Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandar@gmail.com) on 2013-09-16T18:37:13Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_Med_Silvana Conceição.pdf: 993066 bytes, checksum: ac16fedc0180b5cad548853e0231eb14 (MD5) / Approved for entry into archive by Flávia Ferreira (flaviaccf@yahoo.com.br) on 2013-10-31T17:04:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação_Med_Silvana Conceição.pdf: 993066 bytes, checksum: ac16fedc0180b5cad548853e0231eb14 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-31T17:04:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_Med_Silvana Conceição.pdf: 993066 bytes, checksum: ac16fedc0180b5cad548853e0231eb14 (MD5) / Tropical Medicine Research Center (TMRC); Instituto Nacional de Ciências e Tecnologia de Doenças Tropicais (INCT-DT); Bolsa de Estudo da CNPq; NIH - National Institute of Health (Grant P50AI30639-16 e R03AI067663-02). / Introdução: A primeira linha de tratamento da leishmaniose tegumentar americana (LTA) é baseada nos derivados do antimonial. A refratariedade ao antimônio é frequente entre os pacientes com LTA. Leishmania (Viannia) braziliensis é a principal causa de LTA no Brasil. A L. (V.) braziliensis causa três formas de leishmaniose na Bahia: leishmaniose cutânea localizada (LC), a mais comum com pequenas lesões auto curáveis até as formas mais grave e de difícil tratamento, a leishmaniose mucosa (LM), e a leishmaniose disseminada (LD). Métodos e Resultados: Neste estudo, foram incluídos 91 casos de LTA (67 LC, 7 LM e 17 LD) de uma região endêmica para L. (V.) braziliensis, chamada Corte de Pedra (CP), no estado da Bahia/Brasil, e os quais apresentaram culturas de parasítos positivas. Foram avaliados: (1) associação entre o genótipo de L.(V) braziliensis e a resposta dos pacientes ao antimoniato de meglumina (Glucantime®); (2) a distribuição geográfica dos pacientes refratários ao glucantime dentro da região afetada; e (3) a resistência da L. (V.) braziliensis ao Glucantime® in vitro. Os parasitas foram genotipados com base no sequenciamento de um único locus polimórfico (que começa na posição 3074 do cromossomo 24) desta população de L. (V.) braziliensis. Para a avaliação da distribuição geográfica dos casos responsivos e refratários, as coordenadas geográficas dos locais de moradia dos pacientes foram adquiridas por GPS e comparados usando o teste de Cusick and Edwards. As coordenadas dos locais de moradia dos pacientes foram plotadas em uma foto de satélite da região para inspeção visual, usando o sistema de informação geográfica (SIG). Foi encontrado que a refratariedade é amplamente distribuída na região, quase que uniformemente, contudo não foi possível detectar associações entre os genótipos dos parasitos e a resposta ao tratamento. A sensibilidade ao antimônio foi avaliada expondo as formas promastigotas da L.(V) braziliensis a concentrações crescentes do antimoniato de meglumina (Glucantime®) in vitro. Os parasitos de pacientes com LM e LD foram significantemente mais resistentes ao antimonial do que aqueles isolados dos casos de LC. Assim, a resistência ao antimônio observada in vitro está de acordo com o que tem sido observado em campo, onde os pacientes com LM e LD tendem a ter uma resposta menor ao tratamento com Glucantime® do que os indivíduos com LC. Embora não tenha sido encontrada associação entre as cepas parasitárias e a resposta ao tratamento nestes pacientes com LTA, na genotipagem dos isolados foi usado um único locus, o qual certamente limitou o poder discriminatório da técnica. Conclusão: Nos estudos futuros, estas associações devem ser repetidas aplicando mais loci polimórficos na genotipagem dos isolados de L. (V.) braziliensis de Corte de Pedra. / Salvador

