Zugl.: Berlin, Humboldt-Univ., Diss., 2008

Zugl.: Bonn, Univ., Diss., 2008

Zugleich: Diss. Berlin, 2008. / Mit kurzem engl. Abstract. Literaturverz.

Gestörte Proliferations- und Differenzierungsprozesse in Keratinozyten spielen eine wichtige Rolle in der Pathogenese vieler Hauterkrankungen. Intrazelluläre Signalmechanismen, die die korrekte Balance zwischen epidermaler Proliferation und Differenzierung aufrecht halten, sind bis jetzt größtenteils unbekannt. Einer dieser ausschlaggebenden Transkriptionsfaktoren ist der Nukleäre Faktor-kappaB (NF-kB). Uns interessierte der Einfluss des IKK/IkBa/NF-kB-Signalweges auf das intrinsische Differenzierungsprogramm von Keratinozyten. Mittels retroviraler Infektion wurden sowohl in primären Keratinozyten als auch in HaCaT verschieden mutante Formen von Faktoren des NF-kB-Signalweges eingebracht: dominant negative (dn) Formen der IKK1 und IKK2, eine konstitutiv aktive Form der IKK2 (IKK2 EE) und eine nicht-degradierbare Form des Inhibitors IkBa. Zusätzlich wurden auch pharmakologische Inhibitoren von NF-kB (BAY 11-7082 und SC-514) untersucht. Die Funktionalität der Mutanten wurde im Westernblot durch Analyse der IkBa Degradation überprüft. Anschließend wurde die Differenzierung der Keratinozyten durch Erhöhung des extrazellulären Calciums induziert. Der Grad der Differenzierung wurde durch morphologische Studien und Untersuchung der Expression der Differenzierungs-marker p21 und Involucrin untersucht. Im Gegensatz zu Ergebnissen aus Tiermodellen, konnten wir keine Effekte der mutierten IkB Kinasen 1 und 2 auf die Calcium-induzierte in vitro Differenzierung beobachten. Jedoch wurde die Aktivierung inflammatorischer Gene, gemessen an der Induktion von ICAM-1 und IL-8 nach TNF-a Stimulation, vollständig in den IKK2 KD und mut IkBa exprimierenden Zellen inhibiert. In der Zelllinie, welche die entsprechende IKK1 Mutante trug, wurde deren Expression nur teilweise geblockt. Zusammenfassend lässt sich aus unseren Ergebnissen schließen, dass zumindest in vitro IKK1 und IKK2 nicht an der Regulation des Calcium-induzierten intrinsischen Differen-zierungsprozesses von Keratinozyten beteiligt sind, jedoch eine zentrale Rolle in der inflammatorischen Aktivierung dieser Zellen spielen. / Disturbed proliferation and differentiation processes of keratinocytes play a major role in the pathogenesis of many skin diseases. Intracellular signalling mechanisms which regulate the balance between epidermal proliferation and differentiation, however, are thus far largely unknown. Earlier reports suggest a role for the transcription factor nuclear factor–kappaB (NF-kB) in such processes. Here we attempted to analyze the impact of the IKK/IkBa/NF-kB signalling pathway on the intrinsic differentiation process of keratinocytes. Primary human keratinocytes as well as HaCaT cells were retrovirally infected to express different mutant forms of components of the IKK/NF-kB pathway: dominant negative (dn) mutants of NF-kB upstream kinases IKK1 and IKK2, a constitutive active form of IKK2 (IKK2 EE), and a non degradable mutant form of IkBa. In addition, pharmacological inhibitors of the pathway such as BAY 11-7082 and SC-514 were analysed. Proper functionality of the generated mutants was subsequently confirmed by Western blot analysis monitoring induced IkBa degradation. Thereafter, differentiation of keratinocytes was induced by elevation of extracellular calcium levels. The differentiation state of keratinocytes was then assessed by studying morphology and expression of differentiation markers such as p21 as well as involucrin. In contrast to data reported from animal models, we could not detect any effects of mutated IKK1 or IKK2 on the calcium-induced intrinsic differentiation program in keratinocytes. However, inflammatory activation of keratinocytes as measured by TNF-a-mediated up-regulation of ICAM-1 and IL-8 was almost completely inhibited in cells expressing dn IKK2 and the IkBa mutant form whereas it was only partly blocked in IKK1dn cells. In conclusion, our data suggest that, in least in vitro, IKK1 and IKK2 are not involved in the regulation of calcium-induced keratinocyte differentiation while they are pivotal for inflammatory activation of these cells.

