragmentos amplificados (AFLP) e submetidas à determinação da concentração inibitória mínima para caracterização dos perfis de susceptibilidade antimicrobiana. Foram analisados 45 suabes prepuciais de machos e 192 urinas de fêmeas suínas provenientes de três granjas. Os resultados indicaram que a PCR desenvolvida foi específica para o A. suis e apresentou limiar de detecção entre 1,0 X 101 UF/mL e 1,0 X 102 UFC/mL. A frequência de A. suis encontrada através da PCR foi de 82,2% (37/45) nos suabes prepuciais e de 8,9% (17/192) nas urinas de fêmeas. No que se refere ao isolamento, nenhuma das amostras de urina foi positiva para o agente, enquanto 31,1% (14/45) dos suabes foram positivos. A partir das amostras positivas isoladas dos suabes prepuciais foram selecionadas 20 cepas de A. suis. Os perfis de susceptibilidade entre estas cepas foram semelhantes, no entanto diferiram dos isolados utilizados como controle e provenientes de uma fêmea com infecção urinária. A técnica de PCR foi mais eficiente que o isolamento na identificação de amostras positivas para A. suis. Através do AFLP com uma única enzima foi possível caracterizar todos os isolados e relacionar os dados obtidos com a origem das cepas e o perfil de resistência. Até o presente não há relatos na literatura de caracterização genotípica de A. suis através do AFLP ou detecção do agente através da PCR. / Actinobaculum suis is an important agent related to urinary infection in swine females. The growth characteristics of this agent hamper the traditional bacterial isolation, which can make their prevalence underestimated. The purpose of this study was to develop the polymerase chain reaction (PCR) for Actinobaculum suis detection, to evaluate the sensitivity and specificity of this technique and compare the results with bacterial isolation. Moreover, the isolates were characterized by amplified fragment length polymorphism (AFLP) and subjected to determination of minimum inhibitory concentration for characterization of the antimicrobial susceptibility profiles. Forty-five preputial swabs from boars and a hundred and ninety-two urine samples from sows of three herds were analyzed. The results indicate that the developed PCR was specific for A. suis, presenting a limit detection between 1.0 X 101 UFC/ml and 1.0 X 102 UFC/ml. A.suis frequency by PCR was 82.2% (37/45) in male preputial swabs and 8.9% (17/192) in females urine. Through traditional isolation, none of the urine samples were positive, while A.suis growing was observed in 31.1% (14/45) of the swabs. From the positive samples of the preputial swabs were selected 20 A.suis strains. The susceptibility profiles among these strains were similar, but differed from the female isolates used as control. The PCR technique was more effective than isolation for the A.suis detection. The AFLP with a single enzyme was able to characterize all isolates and relate the data obtained with the strains origin and resistance profile. Until present, there are no reports of genotypic characterization of A. suis strains through AFLP or agent detection by PCR.

Staphylococcus aureus e Streptococcus uberis são dois patógenos causadores mastite bovina que podem apresentar capacidade de produção de biofilme, o que pode resultar em infecções intramamárias crônicas, menor resposta à terapia, redução de produção de leite e maior risco de descarte das vacas infectadas. Os objetivos deste estudo foram avaliar a: 1) capacidade de formação de biofilme de S. aureus e S. uberis isolados de vacas com mastite clínica (MC) e subclínica (MSC); 2) sensibilidade in vitro e a multirresistência destes agentes a antimicrobianos selecionados (n=12); 3) associação entre a capacidade de formação de biofilme e resistência aos antimicrobianos de S. aureus e S. uberis. Um total de 197 cepas S. aureus e 128 S. uberis foram isoladas a partir de amostras de leite de vacas com MSC e MC, oriundas de 24 rebanhos. Os isolados de S. aureus e S. uberis foram avaliados quanto a capacidade de formação de biofilme pelo método??? e a sensibilidade in vitro