Orientador: José Maurício Sforcin / Resumo: A própolis é um produto resinoso, elaborado pelas abelhas a partir de diferentes partes das plantas, e se destaca por suas inúmeras propriedades biológicas, e pela possibilidade de aplicação na indústria farmacêutica. Recentemente, nosso grupo tem estudado sua ação sobre monócitos – células do sistema fagocítico mononuclear que exercem importante função na resposta imune. Neste projeto, visamos investigar a possível ação moduladora da própolis na apresentação de antígenos por monócitos humanos, utilizando um antígeno infeccioso (subunidade B da enterotoxina termolábil de Escherichia coli - EtxB), um antígeno tumoral (MAGE-1), o ácido retinóico (AR) e lipopolissacarídeo (LPS), simultaneamente ou não a própolis, avaliando o possível efeito citotóxico dos tratamentos, a expressão de receptores celulares (TLR-2, TLR-4, HLA-DR, CD40, CD80) e a produção de citocinas (TNF-α, IL-6, IL-10 e IL-12). A modulação da autofagia foi avaliada através da expressão de genes que codificam as proteínas Beclin-1 e LC3-II, utilizando a rapamicina simultaneamente ou não a própolis. A própolis não alterou a viabilidade dos monócitos humanos e exerceu efeito citoprotetor nas células incubadas com os estímulos. A própolis manteve a expressão basal dos receptores de superfície celular; porém, em associação com MAGE-1 e LPS, diminuiu a expressão de CD40 estimulada pelos antígenos isoladamente. Em associação com AR, a própolis manteve a ação do antígeno sobre os receptores. Já a associação da própolis co... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

Após a resposta imune, a expansão dos linfócitos T CD4 é seguida de uma fase de retração chamada Morte Celular induzida por Ativação (AICD), para que a homeostasia seja reestabelecida. Nosso grupo demonstrou que DCs estimuladas com LPS produzem PGE2 que inibe a expressão de FASL e bloqueia a AICD dos linfócitos T CD4. Nossa hipótese é que a apresentação de antígenos em contexto de infecção tenha um impacto na expressão de FASL e na sobrevivência das células T CD4, de maneira dependente de TLRPGE2. Para comprovar nossa hipótese nós estudamos a apresentação de OVA in vitro e in vivo. Observamos que a adição de LPS durante a apresentação de OVA aumenta a ativação e proliferação das células T CD4 específicas. O pré-tratamento dos camundongos com Indometacina, um inibidor da enzima COX, reduz a frequência das células específicas através do aumento na expressão de FASL e da apoptose, mas sem interferir com a proliferação. Nós sugerimos que a PGE2 produzida em resposta ao LPS regule a sobrevivência dos linfócitos T CD4 durante a persistência do estímulo antigênico. / After immune response, expansion of antigen-specific CD4 T cells is followed by a contraction phase due to Activation-Induced Cell Death (AICD) to reestablish homeostasis. Our group demonstrated that LPS stimulated-DCs produce PGE2 that protects CD4 T cells from AICD by preventing TCR/CD3-mediated FASL upregulation. Our hypothesis is that antigen presentation in the context of infection impacts on FASL expression and survival of CD4 T cells, dependently on TLR-mediated PGE2 release. To approach our hypothesis we studied OVA presentation in vitro and in vivo. We observed that the addition of LPS during OVA presentation increased specific CD4+ T cells activation and proliferation. Pretreatment of mice with indomethacin, an inhibitor of COX enzyme, reduces the frequency of specific T cells by increasing FASL expression and apoptosis, but did not interfere with proliferation. We suggest that PGE2 produced in response to LPS regulates the survival of CD4 T lymphocytes during persistent antigen stimulation.