Die Impuls-Antwort-Analyse – auch Schockanalyse genannt – stellt eine wichtige Möglichkeit der vertiefenden Analyse von vektorautoregressiven (VAR) Modellen dar. Bei der Schätzung der Impuls-Antwort-Folgen müssen die Zeitreiheneigenschaften der zugrundeliegenden Daten berücksichtigt werden. Weisen die Zeitreihen stochastische Trends auf und sind die Zeitreihen kointegriert, kann die Impuls-Antwort-Analyse auf der Basis eines kointegrierenden VAR-Modells (VECM) erfolgen. Pesaran und Shin (1998) entwickelten die verallgemeinerten (Generalized) Impuls-Antwort-Funktionen, um den Mangel der fehlenden Eindeutigkeit der orthogonalen Schockanalyse zu umgehen. Am Beispiel der Variablen einer Konsumfunktion für Deutschland werden die auf der Grundlage eines Vektor-Fehlerkorrekturmodells berechneten verallgemeinerten Impuls-Antwort-Folgen den orthogonalen gegenübergestellt.

Zugl.: Heidelberg, Univ., Magisterarbeit

The effect of normothermic (36.2°C ± 0.6°C) cardiopulmonary bypass (CPB) on splanchnic blood flow (SBF), splanchnic oxygen transport (DO2 spl) and splanchnic oxygen consumption (VO2 spl), splanchnic lactate uptake and gastric mucosal pH (pHi) was studied in 12 male patients (ejection fraction 0.4) undergoing coronary artery bypass grafting. SBF was estimated by the constant-infusion indocyanine green (ICG) technique using a hepatic venous catheter. DO2spl, VO2spl and splanchnic lactate uptake were calculated using the Fick principle after the induction of anaesthesia, during aortic cross-clamping, after CPB, and 2 and 7 h after admission to the intensive care unit (ICU). SBF, DO2spl and VO2spl did not decrease during CPB but increased after ICU admission, whereas pHi decreased 7 h after ICU admission. Initial ICG extraction was 0.78, which decreased to 0.54 during aortic cross-clamping and remained low thereafter. During normothermic cardiopulmonary bypass there was no deterioration of global splanchnic oxygen supply. The increased arterial blood lactate concentrations were not associated with a decreased splanchnic lactate uptake and are not the result of a decreased gasrointestinal blood flow. Increased blood lactate concentrations and decreased pHi and ICG extraction fraction are consistent with a systemic inflammatory response to CPB.