aos antimicrobianos foi determinada pela técnica de disco difusão em ágar. A capacidade de formação de biofilme foi classificada em 4 categorias: forte, moderado, fraco e não formador de biofilme. Do total de cepas avaliadas, S. aureus (54,8%) e S. uberis (52,9%) apresentaram capacidade de formação de biofilme (forte, moderado ou fraco). Entre os isolados de S. aureus formadores de biofilme, a frequência de distribuição dos isolados foi de 19,3% na categoria forte, 18,8% moderado, e 16,7% na categoria fraco. Para os isolados de S. uberis, a frequência de distribuição entre as categorias de formação de biofilme foi 17,6% forte, 25,2% moderado, 17,6% fraco. Dentre as cepas de S. aureus isoladas de casos de MC, 55,8% foram classificados como forte formador de biofilme, enquanto 7,6% das cepas isoladas de MSC apresentaram capacidade de formação de biofilme. Todos os isolados de S. uberis (n=30; 100%) provenientes de MC apresentaram capacidade de formação de biofilme na categoria moderado. Quanto à sensibilidade aos antimicrobianos, os isolados de S. aureus apresentaram resistência à penicilina (92,9%), ampicilina (50,8%) e tetraciclina (18,3%); e os isolados de S. uberis apresentaram resistência à penicilina (86,5%), oxacilina (85,5%), tetraciclina (37,5%). Os isolados de S. aureus apresentaram maior chance de resistência aos antimicrobianos ampicilina, tetraciclina e ceftiofur que S. uberis. Em conclusão, S. aureus e S. uberis apresentam elevada capacidade de produção de biofilme, mas não houve interação entre a característica de multirresistência e formação de biofilme. Isolados de S. aureus e S. uberis foram altamente resistentes aos antimicrobianos das classes de beta-lactâmicos e tetraciclinas. / Staphylococcus aureus and Streptococcus uberis are both mastitis causing pathogens that can present ability to produce biofilm, which can result in chronic intramammary infection, reduced response to the therapy, reduction of milk yield, and greater risk of cows\' culling. The objectives of this study were to evaluate the: 1) biofilm-forming capacity of S. aureus and S. uberis isolated from clinical (CM) and subclinical mastitis (SCM); in vitro sensibility and multi-resistance of these agents to the antimicrobials; 3) association between the biofilm-forming capacity and antimicrobial resistance. A total of 197 S. aureus and 128 S. uberis were isolated from milk samples collected from cows with SCM and CM from 24 dairy herds. The biofilm-forming ability were classified in 4 categories: strong, moderate, weak, and non-biofilm producers. Of all isolates evaluated, S. aureus (54.8%) and S. uberis (52.9%) presented biofilm-forming ability (strong, moderate or weak). Among the biofilm-forming isolates, the frequency of distribution of S. aureus was 19.3% for the strong, 18.8% for the moderate, and 16.7% for the weak categories. For the S. uberis isolates, the frequency of distribution among the biofilm-forming categories was 17.6% strong, 25.2% moderate, and 17.6% weak. In relation to the mastitis presentation form, the strong biofilm-forming category had 55.8% of S. aureus isolates from CM cases; and among all biofilm-forming categories, the strong category was the one with the higher number of isolates of S. aureus (n=43; 19,2%). All S. uberis isolates (n=30; 100%) from CM presented moderate biofilm-forming ability. In relation to the antimicrobial susceptibility, the isolates of S. aureus were resistant to penicillin (92.9%), ampicillin (50.8%) and tetracycline (18.3%); and the isolates of S. uberis presented resistance to penicillin (86.5%), oxacillin (85.5%) and tetracycline (37.5%). The isolates of S. aureus and S. uberis, S. aureus had higher odds to be resistant to ampicillin, tetracycline and ceftiofur than S. uberis. In conclusion, S. aureus and S. uberis presented high ability of production of biofilm, but there was no interaction between multi-resistance and biofilm production ability. Isolates of S. aureus and S. uberis were highly resistant to antimicrobials of the class of beta lactams and tetracycline.

