Orientadoesr: Elias Basile Tambourgi, Ranulfo Monte Alegre / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química / Made available in DSpace on 2018-08-16T02:07:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Padilha_GiovanadaSilva_D.pdf: 2518753 bytes, checksum: 6b6f99c293a070aff342e419f243fe69 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo : O presente trabalho foi dividido em três etapas e teve como objetivo a caracterização, purificação e encapsulamento da lípase a partir da cepa de Burkholderia cepacia. Para produção da enzima, o microorganismo foi cultivado em meio contendo sais, extrato de levedura, peptona bacteriológica e 6% de óleo de soja, por fermentação líquida em biorreator do tipo Bioflo III. As fermentações foram conduzidas a 150 rpm em 30ºC. Após 96 horas de cultivo, o sobrenadante foi separado das células por centrifugação e foi utilizado como extrato enzimático, uma vez que a Burkholderia cepacia produz lípase extracelular. O extrato bruto apresentou atividade usando azeite de oliva como substrato. Na primeira etapa do trabalho, analisou-se a condições ótimas de trabalho e estabilidade sob condições diversas e na presença de diferentes íons. A temperatura ótima foi a 37ºC, no entanto a 50ºC a enzima perdeu 10% da atividade em relação à temperatura em 37ºC. O cálculo de energia de ativação, seguindo a equação de ARRHENIUS, foi de 10,1 kJ/mol. O efeito do pH sobre a hidrólise do azeite de oliva pela lípase foi investigado com diferentes tampões na faixa de pH entre 3 e 11. Foram mantidas aproximadamente 80% da atividade entre os pHs 5 e 7, com atividade máxima no pH 8. Atividades razoáveis foram obtidas mesmo nos valores mais ácidos de pH e menores atividades nos valores entre 9 e 11. No entanto, no pH 11 observou-se queda de 80% de atividade em relação à atividade ótima da lípase. A estabilidade da atividade enzimática em diferentes tampões e valores de pH 5, 8 e 11 também foi investigada, onde nas 4 horas de incubação a diferentes valores de pH, a enzima mostrou-se bastante estável. Um estudo de estabilidade com diferentes íons por incubação da lípase durante 30 dias também foi realizado. Íons como Mn2+, Co2+, I- e Ca2+ mantiveram ou aumentaram a atividade enzimática, mas a enzima foi inibida na presença de Fe2+, Hg2+ e Al3+. À temperatura de 37 ºC e pH 8 foi feita a determinação dos parâmetros cinéticos. Os dados obtidos experimentalmente permitiram a obtenção da curva cinética, que mostrou a influência da emulsão óleo e água contendo diferentes proporções de azeite de oliva (0,1 a 50% v/v) na velocidade de hidrólise pela lípase. De acordo com a metodologia de LINEWEAVER-BURK, calculou-se os valores de Km e Vmáx de 43,90 mg/mL e 0,0258 U/mg, respectivamente. A segunda etapa foi purificar a lípase de Burkholderia cepacia em sistema bifásico aquoso polietileno glicol (PEG)/fosfato. Foram preparadas soluções estoques de PEG com massas molares de 1500, 4000 e 6000 Da (50% m/m) e tampão fosfato nos pHs 6, 7 e 8 (20% m/m de KH2PO4/K2HPO4). Um planejamento fatorial 23 foi feito para avaliar a massa molecular do PEG, pH e comprimento da linha de amarração (tie-line) no coeficiente de partição da atividade específica da lípase. Os resultados mostraram que maiores valores de atividade específica foram obtidos ao usar a menor massa molecular de PEG (1500 Da) em pH 6 e 8 e maior comprimento da linha de amarração. Após a purificação, determinou-se 33 kDa a massa molecular e 6,0 o ponto isoelétrico da lípase de Burkholderia cepacia. Na terceira etapa do trabalho, a enzima foi encapsulada por gelificação iônica usando alginato de sódio e cloreto de cálcio. Para a encapsulação foi feito um planejamento fatorial 22 variando o tamanho do bico atomizador (2 e 0,5 mm) e a concentração de CaCl2 (2 e 4% m/v). A enzima imobilizada foi caracterizada quanto à eficiência de encapsulamento, estabilidade, tamanho médio e sua distribuição e morfologia. No estudo de estabilidade verificou-se, em todas as condições de processo, que a enzima imobilizada manteve maior estabilidade em relação ao extrato bruto durante os 28 dias analisados. Nas análises de microscopia óptica, as microcápsulas formadas apresentaram formas esféricas, com média de tamanho de 400 e 100 ?m para os bicos de 2 e 0,5 mm, respectivamente. Nas análises por microscopia eletrônica de varredura (MEV), as microcápsulas foram secas em estufa e mantiveram as formas esféricas, com redução de tamanho, mesmo após esse processo de secagem. Usando o bico atomizador de 2 mm nas concentrações de 2 e 4% (m/v) de CaCl2, a microcápsula seca apresentou um tamanho de 139 e 150 