Ce travail de thèse porte sur l’étude de la réplication chez les archées, qui constituent le troisième domaine du vivant avec les bactéries et les eucaryotes. L’organisme modèle que nous avons utilisé est l'archée halophile Haloferax volcanii car les outils génétiques disponibles permettent d’exprimer des protéines fusionnées à la Protéine Fluorescente Verte (GFP) dans cet organisme mésophile et aérobe et ainsi de localiser les protéines d’intérêt dans des cellules vivantes. Nous nous sommes ainsi intéressés à la localisation cellulaire de quatre protéines de la réplication qui ont été fusionnées à la GFP et exprimées sous contrôle de leur propre promoteur : (i) la protéine ‘Flap Endonuclease 1’ (FEN1), qui intervient dans la maturation des fragments d’Okazaki, (ii) la protéine ‘Origin Recognition Complex’ (ORC1) impliquée dans la reconnaissance des origines de réplication, (iii) la protéine ‘Proliferating Cellular Nuclear Antigen’ (PCNA), anneau de processivité des ADN polymérases réplicatives, et (iv) la protéine de fixation à l’ADN simple-brin ‘Replication Protein A’ (RPA2) essentielle à la réplication chez H. volcanii. Seule la protéine PCNA n’a pu être exprimée en fusion avec la GFP, suggérant que la protéine fusion n’est pas fonctionnelle. GFP::Orc1 et GFP::Fen1 ont été exprimées dans la cellule mais ne présentent pas de localisation spécifique reflétant un rôle de ces protéines dans la réplication de l’ADN. En revanche des foyers de fluorescence de la protéine fusion GFP::Rpa2 ont été observés, dont le nombre augmente significativement dans des cellules exposées à l’aphidicoline, drogue inhibant la synthèse de l’ADN et induisant ainsi un stress réplicatif. Cependant une localisation différente de la protéine GFP::Rpa2 a été observée lorsque les cellules sont exposés à la phléomycine, qui induit notamment des cassures double-brin de l‘ADN. Dans ces cellules, GFP::Rpa2 forme un foyer de fluorescence massif qui colocalise avec l’ADN compacté dans la grande majorité des cellules observées. Nos résultats suggèrent donc que la localisation spécifique observée pour GFP::Rpa2 reflète son rôle dans la réparation de l’ADN et/ou le redémarrage des fourche de réplication arrêtées. / The aim of this thesis project was to improve our understanding of DNA replication in archaea, the third domain of life with bacteria and eukarya. The model organism chosen for these studies is the halophilic archaea Haloferax volcanii, a mesophilic aerobe for which genetics tools allow studying in living cells the localization of proteins fused to the Green Fluorescent protein (GFP). Four proteins involved in DNA replication were fused to the GFP and expressed under the control of their own promoter: (i) the ‘Flap Endonuclease 1’ (FEN1), involved in Okazaki fragments maturation, (ii) the ‘Origin Recognition Complex’ (ORC1), involved in DNA replication origin recognition, (iii) the ‘Proliferating Cellular Nuclear Antigen’ (PCNA), processivity factor of replicative DNA polymerases, and (iv) the ‘Replication Protein A’ (RPA2), single-stranded DNA binding protein essential for DNA replication in H. volcanii. Only the PCNA fusion to the GFP was not successful, suggesting that the GFP hinders essential roles of PCNA in DNA replication. Fen1 and Orc1 were successfully fused to the GFP and expressed in living cells, but specific localization in cells related to growth phase, reflecting different replication dynamics, were not observed. In contrast, we could observed fluorescent foci formed by the fully functional GFP::Rpa2 protein that actively responded to DNA damage in H. volcanii cells. The number of these fluorescent foci per cell was constant during cell growth but it significantly increased in cells exposed to aphidicoline, which inhibits DNA synthesis during replication. When cells were treated with phleomycine, a DNA damaging agent mainly causing double-strand breaks, formation of a massive fluorescent focus coinciding with DNA compaction was observed. Our results suggest that the specific cellular localization of GFP::Rpa2 observed reflects Rpa2 roles in DNA repair and/or DNA replication fork restart.