Os fibrócitos foram inicialmente identificados pelo seu recrutamento rápido para os tecidos lesionados e por atuar diretamente na resposta imune através do reconhecimento, apresentação antigênica e produção de citocinas e quimiocinas. Segundo Grab (2004) fibrócitos podem participar da resposta imune na leishmaniaose e por isso no presente estudo propomos analisar a resposta celular e apresentação antigênica dos fibrócitos na infecção por L. (L.) amazonensis. Para os experimentos in vivo camundongos C57BL/6 e knockout para o receptor TLR-2 foram inoculados na derme auricular com 105 formas promastigotas de L. (L.) amazonensis e 1, 7, 15 dias após a infecção as regiões de inóculo e os linfonodos foram retirados e processados para citometria de fluxo. Para os experimentos in vitro fibrócitos foram obtidos de mononucleares do sangue periférico de camundongos C57BL/6. Os fibrócitos foram avaliados quanto às suas características morfológicas e fenotípicas, infecção, expressão de MHC-II/B7-1/B7-2 e ativação de linfócitos T CD4+. As análises na região de inóculo mostraram o aumento no percentual de fibrócito na derme de camundongos após 15 dias de infecção tanto em animais C57BL/6 quanto em animais KO TLR-2. Neste sítio, os fibrócitos produziram citocinas e expressaram MHC-II, B7-1 e B7-2 podendo participar da resposta imune. As análises no linfonodo mostraram a existência de um alto percentual de fibrócitos nos animais controle, contudo, após infecção este percentual foi reduzido. Após infecção verificamos que os fibrócitos de animais WT C57BL/6 foram capazes de produzir as citocinas IL-4, IL-10 e IFN- durante o primeiro dia. Entretanto, na ausência de TLR-2 os fibrócitos presentes no linfonodo produziram TNF-α e IFN- que podem estar relacionadas com a ativação celular e aumento da capacidade de apresentação antigênica destas células durante a infecção. No linfonodo verificamos que os fibrócitos podem participar da apresentação antigênica após a infecção por L. (L.) amazonensis. Contudo, nos linfonodos de animais WT C57BL/6 observamos a redução significativa no percentual destas células expressando MHC-II e B7-1, o que pode estar relacionada a presença do TLR-2. Nos ensaios in vitro fibrócitos de camundongos C57BL/6 apresentaram alta capacidade endocítica, eliminaram os parasitas nas primeiras 24 horas de infecção, expressaram MHC-II/B7-1/B7-2 e foram capazes de ativar linfócitos T CD4+. Com isso, nossos resultados sugerem que os fibrócitos podem atuar na resposta celular e na apresentação antigênica durante a infecção por L. (L.) amazonensis, contudo estas funções podem ser moduladas pela participação do TLR-2 e pelo microambiente onde estes se encontram. / Fibrocytes were initially identified by their fast recruitment to the injured tissues and by acting directly on the immune response through recognition, antigen presentation and production of cytokines and chemokines. According to Grab et al., 2004 fibrocytes may participate in the immune response to leishmaniasis and therefore, in this study we propose to examine the cellular response and antigen presentation of fibrocytes in infection by L. (L.) amazonensis. In vivo experiments C57BL/6 and knockout receptor TLR-2 animals were inoculated in the ear dermis with 105 promastigotes of L. (L.) amazonensis and 1,7, 15 days after infection ears and lymph nodes were removed and processed for flow cytometry. For in vitro experiments peripheral blood fibrocytes from C57BL/6 mice were evaluated for their morphological and phenotypic, MHC-II/B7-1/B7-2 expression and ability to activate CD4+ T cells. The analyses in the inoculum region showed significant increase in the percentage of fibrocyte in the C57BL/6 and TLR-2 knockout mice after 15 days of infection. At this site fibrocytes part of the immune response by cytokines production and MHC-II, B7-1 and B7-2 expression. The analyses in the lymph node showed the existence of a high percentage of fibrocytes in the control animals, however, after infection, this percentage was reduced. After infection it was verified that the fibrocytes of C57BL/6 were able to produce cytokines IL-4, IL-10 and IFN- during the first days. However, in the absence of TLR-2 fibrocytes in the lymph produced TNF-α and IFN- that may be related to cell activation and increased antigen presentation capacity of these cells during infection. In the lymph node it was found that fibrocytes may participate in antigen presentation after infection with L. (L.) amazonensis. However, in lymph nodes of mice C57BL/6 it was observed the significant reduction in the percentage of those cells expressing MHC-II, B7-1, which can be related to the presence of the TLR-2. In vitro fibrocytes of C57BL/6 showed high endocytic capacity, eliminating the parasites within the first 24 hours after infection, and expressed MHC-II/B7-1/B7-2 being were able to activate CD4 + T cells. Thus, our results suggest that fibrocytes may act in cellular response and antigen presentation during infection by L. (L.) amazonensis, however these functions can be modulated by the involvement of TLR-2 and the in microenvironment.