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Der Umgang mit ionisierender Strahlung in der medizinischen Diagnostik und Therapie ge-winnt ständig an Bedeutung. Welche Auswirkungen dabei geringe Dosen ionisierender Strahlung auf biologische Systeme haben, ist daher relevant und Gegenstand der Forschung. Die Adaptive Antwort kann in der Strahlenbiologie den Niedrig-Dosis-Effekten zugeordnet werden. Dieser Effekt, der auch als Präkonditionierung bezeichnet wird, beschreibt den protektiven Effekt, den eine niedrig dosierte Vorbestrahlung auf eine hoch dosierte Folgebestrahlung hat. Die Adaptive Antwort lässt sich beispielsweise durch Reduzierung von DNA-Schäden oder ein verbessertes Zellüberleben nachweisen. Die protektive Wirkung vor einer hohen Dosis tritt nur in einem begrenzten Zeitfenster zur Vorbestrahlung auf. In dieser Arbeit erfolgte der Nachweis der Adaptiven Antwort an Rattenschilddrüsenzellen, die über einen Natriumiodidsymporter (NIS) verfügen. Nach einer niedrig dosierten Vorbestrahlung und einem bestimmten Erholungsintervall erfolgte dazu jeweils eine zweite Bestrahlung mit einer therapeutisch wirksamen Dosis. Als biologischer Endpunkt wurde das klonogene Zellüberleben (Koloniebildungstest) gewählt. Die Bestrahlung erfolgte mit Röntgenstrahlung und 99mTc. Das 99mTc wird über den NIS in die Zellen aufgenommen. Diese intrazelluläre Radionuklidaufnahme kann durch Zugabe von Perchlorat fast vollständig blockiert werden. So konnte mit 99mTc sowohl ein intrazellulärer als auch ein extrazellulärer Bestrahlungsmodus realisiert werden. Durch die Untersuchung des Uptakes wurde jeweils das Ausmaß der intrazellulären Radionuklidaufnahme bestimmt. Ziel dieser Arbeit war es, die Adaptive Antwort durch Kombination und Variation der Bestrahlungssequenzen Rönt-genstrahlung, 99mTc und 99mTc mit Perchlorat nachzuweisen. Zur Einschätzung der Radiotoxizität wurden Dosis-Wirkungs-Kurven der Bestrahlungsmoda-litäten erstellt. Dabei konnten linear-quadratische bzw. lineare Dosis-Wirkungs-Beziehungen nachgewiesen werden. Die intrazelluläre Aufnahme von 99mTc führte im Vergleich zur extra-zellulären Bestrahlung durch Inkubation mit Perchlorat bei gleichen Aktivitätskonzentrationen zu stark verminderten Überlebensfraktionen. Die Ergebnisse wurden verwendet, um geeignete Dosisbereiche zum Nachweis der Adaptiven Antwort zu ermitteln. Die Adaptive Antwort wurde zunächst durch zweimalige Bestrahlung durch die gleiche Strah-lenqualität nachgewiesen. Für Röntgenstrahlung, 99mTc und 99mTc mit Perchlorat wurden je-weils die Vorbestrahlungsdosen von 0,01 Gy bis 0,75 Gy und die Erholungszeiten von 2 h bis 24 h untersucht. Nachbestrahlt wurde bei Röntgenstrahlung und 99mTc mit 2 Gy und bei 99mTc mit Perchloratinkubation mit 1 Gy. Der Nachweis eines höheren Zellüberlebens durch die Vorbestrahlung gelang bei allen drei Bestrahlungsmodalitäten. Die Adaptive Antwort war jeweils bei 0,025 Gy und 0,05 Gy Vorbestrahlungsdosis und nach 6 h Erholungszeit am stärksten ausgeprägt. Nach 10 h war jeweils keine protektive Wirkung nach Vorbestrahlung mehr nachweisbar. Im Folgenden wurden die Bestrahlungsmodalitäten untereinander variiert. So wurde Rönt-genstrahlung mit 99mTc, sowie Röntgenstrahlung mit 99mTc und Perchlorat kombiniert und die Sequenzen jeweils variiert. Als Vorbestrahlungsdosen wurden 0,025 Gy und 0,05 Gy gewählt. Die Zeitfenster zwischen Vor- und Nachbestrahlung betrugen 4 h; 6 h und 24 h. Bei allen 4 Kombinationen konnte nach 6 h Erholungszeit eine Adaptive Antwort nachgewiesen werden. Die größte protektive Wirkung konnte in allen Versuchen durch 0,05 Gy Vorbestrahlung erreicht werden. Entsprechend der Zielsetzung konnte in dieser Arbeit die Adaptive Antwort unabhängig von der Bestrahlungsmodalität und deren Sequenz bei Vor- und Nachbestrahlung nachgewiesen werden. Insbesondere gelangen der Vergleich und die Kombination aus extra- und intrazellu-lärer Bestrahlung. Es konnte bestätigt werden, dass der durch die Vorbehandlung induzierte protektive Effekt nur in einem begrenzten Zeitfenster bestehen bleibt. Des Weiteren zeichnete sich eine Abhängigkeit des Ausmaßes der Adaptiven Antwort von der Vorbestrahlungsdosis ab. Die Ergebnisse bestätigen die aktuell anerkannte Hypothese, die die Adaptive Antwort als Teil einer allgemeinen Stressantwort der Zelle auf verschiedene Noxen sieht (Calabrese, et al., 2007). Im Hinblick auf moderne Therapieansätze in der Onkologie, wie CIERT oder der Radiorezeptortherapie, ist der Einfluss der Niedrig-Dosis-Effekte, wie der Adaptiven Antwort, auf das Behandlungsergebnis jedoch eher vernachlässigbar. Die angewandte Induktionsdosis sowohl durch eine Röntgenuntersuchung als auch durch eine Szintigraphie ist zu gering bzw. bei der fraktionierten Strahlentherapie zu hoch, um eine Adaptive Antwort zu induzieren. Weiterhin ist das Zeitfenster für die Ausbildung der Protektion in der Praxis nicht gegeben.