Les transferts horizontaux de gènes (THG) ont été démontrés pour jouer un rôle important dans l'évolution des procaryotes. Leur impact a été le sujet de débats intenses, ceux-ci allant même jusqu'à l'abandon de l'arbre des espèces. Selon certaines études, un signal historique dominant est présent chez les procaryotes, puisque les transmissions horizontales stables et fonctionnelles semblent beaucoup plus rares que les transmissions verticales (des dizaines contre des milliards). Cependant, l'effet cumulatif des THG est non-négligeable et peut potentiellement affecter l'inférence phylogénétique. Conséquemment, la plupart des chercheurs basent leurs inférences phylogénétiques sur un faible nombre de gènes rarement transférés, comme les protéines ribosomales. Ceux-ci n'accordent cependant pas autant d'importance au modèle d'évolution utilisé, même s'il a été démontré que celui-ci est important lorsqu'il est question de résoudre certaines divergences entre ancêtres d'espèces, comme pour les animaux par exemple. Dans ce mémoire, nous avons utilisé des simulations et analyser des jeux de données d'Archées afin d'étudier l'impact relatif des THG ainsi que l'impact des modèles d'évolution sur la précision phylogénétique. Nos simulations prouvent que (1) les THG ont un impact limité sur les phylogénies, considérant un taux de transferts réaliste et que (2) l'approche super-matrice est plus précise que l'approche super-arbre. Nous avons également observé que les modèles complexes expliquent non seulement mieux les données que les modèles standards, mais peuvent avoir un impact direct sur différents groupes phylogénétiques et sur la robustesse de l'arbre obtenu. Nos résultats contredisent une publication récente proposant que les Thaumarchaeota apparaissent à la base de l'arbre des Archées. / Horizontal gene transfer (HGT) had been demonstrated to play an important role in the evolution of prokaryotes. Their impact on phylogeny was the subject of a heated debate, with some proposing that the concept of a species tree should be abandoned. The phylogeny of prokaryotes does contain a major part of the historical signal, because stable and functional horizontal transmissions appear to be by far rarer than vertical transmissions (tens versus billions). However, the cumulative effect of HGT is non-negligible and can potentially affect phylogenetic inference. Therefore, most researchers base their phylogenetic inference on a low number of rarely transferred genes such as ribosomal proteins, but they assume the selection of the model of evolution as less important, this despite the fact that it has been shown of prime importance for much less deep divergences, e.g. like animals. Here, we used a combination of simulations and of real data from Archaea to study the relative impact of HGT and of the inference methods on the phylogenetic accuracy. Our simulations prove that (1) HGTs have a limited impact on phylogeny, assuming a realistic rate and (2) the supermatrix is much more accurate than the supertree approach. We also observed that more complex models of evolution not only have a better fit to the data, but can also have a direct impact on different phylogenetic groups and on the robustness of the tree. Our results are in contradiction to a recent publication proposing that the Thaumarchaeota are at the base of the Archaeal tree.