abstract: Cytometry is a method used to measure and collect the physical and chemical characteristics of a population of cells. In modern medical settings, the trend of precision and personalized medicines has imposed a need for rapid point-of-care diagnostic technologies. A rapid cytometric method, which aims at detecting and analyzing cells in direct patient samples, is therefore desirable. This dissertation presents the development of light-scattering-based imaging methods for detecting and analyzing cells and applies the technology in four applications. The first application is tracking phenotypic features of single particles, thereby differentiating bacterial cells from non-living particles in a label-free manner. The second application is a culture-free antimicrobial susceptibility test that rapidly tracks multiple, antimicrobial-induced phenotypic changes of bacterial cells with results obtained within 30 – 90 minutes. The third application is rapid antimicrobial susceptibility testing (AST) of bacterial cell growth directly in-patient urine samples, without a pre-culture step, within 90 min. This technology demonstrated rapid (90 min) detection of Escherichia coli in 24 clinical urine samples with 100% sensitivity and 83% specificity and rapid (90 min) AST in 12 urine samples with 87.5% categorical agreement with two antibiotics, ampicillin and ciprofloxacin. The fourth application is a multi-dimensional imaging cytometry system that integrates multiple light sources from different angles to simultaneously capture time-lapse, forward scattering and side scattering images of blood cells. The system has demonstrated capacity to detect red blood cell agglutination, assess red blood cell lysis, and differentiate red and white blood cells for potential implementation in clinical hematology analyses. These large-volume, light-scattering cytometric technologies can be used and applied in clinical and research settings to study, detect, and analyze cells. These studies developed rapid point-of-care diagnostic and imaging technologies for collectively advancing modern medicine and global health. / Dissertation/Thesis / Doctoral Dissertation Chemistry 2020

Orientador: Margarete Teresa Gottardo de Almeida / Banca: Ana Marisa Fusco Almeida / Banca: Mara Correa Lelles Nogueira / Resumo: As leveduras estão amplamente distribuídas em diversos ambientes, sendo também habitantes normais do corpo humano. São consideradas patógenos oportunistas causando infecções que variam desde superficiais até profundas e fatais. Espécies de Candida spp ocupam, atualmente, lugar de destaque como principais causadoras das infecções a corrente sanguínea. A investigação da suscetibilidade antimicrobiana, frente aos antifúngicos rotineiramente preconizados na terapêutica, é de fundamental importância, além disso, métodos moleculares como o RAPD (Polimorfismo do DNA aleatoriamente amplificado) e PFGE (Eletroforese em campo pulsátil) são conhecidos por ajudar na identificação das fontes de infecção e delineamento epidemiológico. O Laboratório de Microbiologia da FAMERP, em parceria com o Hospital de Base de São José do Rio Preto, vem desenvolvendo projetos de pesquisa que envolve o isolamento, a identificação e manutenção de coleção de culturas de espécies microbianas. O presente projeto teve como objetivo identificar as espécies leveduriformes presentes em isolados clínicos e ambientais, avaliar a sua suscetibilidade antimicrobiana, além de estudar a relação genética entre tais isolados por ambas técnicas - RAPD e PFGE, na tentativa de elucidar as possíveis fontes de aquisição, prática considerada fundamental na rede de vigilância. No período de agosto de 2007 a outubro de 2009, foram analisados 119 episódios de candidemia. A distribuição dos casos de candidemia foi mais frequente em pacientes com idade inferior a 1 ano e superior a 60 anos, não havendo tendência para nenhum gênero. O grupo geral manteve como período de internação uma média de 35 dias, com frequência de óbito correspondente a 61%. C. albicans foi a espécie mais prevalente (29%), seguida por C. parapsilosis (28%) e C. tropicalis (23%)... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: As leveduras estão amplamente distribuídas em diversos ambientes, sendo também habitantes normais do corpo humano. São consideradas patógenos oportunistas causando infecções que variam desde superficiais até profundas e fatais. Espécies de Candida spp ocupam, atualmente, lugar de destaque como principais causadoras das infecções a corrente sanguínea. A investigação da suscetibilidade antimicrobiana, frente aos antifúngicos rotineiramente preconizados na terapêutica, é de fundamental importância, além disso, métodos moleculares como o RAPD (Polimorfismo do DNA aleatoriamente amplificado) e PFGE (Eletroforese em campo pulsátil) são conhecidos por ajudar na identificação das fontes de infecção e delineamento epidemiológico. O Laboratório de Microbiologia da FAMERP, em parceria com o Hospital de Base de São José do Rio Preto, vem desenvolvendo projetos de pesquisa que