µm, respectivamente, contra a média de 400 µm das hidratadas. Para o bico atomizador de 0,5 mm nas concentrações de 2 e 4% (m/v) de CaCl2, as microcápsulas apresentaram tamanhos de 15 e 6 µm, respectivamente / Abstract: This work was divided into three stages and aimed the characterization, purification and encapsulation of the lipase from a strain of Burkholderia cepacia. For enzyme production, the microorganism was grown in medium containing salts, yeast extract, bacteriological peptone and 6% soybean oil, liquid fermentation in bioreactor type Bioflo III. The fermentations were performed at 150 rpm and 30ºC. After 96 hours, the supernatant was separated from the cells by centrifugation and it was used as enzyme extract, since the Burkholderia cepacia produces extracellular lipase. In the first stage of this work, the enzymatic activity and stability were analyzed under different conditions and in the presence of different ions. The crude extract showed activity using olive oil as substrate. The optimum temperature was 37ºC, however at 50ºC the enzyme remained activity, with loss of activity of 10% compared to activity at 37°C. The calculation of activation energy, ARRHENIUS equation, was 10.1 kJ/mol. The effect of pH on hydrolysis of olive oil by lipase was investigated in the pH range between 3 and 11. About 80% of the activity was kept in the pH range between 5 and 7, with maximum activity at pH 8. Reasonable activities were obtained even in the more acidic pH values and lower activities in the values between 9 and 11. At pH 11 we observed a decrease of 80% of activity relative to the optimal activity of the enzyme. The stability of the enzyme activity of the crude extract in different buffers and pH values of 5, 8 and 11 was also investigated, where the 4 hour incubation at different pH values, the enzyme was stable. A stability study with different ions for incubation the lipase for 30 days was also realized. Ions such as Mn2+, Co2+, I- and Ca2+ remained stable or increased enzyme activity but the enzyme was inhibited in the presence of Fe2+, Hg2+ and Al3+. The determination of kinetic parameters was performed at 37°C and pH 8. The data obtained experimentally allowed obtaining the kinetic curve, which showed the influence of oil-water emulsion containing different proportions of olive oil (0.1 to 50% v/v) at the rate of hydrolysis by the lipase. According to the method of LINEWEAVER-BURK, it was calculated Km and Vmax values of 43.90 mg/mL and 0.0258 U/mg, respectively. The second step was to purify the lipase from Burkholderia cepacia in a polyethylene glycol (PEG)/phosphate aqueous two-phase system. Stock solutions were prepared with PEG molecular mass of 1500, 4000 and 6000 Da (50% w/w) and phosphate buffer in pHs 6, 7 and 8 (20% w/w KH2PO4/K2HPO4). A factorial design 23 was made to evaluate the molecular mass of PEG, pH and length of the tie-line in the partition coefficient of the enzyme specific activity. The results showed that higher values of specific activity of the enzyme were obtained when using the lower molecular mass PEG (1500 Da) at pH 6 and 8 and greater tie-line length. After purification, 33 kDa was determined for the molecular mass and 6.0 for the isoelectric point of the lipase from Burkholderia cepacia. In the third stage, the enzyme was encapsuled by ionic gelation using sodium alginate and calcium chloride. For the encapsulation, a factorial design 22 was made with 2 and 0.5 mm atomizer sizes and CaCl2 (2 and 4% w/v) concentration. The immobilized enzyme was characterized as to its encapsulation efficiency, stability, size and distribution size, and morphology. In the 28 day stability study, it was found in all process conditions that the immobilized enzyme remained more stable compared to the crude extract. In optical microscopy, the formed microspheres were spherical with average size of 400 and 100 µm for the 2 and 0.5 mm nozzles respectively. In the scanning electron microscope (SEM) analyses, the microspheres were dried in oven and maintained their spherical shapes with size reduction, even after the drying process. Using a 2 mm atomizer in the 2 and 4% (w/v) CaCl2 concentrations, the dry microcapsule presented a size of 139 and 150 µm respectively, against the average of hydrated 400 ?m. For the 0.5 mm atomizer in 2 and 4% (w/v) concentrations the dry microcapsules were 15 and 6 ?m, respectively / Doutorado / Sistemas de Processos Quimicos e Informatica / Doutor em Engenharia Química