Os fibrócitos foram inicialmente identificados pelo seu recrutamento rápido para os tecidos lesionados e por atuar diretamente na resposta imune através do reconhecimento, apresentação antigênica e produção de citocinas e quimiocinas. Segundo Grab (2004) fibrócitos podem participar da resposta imune na leishmaniaose e por isso no presente estudo propomos analisar a resposta celular e apresentação antigênica dos fibrócitos na infecção por L. (L.) amazonensis. Para os experimentos in vivo camundongos C57BL/6 e knockout para o receptor TLR-2 foram inoculados na derme auricular com 105 formas promastigotas de L. (L.) amazonensis e 1, 7, 15 dias após a infecção as regiões de inóculo e os linfonodos foram retirados e processados para citometria de fluxo. Para os experimentos in vitro fibrócitos foram obtidos de mononucleares do sangue periférico de camundongos C57BL/6. Os fibrócitos foram avaliados quanto às suas características morfológicas e fenotípicas, infecção, expressão de MHC-II/B7-1/B7-2 e ativação de linfócitos T CD4+. As análises na região de inóculo mostraram o aumento no percentual de fibrócito na derme de camundongos após 15 dias de infecção tanto em animais C57BL/6 quanto em animais KO TLR-2. Neste sítio, os fibrócitos produziram citocinas e expressaram MHC-II, B7-1 e B7-2 podendo participar da resposta imune. As análises no linfonodo mostraram a existência de um alto percentual de fibrócitos nos animais controle, contudo, após infecção este percentual foi reduzido. Após infecção verificamos que os fibrócitos de animais WT C57BL/6 foram capazes de produzir as citocinas IL-4, IL-10 e IFN- durante o primeiro dia. Entretanto, na ausência de TLR-2 os fibrócitos presentes no linfonodo produziram TNF-α e IFN- que podem estar relacionadas com a ativação celular e aumento da capacidade de apresentação antigênica destas células durante a infecção. No linfonodo verificamos que os fibrócitos podem participar da apresentação antigênica após a infecção por L. (L.) amazonensis. Contudo, nos linfonodos de animais WT C57BL/6 observamos a redução significativa no percentual destas células expressando MHC-II e B7-1, o que pode estar relacionada a presença do TLR-2. Nos ensaios in vitro fibrócitos de camundongos C57BL/6 apresentaram alta capacidade endocítica, eliminaram os parasitas nas primeiras 24 horas de infecção, expressaram MHC-II/B7-1/B7-2 e foram capazes de ativar linfócitos T CD4+. Com isso, nossos resultados sugerem que os fibrócitos podem atuar na resposta celular e na apresentação antigênica durante a infecção por L. (L.) amazonensis, contudo estas funções podem ser moduladas pela participação do TLR-2 e pelo microambiente onde estes se encontram. / Fibrocytes were initially identified by their fast recruitment to the injured tissues and by acting directly on the immune response through recognition, antigen presentation and production of cytokines and chemokines. According to Grab et al., 2004 fibrocytes may participate in the immune response to leishmaniasis and therefore, in this study we propose to examine the cellular response and antigen presentation of fibrocytes in infection by L. (L.) amazonensis. In vivo experiments C57BL/6 and knockout receptor TLR-2 animals were inoculated in the ear dermis with 105 promastigotes of L. (L.) amazonensis and 1,7, 15 days after infection ears and lymph nodes were removed and processed for flow cytometry. For in vitro experiments peripheral blood fibrocytes from C57BL/6 mice were evaluated for their morphological and phenotypic, MHC-II/B7-1/B7-2 expression and ability to activate CD4+ T cells. The analyses in