Submitted by Yanka Senna (yanks_senna@hotmail.com) on 2017-08-31T17:38:23Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_Fabiane Veloso Soares_2017.pdf: 10987048 bytes, checksum: 4d648cdcf1bd7c3458e8993b00a110b2 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-08-31T18:31:19Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_Fabiane Veloso Soares_2017.pdf: 10987048 bytes, checksum: 4d648cdcf1bd7c3458e8993b00a110b2 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-08-31T18:33:17Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_Fabiane Veloso Soares_2017.pdf: 10987048 bytes, checksum: 4d648cdcf1bd7c3458e8993b00a110b2 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-31T18:33:17Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_Fabiane Veloso Soares_2017.pdf: 10987048 bytes, checksum: 4d648cdcf1bd7c3458e8993b00a110b2 (MD5) Previous issue date: 2017-07-11 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Cutaneous leishmaniasis is a neglected disease, endemic in tropical and subtropical areas, and Brazil is one of the countries most affected by the disease. Treatment with pentavalent antimonials has been used for over 70 years as the first choice drug in the country and has been shown to be ineffective against some Leishmania species. In addition to toxic, it presents in injectable form, offers a wide spectrum of adverse effects and still represents a high acquisition cost for the country. Consequently, there is an immediate need for research into new antileishmania compounds in order to combat resistance to the drugs used and to demonstrate efficacy and safety in order to facilitate the treatment of the disease. Nanoparticles (NPs) promise an alternative approach to new drugs in the treatment of infectious diseases because their small size and large surface area provide an opportunity for them to interact with vital components of infectious agents, and are more effective than traditional therapies. In this study, pentavalent antimony NPs (Sb+5 NPs) were produced and characterized in order to evaluate their effect in vitro and in vivo in the treatment of cutaneous leishmaniasis. The concentration of Sb+5 was determined by graphite furnace atomic absorption spectrometry; The NPs were characterized by dynamic light scattering (DLS) and transmission electron microscopy (TEM), submitted to in vitro bioassays against promastigotes and amastigotes of Leishmania amazonensis, by the direct counting method in the Neubauer chamber and To cytotoxic activity in J774 lineage macrophages. In the in vivo assay, the hamsters (Mesocricetus auratus) experimentally inoculated with L. amazonensis were grouped to receive intralesional (snout) treatment, with subsequent euthanasia for removal of tissue fragments for analysis by impression by apposition, culture of lesion biopsy, histopathology And MET. The results obtained in this study showed NPs with mean size of 42 nanometers and zeta potential around -49.8 mV, spherical shape, smooth surface and dispersed in suspensions. Bioassays indicated that these NPs showed cytotoxicity at the highest concentrations tested. The most promising suspension was ETSbL2, which had the highest antileishmania activity, with EC50 of 1.05 mg/mL in 72h. The persistence of infection in experimentally infected macrophages when treated with Sb5 + NPs was not noted. After 26 days of experimental treatment, the animals had statistically significant differences between the control group and the groups treated with NPs, regarding the area and clinical aspect of the lesion, and regarding the parasitic control. The histological findings of the lesions of the groups treated with these Sb+5 NPs showed intense inflammatory infiltrate, compromising both the dermosuperficial layer and the dermoprofound of the tissue. Histological changes were also observed in the liver, spleen and kidney. However, ETSbL1[b] (18.6 mg/Sb5+/kg/day) showed greater efficiency in clinical cure