Protein PEGylation is the covalent bonding of polyethylene glycol (PEG) polymers to amino acid residues of the protein and it is one of the most promising techniques for improving the therapeutic effect of biopharmaceuticals and long-term stability of protein-based biosensors. This chemical modification brings advantages to biopharmaceuticals, such as an increased half-life, enhanced stability, and reduced immunogenicity. Moreover, in the analytical field, PEGylation improves the multiple properties of protein-based biosensors including biocompatibility, thermal and long-term stability, and solubility in organic solvents. However, the use of PEGylated conjugates in the analytical and therapeutic fields has not been widely explored. The limited industrial application of PEGylated bioconjugates can be attributed to the fact that the reaction and separation steps are currently a challenge. The correct selection of the PEGylation reaction design and the purification process are important challenges in the field of bioconjugation. In this sense, the design and optimization of site-specific PEGylation reactions and application of aqueous biphasic systems (ABS) as purification platforms for PEGylated conjugates are the two main objectives of this thesis. Regarding the purification step, the efficient fractionation (i) of the PEGylated conjugates from the native protein and (ii) of the PEGylated conjugates based on their degree of PEGylation was studied. Centrifugal partition chromatography (CPC) was applied as a continuous regime platform based on ABS technology to efficiently purify the PEGylated proteins. The two proteins under study are L-asparaginase, an important biopharmaceutical applied in the treatment of acute lymphoblastic leukemia and cytochrome c, a promising biosensor. The current work developed in this thesis demonstrates the great potential of ABS in the fractionation of PEGylated proteins, under batch and continuous regime. In addition, in situ recovery of the PEGylated products through one-pot bioconjugation and ABS purification was successfully demonstrated for both enzymes studied. Although further research on scale-up is still required, the results presented show the relevance of ABS platforms for the development of separation processes of PEGylated proteins. / A PEGuilação de proteínas é a ligação covalente de polímeros de polietilenoglicol (PEG) a resíduos de aminoácidos da proteína e é uma das técnicas mais promissoras para melhorar o efeito terapêutico dos biofármacos e a estabilidade a longo prazo de biossensores proteícos. Esta modificação química traz vantagens aos produtos biofarmacêuticos, como um aumento da meia-vida, maior estabilidade e imunogenicidade reduzida. Além disso, no campo analítico, a PEGuilação melhora as múltiplas propriedades dos biossensores baseados em proteínas, incluindo biocompatibilidade, estabilidade térmica e a longo prazo, e solubilidade em solventes orgânicos. No entanto, o uso de conjugados PEGuilados em campos analíticos e terapêuticos não tem sido amplamente explorado. A aplicação industrial limitada dos bioconjugados PEGuilados pode ser atribuída ao facto de as etapas de reacção e separação serem atualmente um desafio. A seleção correcta do design da reacção de PEGuilação e do processo de purificação são importantes desafios no campo da bioconjugação. Neste sentido, a concepção e otimização de reações de PEGuilação sítio-específicas e aplicação de sistemas aquosos bifásicos (ABS) como plataformas de purificação de conjugados PEGuilados são os dois principais objetivos desta tese. No que concerne à etapa de purificação foi estudado o eficiente fracionamento (i) dos conjugados PEGuilados, da proteína nativa e (ii) dos conjugados PEGuilados baseados no seu grau de PEGuilação. A cromatografia por partição centrífuga (CPC) foi aplicada como uma plataforma de regime contínuo baseada na tecnologia de ABS para purificar eficientemente as proteínas PEGuiladas. As duas proteínas em estudo são a L-asparaginase, importante biofármaco aplicado no tratamento da leucemia linfoblástica aguda e o citocromo c, um potencial biossensor. A partir dos trabalhos desenvolvidos, é possível confirmar o grande potencial dos ABS no fracionamento de proteínas PEGuiladas, em regime contínuo e descontínuo. Além disso, a recuperação in situ dos produtos PEGuilados através da integração em uma única etapa de bioconjugação e purificação por ABS foi comprovada com sucesso para ambas as enzimas estudadas. Embora ainda sejam necessários estudos adicionais sobre a viabilidade destes sistemas em larga escala, os resultados aqui apresentados demonstram a relevância dos ABS para o desenvolvimento de processos de separação de proteínas PEGuiladas.