the inoculum region showed significant increase in the percentage of fibrocyte in the C57BL/6 and TLR-2 knockout mice after 15 days of infection. At this site fibrocytes part of the immune response by cytokines production and MHC-II, B7-1 and B7-2 expression. The analyses in the lymph node showed the existence of a high percentage of fibrocytes in the control animals, however, after infection, this percentage was reduced. After infection it was verified that the fibrocytes of C57BL/6 were able to produce cytokines IL-4, IL-10 and IFN- during the first days. However, in the absence of TLR-2 fibrocytes in the lymph produced TNF-α and IFN- that may be related to cell activation and increased antigen presentation capacity of these cells during infection. In the lymph node it was found that fibrocytes may participate in antigen presentation after infection with L. (L.) amazonensis. However, in lymph nodes of mice C57BL/6 it was observed the significant reduction in the percentage of those cells expressing MHC-II, B7-1, which can be related to the presence of the TLR-2. In vitro fibrocytes of C57BL/6 showed high endocytic capacity, eliminating the parasites within the first 24 hours after infection, and expressed MHC-II/B7-1/B7-2 being were able to activate CD4 + T cells. Thus, our results suggest that fibrocytes may act in cellular response and antigen presentation during infection by L. (L.) amazonensis, however these functions can be modulated by the involvement of TLR-2 and the in microenvironment.

Após a resposta imune, a expansão dos linfócitos T CD4 é seguida de uma fase de retração chamada Morte Celular induzida por Ativação (AICD), para que a homeostasia seja reestabelecida. Nosso grupo demonstrou que DCs estimuladas com LPS produzem PGE2 que inibe a expressão de FASL e bloqueia a AICD dos linfócitos T CD4. Nossa hipótese é que a apresentação de antígenos em contexto de infecção tenha um impacto na expressão de FASL e na sobrevivência das células T CD4, de maneira dependente de TLRPGE2. Para comprovar nossa hipótese nós estudamos a apresentação de OVA in vitro e in vivo. Observamos que a adição de LPS durante a apresentação de OVA aumenta a ativação e proliferação das células T CD4 específicas. O pré-tratamento dos camundongos com Indometacina, um inibidor da enzima COX, reduz a frequência das células específicas através do aumento na expressão de FASL e da apoptose, mas sem interferir com a proliferação. Nós sugerimos que a PGE2 produzida em resposta ao LPS regule a sobrevivência dos linfócitos T CD4 durante a persistência do estímulo antigênico. / After immune response, expansion of antigen-specific CD4 T cells is followed by a contraction phase due to Activation-Induced Cell Death (AICD) to reestablish homeostasis. Our group demonstrated that LPS stimulated-DCs produce PGE2 that protects CD4 T cells from AICD by preventing TCR/CD3-mediated FASL upregulation. Our hypothesis is that antigen presentation in the context of infection impacts on FASL expression and survival of CD4 T cells, dependently on TLR-mediated PGE2 release. To approach our hypothesis we studied OVA presentation in vitro and in vivo. We observed that the addition of LPS during OVA presentation increased specific CD4+ T cells activation and proliferation. Pretreatment of mice with indomethacin, an inhibitor of COX enzyme, reduces the frequency of specific T cells by increasing FASL expression and apoptosis, but did not interfere with proliferation. We suggest that PGE2 produced in response to LPS regulates the survival of CD4 T lymphocytes during persistent antigen stimulation.