regarding reduction in lesion size and parasitic load among the NPs tested. These results suggest the continuity of this study with new tests in animals less susceptible to infection (mice) aiming at a possible clinical and parasitological cure, as well as the evaluation of toxicological and biochemical parameters after treatment. / A leishmaniose tegumentar é uma doença negligenciada, sendo endêmica em áreas tropicais e subtropicais do mundo. O Brasil é um dos países mais acometidos pela doença. O tratamento com antimoniais pentavalente é utilizado há mais de 70 anos como medicamento de primeira escolha no país e tem se mostrado ineficaz contra algumas espécies de Leishmania. Além de tóxico, este se apresenta na forma injetável, oferece um amplo espectro de efeitos adversos e representa ainda alto custo de aquisição para o país. Consequentemente, existe uma necessidade imediata de pesquisas para novos compostos antileishmania, a fim de combater a resistência aos medicamentos utilizados, e que demonstre eficácia e segurança, visando de facilitar o tratamento da doença. Nanopartículas (NPs) prometem uma abordagem alternativa para novas drogas no tratamento de doenças infecciosas, pois sua pequena dimensão e grande área de superfície proporcionam uma oportunidade para que elas interajam com componentes vitais de agentes infecciosos, apresentando-se mais eficazes que as terapias tradicionais. Neste estudo NPs de antimônio pentavalente (NPs Sb+5) em fase aquosa foram produzidas e caracterizadas, com o objetivo de avaliar seu efeito in vitro e in vivo no tratamento da leishmaniose cutânea. A concentração do Sb+5 foi determinada por espectrometria de absorção atômica em forno de grafite; as NPs foram caracterizadas por espalhamento dinâmico de luz (Dinamic Light Scattering – DLS) e microscopia eletrônica de transmissão (MET) e submetidas a bioensaios in vitro contra formas promastigotas e amastigotas de Leishmania amazonensis, pelo método da contagem direta em câmara de Neubauer e quanto à atividade citotóxica em macrófagos de linhagem J774. No ensaio in vivo, os hamsters (Mesocricetus auratus) experimentalmente inoculados com L. amazonensis foram agrupados para receber tratamento intralesional (focinho), com posterior eutanasia para retirada de fragmentos de tecidos para análise por impressão por aposição, cultivo de biópsia de lesões, histopatologia e MET. Os resultados obtidos neste estudo mostraram NPs com tamanho médio de 42 nanomêtros e potencial zeta em torno de -49,8 mV, formato esférico, superfície lisa e dispersas nas suspensões. Os bioensaios indicaram que essas NPs apresentaram citotoxicidade nas concentrações mais altas testadas. A suspensão mais promissora foi a ETSbL2 que apresentou maior atividade antileishmania, com CE50 de 1.05 mg/mL em 72h. Não foi notada a permanência de infecção nos macrófagos experimentalmente infectados quando tratados com NPs Sb5+. Após 26 dias de tratamento experimental, os animais apresentaram diferenças estatísticas significantes entre o grupo controle e os grupos tratados com NPs, quanto à área e aspecto clínico da lesão, e quanto ao controle parasitário. Os achados histológicos das lesões dos grupos tratados com essas NPs Sb+5mostraram infiltrado inflamatório intenso, comprometendo tanto a camada dermosuperficial como a dermoprofunda do tecido. Alterações histológicas também foram observadas no fígado, baço e rim. Contudo, ETSbL1[b] (18,6mg/Sb5+/kg/dia) apresentou maior eficiência quanto a cura clínica referente a redução no tamanho da lesão e na carga parasitária entre as NPs testadas. Estes resultados sugerem a continuidade deste estudo com novos testes em animais menos suscetíveis a infecção (camundongos) objetivando uma possível cura clínica e parasitológica, bem como a avaliação dos parâmetros toxicológicos e biquimicos após o tratamento.