envolve o isolamento, a identificação e manutenção de coleção de culturas de espécies microbianas. O presente projeto teve como objetivo identificar as espécies leveduriformes presentes em isolados clínicos e ambientais, avaliar a sua suscetibilidade antimicrobiana, além de estudar a relação genética entre tais isolados por ambas técnicas - RAPD e PFGE, na tentativa de elucidar as possíveis fontes de aquisição, prática considerada fundamental na rede de vigilância. No período de agosto de 2007 a outubro de 2009, foram analisados 119 episódios de candidemia. A distribuição dos casos de candidemia foi mais frequente em pacientes com idade inferior a 1 ano e superior a 60 anos, não havendo tendência para nenhum gênero. O grupo geral manteve como período de internação uma média de 35 dias, com frequência de óbito correspondente a 61%. C. albicans foi a espécie mais prevalente (29%), seguida por C. parapsilosis (28%) e C. tropicalis (23%)... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Water scarcity is an issue faced across the globe that is only expected to worsen in the coming years. We are therefore in need of methods for treating non-traditional sources of water. One promising method is desalination of brackish and seawater via reverse osmosis (RO). RO, however, is limited by biofouling, which is the buildup of organisms at the water-membrane interface. Biofouling causes the RO membrane to clog over time, which increases the energy requirement of the system. Eventually, the RO membrane must be treated, which tends to damage the membrane, reducing its lifespan. Additionally, antifoulant chemicals have the potential to create antimicrobial resistance, especially if they remain undegraded in the concentrate water. Finally, the hazard of chemicals used to treat biofouling must be acknowledged because although unlikely, smaller molecules run the risk of passing through the membrane and negatively impacting humans and the environment. It is, therefore, integral to investigate techniques for prevention of biofouling and removal of mature biofilms that are effective, less damaging to the membrane, and safe for humans and the environment. A common experimental setup is biofilm antimicrobial microdilution susceptibility tests. To acquire meaningful data from these tests, however, appropriate organisms must be tested. Manuscripts 1 investigates, via semi-systematic reviews, the question of what organisms are appropriate to represent the complexity of a biofilm in antimicrobial tests. Ultimately, we recommend utilizing the model biofilm-forming, pioneer organism, Pseudomonas aeruginosa for these studies. Biofouling studies also must present data in a useful manner to the many disciplines that are interested in preventing or removing biofouling. Our goal is to investigate both via antimicrobial microdilution susceptibility tests. In Manuscript 2 we investigate the metrics of each discipline with an interest in anti-biofouling studies. Ultimately we recommend utilizing both crystal violet stain to assess total biomass removal and the LIVE/DEAD BacLight stain to assess cell vitality (including log reduction and MIC, BPC, MBIC, MBC, BBC, and MBEC), to satisfy the metrics of all interested disciplines. Finally, in Manuscript 3 we implement the recommendations from Manuscripts 1-2 for biofilm prevention and biofilm removal antimicrobial microdilution susceptibility tests. In this manuscript, we work with a subset of safer preservatives including, methylisothiazolinone, phenoxyethanol, and sodium benzoate. We found that methylisothiazolinone was the most effective antimicrobial, however, it was not the safest. Additionally, we investigated the relationship between MBIC and BPC, which was found to vary between the preservatives. Ultimately, we have provided recommendations for biofilm antimicrobial susceptibility tests that produce widely applicable and useful metrics, as well as utilized these recommendations to investigate the efficacy of safer antimicrobials. All of this work provides a framework for which even safer and effective novel antimicrobials can be investigated. / Graduate / 2021-07-22

Os plásticos são moléculas poliméricas de cadeia longa. O plástico é versátil, leve, flexível, resistente à umidade, forte e economicamente viavel. Essas qualidades atraentes levam a um consumo excessivo de bens plásticos. No entanto, eles são duráveis e muito dificeis de degradar pelo que os materiais plásticos que são usados na fabricação de tantos produtos se tornam resíduos com poder de permanência. Nossa tremenda atração pelo plástico, juntamente com uma propensão inegável de consumir cada vez mais, descartar, jogar lixo e, assim, poluir, tornou-se uma combinação de natureza letal. A produção anual de plásticos duplicou nos últimos 15 anos, alcançando 245 milhões de toneladas, portanto, uma grande quantidade de plásticos é acumulada no meio ambiente gerando problemas ecológicos. O objetivo do presente estudo foi isolar bactérias de um aterro sanitário e de uma amostra de água contaminada com diesel com