Submitted by Caroline Falcao (caroline.rfalcao@ufpe.br) on 2017-04-06T16:41:38Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2011-tese-WanúziaKeylaMirandaMoreira.pdf: 4609405 bytes, checksum: 9cc969ee66d9060546cf0a2611ca597b (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-06T16:41:38Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2011-tese-WanúziaKeylaMirandaMoreira.pdf: 4609405 bytes, checksum: 9cc969ee66d9060546cf0a2611ca597b (MD5) Previous issue date: 2011-12-15 / As lesões pré-neoplásicas e neoplásicas do colo uterino induzidas pelo Papilomavírus humano (HPV) estão relacionadas a falhas nos mecanismos imunes de apresentação antigênica. Ciente que alterações na expressão das proteínas do sistema HLA constituem um fator de risco para o desenvolvimento do câncer de colo uterino, o presente estudo teve como objetivo avaliar a expressão da proteína HLA-DRB1 nas células de Langerhans em portadoras de lesões intraepiteliais cervicais, relacionando-a aos tipos de HPV. Esteestudo foi realizado no Centro Especializado de Diagnóstico do Câncer do estado da Paraíba, no período de janeiro de 2009 a janeiro de 2010 e aprovado pelo comitê de ética. Neleforam incluídas 123 portadoras de lesão de baixo grau e 105 de lesão de alto grau, confirmadas histologicamente depois de submetidas à colposcopia com biópsia e coleta de amostra para PCR. Obtiveram-se três secções histológicas: uma para diagnóstico histopatológico e duas para imuno-histoquímica usando-se o S100 e HLA-DRB1. A imunoexpressão foi quantificada por morfometria através de software específico e relacionadas ao tipo de HPV usando-se o teste U de Mann-Whitney. Para relacionar as atipias epiteliais ao tipo de HPV usou-se o teste qui-quadrado. Nestetrabalho, apenas tipos virais de alto risco foram identificados predominando o 16 (48,1%), 18 (24,6%) e 31 (19,3%), inclusive em lesões intraepiteliais de baixo grau. Constatou-se menor imunoexpressão da HLA-DR que da S100. As portadoras do HPV 31 mostraram redução estatisticamente significativa da expressão de HLA-DRB1, contudo,não houve diferença estatísticamente significativa na expressão de HLA-DRB1 entre lesões intraepiteliais de baixo e alto grau. As portadoras de lesão intraepitelial com PCR negativas igualmente apresentaram expressão de HLA-DRB1. O presente estudo possibilitou observar que a expressão da proteína HLA-DRB1 nas células de Langerhans se mostrou reduzida nas lesões intraepiteliais induzidas pelo HPV 31. / Cervical intraepithelial lesions induced by Human papillomavírus are related to failure in antigen presentation mechanisms. Aware that changes in HLA protein expression is a risk factor for the development of cervical cancer, the aim of this study is to evaluate the HLA-DRB1 expression on Langerhans cells in women with intraepithelial lesions and oncogenic HPV types. ThisstudywasconductedatSpecializedCenterforCancerDiagnosisofParaíba, during January 2009 still January 2010andapprovedbytheethicscommittee. Were included 123 patients with low grade SIL and 105 with high-grade SIL, histopathologically confirmed after undergoing colposcopy with biopsy and PCR collects. Three histological sections were obtained: one for histolopathologic diagnostic and two for immunohistochemistry using S100 and HLA-DRB1. The immunostaining was quantified by morphometry using specific software and related to HPV type by U Mann- Whitney test. To relate HPV type with epithelial atypia was used qui-square test. In thiswork,only high-risk HPV were identified, predominantly 16(48,1%), 18(24,6%) e 31(19,3%), even in low grade intraepithelial lesions. The immunoexpression of S100 was higher than HLA-DRB1. There was no difference on HLA-DRB1 expression between low and high grade intraepithelial lesions. The bearers of intraepithelial lesions with negative PCR also demonstrated HLA-DRB1 expression. Patients with 31 HPV showed a significantly lower expression of HLA-DRB1. Thus, thisstudyallowedobserving that the expression of HLA-DRB1 showed to be reduced in cervical lesions induced by 31 HPV.