Submitted by Vasti Diniz (vastijpa@hotmail.com) on 2017-09-04T14:34:21Z No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 3127119 bytes, checksum: 5c890bb880fcbd5cc7d5f5f36f11e4f1 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-04T14:34:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 3127119 bytes, checksum: 5c890bb880fcbd5cc7d5f5f36f11e4f1 (MD5) Previous issue date: 2017-02-16 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Treatment with antimonials has several limitations, among them the progressive emergence of parasites resistant to these drugs. In this situation, recent evidence suggests that the parameters antimonial resistance and virulence may be correlated in Leishmania sp. have been published in the literature. In this context, this work aimed to investigate whether there is a correlation between virulence and resistance to trivalent antimonial (SbIII) from two clinical isolates of Leishmania (Viannia) braziliensis, named AF and JCTS. Promastigote forms of these parasites resistant to SbIII were selected, obtaining cultures with a resistance level corresponding to 14 and 13 times the wild-type IC50 (sensitive to SbIII) for the isolates AF and JCTS, respectively. When analyzing the stability of the phenotype of acquired resistance, it was verified that both clinical isolates presented an unstable profile, with progressive reversion of resistance after successive passages in drug absence. In morphological analysis, it was observed that two cultures resistant to SbIII presented higher amount of promastigote forms with metacyclic characteristics when compared to sensitive cultures. However, the growth in culture medium was similar for sensitive and resistant cultures of both clinical isolates. In stationary phase of growth, the percentage of serum that caused 50% of cellular lysis (EC50) of the AF culture sensitive to SbIII was 2.3%, whereas the corresponding drug resistant culture presented EC50 9.4%. Similarly, the sensitive and SbIII resistant JCTS cultures showed EC50 2.5% and 18.4%, respectively. Thus, cultures resistant to SbIII from both clinical isolates were more resistant to complement-mediated lysis than drug-sensitive cultures SbIII resistant cultures also showed greater in vitro virulence on murine macrophages when compared to the corresponding sensitive cultures. The infection rate determined for sensitive and resistant SbIII AF was 260 and 593. For sensitive and resistant SbIII JCTS was 115 and 207, respectively. In the model of infection in vivo in swiss mice, no significant virulence was evident in any culture of L. braziliensis. Thus, we conclude that there is a correlation between parameters of in vitro virulence and resistance to SbIII in L. braziliensis. / O tratamento com os antimoniais possui várias limitações, dentre elas o crescente surgimento de parasitos resistentes a estas drogas. Agravando esta situação, recentes evidências de que os parâmetros resistência a antimoniais e virulência possam estar correlacionados em Leishmania sp. têm sido publicadas na literatura. Dentro deste contexto, este trabalho objetivou investigar se existe correlação entre os parâmetros de virulência e resistência ao antimonial trivalente (SbIII) a partir de dois isolados clínicos de Leishmania (Viannia) braziliensis denominados AF e JCTS. Foram selecionadas formas promastigotas destes parasitos resistentes ao SbIII, obtendo-se culturas com um nível de resistência correspondente a 14 e 13 vezes a IC50 da cultura selvagem (sensível ao SbIII) para os isolados AF e JCTS, respectivamente. Ao analisar a estabilidade do fenótipo de resistência adquirido, verificou-se que ambos os isolados clínicos apresentaram um perfil instável, com progressiva reversão da resistência após sucessivos repiques na ausência da droga. Em análise morfológica, foi possível observar que as duas culturas resistentes ao SbIII apresentaram maior quantidade de formas promastigotas com características de metacíclicas quando comparado com as culturas sensíveis. Contudo, o perfil de crescimento em meio de cultivo foi semelhante para as culturas sensíveis e resistentes de ambos os isolados clínicos. Em fase estacionária de crescimento, a porcentagem de soro que causou 50% de lise celular (EC50) da cultura AF sensível ao SbIII foi de 2,3%, enquanto que a correspondente cultura resistente à droga apresentou EC50 de 9,4%. De modo semelhante, as culturas JCTS sensível e resistente ao SbIII apresentaram EC50 de 2,5% e 18,4%, respectivamente. Assim, as culturas resistentes ao SbIII, de ambos os isolados clínicos, foram mais resistentes à lise mediada pelo sistema complemento do que as culturas sensíveis à droga. As culturas resistentes ao SbIII também apresentaram maior virulência in vitro sobre macrófagos murinos quando comparadas às correspondentes culturas sensíveis. O índice de infecção determinado para AF sensível e resistente ao SbIII foi de 260 e 593. Para JCTS sensível e resistente ao SbIII foi de 115 e 207, respectivamente. No modelo de infecção in vivo em camundongos suíços não foi evidenciada virulência significativa em nenhuma das culturas de L. braziliensis. Dessa forma, conclui-se que há uma correlação entre parâmetros de virulência in vitro e resistência ao SbIII em L. braziliensis.