potencial para degradar o polietileno e outros plásticos, como o polivinil e o poliuretano. Essas bactérias foram isoladas em Ribeirão Preto, SP, utilizando filmes dos três tipos de plástico como fonte de carbono e meio mínimo de sais (MMS). Após a extração do DNA genômico foi utilizada a técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) para detectar o gene alkB e as bactérias que apresentaram esse gene foram identificadas e incubadas com os filmes dos plásticos (polietileno, poliuretano e policloreto de vinil) e o meio MMS (90mL) por 6 meses. Após a incubação foram realizadas as análises de perda de peso, dos espectros obtidos por Espectroscopia de Infravermelho com Transformada Fourier (EIVTF) e das micrografias obtidas por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) para avaliar a capacidade de biodegradação dos isolados. Foram realizados também testes de suscetibilidade antimicrobiana para conhecer o perfil de resistência dos isolados. Dois isolados bacterianos apresentaram o gene alkB e foram identificados como Paenibacillus sp. S5 e Bacillus cereus A1, respectivamente, utilizando o sequenciamento do gene 16S rDNA. Após o período de incubação foi detectada uma diferença significativa no peso final em relação ao peso inicial para os 3 tipos de plástico e também foram observadas alterações químicas pela EIVTF, como o aparecimento de novos grupos funcionais e rupturas de ligações, sendo essas alterações mais evidentes para os filmes de polietileno. Através da MEV foram visualizadas mudanças físicas, como formação de poros e fissuras, e colonização bacteriana na superfície plástica em todos os casos, especialmente nos filmes de polietileno. Os resultados mais promissores foram obtidos com o isolado Paenibacillus sp. S5, na biodegradação dos três plásticos testados. Esse isolado apresentou suscetibilidade a todos os antibióticos testados, exceto para amicacina e B. cereus A1 foi resistente a 7 dos 12 antibióticos testados. Portanto, as bactérias do presente estudo, especialmente o Paenibacillus sp. S5 podem ser utilizadas em processos de biodegradação para a eliminação de plásticos do meio ambiente. / Plastics are man-made long chain polymeric molecules. Plastic is versatile, lightweight, flexible, moisture resistant, strong, and relatively inexpensive. Those are the attractive qualities that lead us, around the world, to such a voracious appetite and over-consumption of plastic goods. However, durable and very slow to degrade, plastic materials that are used in the production of so many products all, ultimately, become waste with staying power. Our tremendous attraction to plastic, coupled with an undeniable behavioral propensity of increasingly over-consuming, discarding, littering and thus polluting, has become a combination of lethal nature. The annual production of plastics has doubled over the past 15 years to 245 million tons due to their great physical and chemical properties, thus a large amount of plastic gets accumulated in the environment generating plastic waste ecological problems. The purpose of this study was to isolate bacteria from a waste disposal area and also from diesel contaminated water with potential to degrade polyethylene and other plastics as polyvinyl and polyurethane. These bacteria were isolated in Ribeirão Preto, SP, Brazil using plastic discs as a carbon source and a minimal salt medium (MSM). After genomic DNA extraction, PCR reactions were performed to detect the alkB gene and bacteria that showed this gene were identified and incubated with plastic discs (polyethylene, polyurethane and polyvinyl chloride 5cm discs) and MSM (90mL) for 6 months. After incubation, lose weight measurement analysis, Fourier Transforms Infra-red (FT-IR) analysis, Scanning Electron Microscopy (SEM) analysis and antimicrobial susceptibility tests were performed to evaluate the biodegradation capacity and the resistance profile of the isolates. Five bacteria were isolated from soil however, only one showed the alkB gene. From water just one bacterium was isolated which presented the alkB gene. These bacteria were identified as Paenibacillus sp. S5 and Bacillus cereus A1 respectively using the 16S rDNA gene sequencing. A significant difference in final weight compared to initial weight was assessed for the 3 types of plastic in both cases. Chemical changes were observed by FTIR. The appearance of new functional groups and bond scissions were more evident for polyethylene films. SEM visualized physical changes, such as formation of pits and cracks, and bacterial colonization on the plastic surface in all cases especially for polyethylene films. Biodegradation experiments demonstrated the best results for Paenibacillus sp. S5 for the three plastics tested. Paenibacillus sp. S5 showed susceptibility to all antibiotics tested except to amikacin and B. cereus A1 was resistance to seven from 12 antibiotics tested. Hence these bacteria, especially Paenibacillus sp. S5 can be used for biodegradation process as a promising tool for the elimination of plastic from the environment