Diese Arbeit widmet sich der Untersuchung der dynamischen und strukturellen Eigenschaften sowie des Phasenverhaltens konzentrierter flüssiger Elektrolyte und ihrer Anwendung in Energiespeichern mittels Methoden der statistischen Mechanik und mithilfe atomistischer Molekulardynamik (MD) Simulationen. Zuerst untersuchen wir die Struktur-Eigenschafts-Beziehungen in konzentrierten Elektrolytlösungen wie sie in Lithium-Schwefel (Li/S), durch wir ein MD Simulationsmodell repräsentativer state-of-the-art Elektrolyt-Systeme für Li/S-Batterien bestehend aus Polysulfiden, lithium bis(trifluoromethanesulfonyl)imide (LiTFSI) und LiNO 3 Elektrolyten mit jeweils unterschiedlichen Kettenlängen gemischt in organischen Lösungsmitteln aus 1,2-dimethoxyethane and 1,3-dioxolane erstellen. Als Zweites befassen wir uns mit der Phasenseparation, die auftritt, wenn sich die physikalisch-chemischen Eigenschaften flüssiger Gemische voneinander unterscheiden. Diese Systeme bestehen üblicherweise aus einem konzentrierten anorganischen Salz und einer ionischen Flüssigkeit. In dieser Arbeit untersuchen wir eine Vielfalt von hochkonzentrierten wässrigen Elektrolytlösungen, die aus unterschiedlichen Zusammensetzungen von LiCl und LiTFSI bestehen. Daraufhin beantworten wir die Frage, wie unterschiedlich die Komponenten in der wässrigen Lösung gemischt sein sollten, damit eine solche flüssig-flüssig-Phasentrennung stattfinden kann. Als letztes untersuchen wir die Ladungsabschirmung, die ein grundlegendes Phänomen ist, das die Struktur von Elektrolyten im Bulk und an Grenzflächen bestimmt. Wir haben in dieser Arbeit die Abschirmlängen für verschiedene Elektrolyte von niedrigen bis zu hohen Konzentrationen untersucht. / Electrolytes can be found in numerous applications in daily life as well as in scientific research. The increases in demand for energy-storage systems, such as fuel cells, supercapacitors and batteries in which liquid electrolyte properties are critical for optimal function, draw critical attention to the physical and chemical properties of electrolytes. Those energy-storage devices contain intermediate or highly concentrated electrolytes where established theories, like the Debye-Hückel (DH) theory, are not applicable. Despite the efforts to describe the physical properties of intermediate or highly concentrated electrolytes, theoretical atomistic-level studies are still lacking. This thesis is devoted to critically investigate the transport/structural properties and a phase behavior of concentrated liquid electrolytes and their application in energy-storage devices, using statistical mechanics and atomistic molecular dynamics (MD) simulations. Firstly, we investigate the structure-property relationship in concentrated electrolyte solutions in next-generation lithium-sulfur (Li/S) batteries. Secondly, phase separation may exist if the physio-chemical properties of liquid mixtures are very different. Recently, the coexistence phase of two aqueous solutions of different salts at high concentrations was found, called aqueous biphasic systems. We explore a wide range of compositions at room temperature for highly concentrated aqueous electrolytes solutions that consist of LiCl and LiTFSI. Lastly, charge screening is a fundamental phenomenon that governs the structure of liquid electrolytes in the bulk and at interfaces. From the DH theory, the screening length is expected to be extremely small in highly concentrated electrolytes. Yet, recent experiments show unexpectedly high screening lengths in those. This intriguing phenomenon has prompted a new set of theoretical works. We investigate the screening lengths for various electrolytes from low to high concentrations.