Submitted by Vasti Diniz (vastijpa@hotmail.com) on 2017-09-08T12:54:48Z No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1516121 bytes, checksum: 772d5ba3351de06ed346dc46430f7188 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-08T12:54:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1516121 bytes, checksum: 772d5ba3351de06ed346dc46430f7188 (MD5) Previous issue date: 2016-03-02 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The first-line drugs in Brazil for leishimaniasis treatment is the pentavalent antimonial, considered a prodrug because it is converted in trivalent (SbIII) during the treatment which presents many limitations, including the rising of the resistant parasite. Seeking to understand of these resistance effects in Leishmania (L.) amazonensis, promastigotes forms were cultured in glowing concentrations of SbIII then 2 mutants were selected, SbIII 1 and SbIII2 that gain resistance, respectively, 15,8 and 22,5 times bigger than wild cultures'. The morphological analysis show significant diferences in mutant's form and size when compared with the wild ones, once it has a long and slender cell body and with a long flagellum, while the majority mutants, with a resistance level 6,42 (SbIII 1) and 5,62 (SbIII 2) times bigger, presented a rounded cell body, with long flagellum. Curiously, when the mutants obtain a resistance level 15,8 (SbIII 1) e 22,5 (SbIII 2) times bigger, the morphological diference diminishes. The resistance phenotype to the SbIII manifested itself also in the amastigote like derived of both mutants. The SbIII 2 mutant presented a more stable profile of resistance than SbIII 1 one's when cultured in the absence of the drug, which denote diferences in the resistance mechanism. There was not observed cross-resistance to Amphotericin B. The promastigote forms of both mutants showed theirselves significantly more resistant to lysis throught the complement system, compared to the wild one's, sugesting that the parameter to the resistance to the antimonials and virulance might be correlated in Leishmania (L.) amazonensis. / A droga de primeira escolha para o tratamento das leishmanioses no Brasil é um antimonial pentavalente, considerado uma pró-droga por ser convertido na forma trivalente (SbIII) durante o tratamento, o qual apresenta várias limitações, incluindo o crescente surgimento de parasitos resistentes. Buscando compreender os efeitos desta resistência em Leishmania (L.) amazonensis, formas promastigotas foram cultivadas em concentrações crescentes de SbIII e selecionados dois mutantes, SbIII 1 e SbIII 2, que adquiriram, respectivamente, um nível de resistência 15,8 e 22,5 vezes maior que o apresentado pelas culturas selvagens. A análise morfológica mostrou diferenças significantivas no tamanho e formato dos mutantes em relação ao tipo selvagem, visto que estas apresentaram corpo celular alongado, delgado e com flagelo longo, enquanto que a maioria dos mutantes, com um nível de resistência 6,42 (SbIII 1) e 5,62 (SbIII 2) vezes maior, apresentaram um corpo celular arredondado, com flagelo alongado. Curiosamente, quando os mutantes adquiriram um nível de resistência 15,8 (SbIII 1) e 22,5 (SbIII 2) vezes maior, esta diferença morfológica diminuiu. O fenótipo de resistência ao SbIII se manifestou também nas formas amastigotas axênicas derivadas dos dois mutantes. O mutante SbIII 2 apresentou um perfil de resistência mais estável que o SbIII 1 quando cultivado na ausência da droga, o que pode indicar diferenças nos mecanismos de resistência. Não foi observada resistência cruzada com o fármaco Anfotericina B. As formas promastigotas dos dois mutantes mostraram-se significativamente mais resistentes à lise pelo sistema complemento, comparado aos selvagens, sugerindo que os parâmetros resistência a antimoniais e virulência podem estar correlacionados em Leishmania (L.) amazonensis.