Depuis la découverte d’archées capables d’oxyder l’ammoniac en milieu aérobie, de nombreuses études ont mesuré en simultané les taux de nitrification et la diversité des organismes oxydant l’ammoniac dans la colonne d’eau des milieux marins. Malgré l’importance globale des lacs d’eau douce, beaucoup moins d’études ont fait la même chose dans ces milieux. Dans cette étude, nous avons évalué l’importance de la nitrification et caractérisé la communauté microbienne responsable de la première étape limitante de la nitrification dans un lac tempéré durant une année entière. L’utilisation de traceur isotopique 15NH4 nous a permis de mesurer des taux d’oxydation d’ammoniac à deux profondeurs dans la zone photique tout au long de l’année. Les taux d’oxydation d’ammoniac varient de non détectable à 333 nmol L-1 j-1 avec un pic d’activité sous la glace. De toutes les variables environnementales mesurées, la concentration d’ammonium dans la colonne d’eau semble avoir le plus grand contrôle sur les taux d’oxydation d’ammoniac. Nous avons détecté la présence d’archées (AOA) et de bactéries oxydante d’ammoniac (BOA) à l’aide de tests par réaction en chaîne de la polymérase (PCR) ciblant une partie du gène ammoniac monoxygénase (amoA). Les AOA et les BOA ont été détectées dans la zone photique du lac, cependant seules les AOA étaient omniprésentes durant l’année. Le séquençage du gène amoA des archées révèle que la majorité des AOA dans le lac sont membres du groupe phylogénétique Nitrosotalea (également appelé SAGMGC-1 ou groupe I.1a associé), ce qui confirme la pertinence écologique de ce groupe dans les eaux douces oligotrophes. Globalement, nos résultats indiquent l’hiver comme étant un moment propice pour l’oxydation de l’ammoniac dans les lacs tempérés. Cette étude fournit un point de référence pour la compréhension du processus d’oxydation de l’ammoniac dans les petits lacs oligotrophes. / Since the discovery that some archaea are able to oxidize ammonia aerobically, several studies have focused on measuring nitrification rates and identifying the diversity of planktonic ammonia oxidizers in marine systems. Despite the global importance of freshwater lakes, far fewer studies have done the same in these ecosystems. Here we investigated the importance of nitrification and characterize the microbial community catalyzing the first rate-limiting step of nitrification over an annual cycle in a temperate lake. The measurements of ammonia oxidation rates, using the 15NH4+ isotope tracer method, at two depths in the photic zone show that this process occurred throughout the entire year in the lake. Rates of ammonia oxidation ranged from undetectable to 333 nmol L-1 d-1 with a peak of activity during winter. Off all environmental variables measured, ammonium concentrations in the water-column seem to have the strongest effect on the magnitude of ammonia oxidation rates. We detected the presence of ammonia-oxidizing archaea (AOA) and bacteria (AOB) using polymerase chain reaction (PCR) assays targeting part of the ammonia monooxygenase (amoA) gene. Both AOA and AOB were detected in the photic zone of the lake, although only AOA were omnipresent over the year. The sequencing of archaeal amoA genes reveals that most of the AOA in the lake are members of the Nitrosotalea cluster (also referred as SAGMGC-1 or group I.1a associated), which confirms the ecological relevance of this cluster in oligotrophic freshwaters. Altogether, our results indicate that winter may be a critical time for ammonia oxidation in temperate lakes and provide a baseline for the understanding of ammonia oxidation in small oligotrophic lakes.

Reconnu par leur effet toxique, inhibiteur et corrosif, les sulfures (S2-, SH-, SH2) sont un sous-produit indésirable de la digestion anaérobie des boues de station de traitement des eaux domestiques de la ville de Marrakech, Maroc (STEP). Ils proviennent essentiellement de la réduction "dissimilatrice" des composés soufrés (SO4 2-, SO3 2-, S2O4 2- ..) contenus dans ces boues. Ce processus est réalisé par un groupe bactérien anaérobie appelé bactéries sulfatoréductrices (BSR). Une fois dans le biogaz, les sulfures sous forme gazeuse réduisent en plus la durée de vie des installations et des équipements de la STEP. Elle est ainsi dotée d’installations biologiques et physico-chimiques lui permettant d’éliminer ces sulfures avant la transformation du biogaz en énergie électrique. Cependant, ces procédés sont onéreuses et grandes consommatrices d’énergies. D’où l’idée de minimiser la production des sulfures au sein même des digesteurs anaérobies. Pour cela, il était nécessaire d’abord de connaître les microorganismes à l'origine de la production des sulfures (BSR), ceux potentiellement impliqués dans leur élimination (bactéries sulfo-oxydantes), et d’un groupe de microorganismes fermentaires (Synergistetes) intervenant dans le bon fonctionnement de la digestion anaérobie. Ces études ont été menées à la fois sur des d'approches moléculaires et culturales. Les résultats obtenus, ont permis de comprendre comment ces groupes bactériens, d’intérêts écologique et économique importants, interviennent dans la digestion anaérobie des boues de la STEP permettant à la fois d’accélérer les processus d’oxydation de la matière organique combinée à la réduction des composés soufrés et de minimiser la concentration des en sulfure dans le biogaz. / Recognized by their toxic, inhibitory and corrosive effect, sulfides (S2-, SH-, H2S) are an undesirable by-product of the anaerobic digestion of from domestic wastewater treatment plants sludge in the city of Marrakech, Morocco (WWTP). They produced mainly by the dissimilatory reduction of sulfur compounds (SO42-, SO32-, S2O42-) contained in these sludges. This process is performed by an anaerobic bacterial group called sulfate reducing bacteria (SRB). Once in the biogas, the sulfides in gaseous form shorten in addition the lifetime of the installations and equipments of the WWTP. It is thus equipped with biological and physicochemical installations allowing it to eliminate these sulfides before the transformation of biogas into electrical energy. However, these processes are expensive and consume large amounts of energy. Hence the idea of minimizing the production of sulfides within anaerobic digesters. For this, it was first necessary to know the microorganisms originating of the production of sulfides (SRB), those potentially involved in their elimination (sulfur oxidizing bacteria), and a group of fermentative microorganisms (Synergistetes) involved in the good functioning of the anaerobic digestion. These studies were conducted on both molecular and cultural approaches. The results obtained allowed to understand how these bacterial groups, of great ecological and economic interest, are involved in the anaerobic digestion of sludge from the WWTP, which both accelerates the oxidation processes of the organic matter combined with the reduction of sulfur compounds and to minimize the concentration of sulfide in biogas.

Les aminopeptidases représentent un groupe d’enzymes qui possèdent une fonction cellulaire clef dans les mécanismes physiologiques et pathologiques. Elles interviennent dans la cascade enzymatique après l’action des endoprotéases, dans l’homéostasie au travers le renouvellement du pool d’acides aminés, dans le métabolisme énergétique, la régulation de l’activité des peptides bioactifs, la présentation antigénique ainsi dans une diversité de mécanismes pathologiques tels que les maladies neurologiques et les infections virales et parasitaires. Les aminopeptidases TETs sont capables de former des macro-assemblages tétraédriques comprenant douze sous-unités. En vue de mieux comprendre leur fonction biologique et leur mode d'action, nous avons étudié les propriétés fonctionnelles et structurales de deux nouveaux complexes TETs issus d'archées hyperthermophiles. L'archée hyperthermophile Methanocaldococcus jannaschii ne possède qu'une version de TET (MjTET) qui a été produite dans Escherichia coli et purifiée sous forme de dodécamère. La recherche de son activité enzymatique et de ses substrats peptidiques par des tests chromogéniques et fluorogéniques, ainsi que des études par HPLC en phase inverse, montre que cette enzyme est une leucine aminopeptidase activée par le cobalt se distinguant des autres aminopeptidases M42 par son très large spectre d'action qui s'étend aux résidus aromatiques. Une structure complète de cette aminopeptidase a été résolue en combinant la cristallographie (2.4 Å) et la cryo-EM (4,1 Å). L'analyse de la poche de spécificité de MjTET permet de mieux comprendre les bases structurales de la discrimination de substrat chez les TETs. De plus, l'analyse de la structure interne de la particule permet de proposer un nouveau mécanisme de navigation des peptides à l’intérieur des particules tétraédriques de la famille TET.L'archée hyperthermophile Pyrococcus horikoshii comporte trois types de complexes TETs. L'étude d'une protéine présentant ~20 % d'identité avec ces systèmes, nous a permis d'identifier une quatrième version du système TET dans cet organisme : PhTET4. La protéine recombinante a été purifiée. Elle forme un complexe dodécamérique tétraédrique. Les études biochimiques révèlent que l'enzyme possède une spécificité très étroite dirigée exclusivement vers l'hydrolyse des résidus glycines de l'extrémité N-terminale des peptides. De plus, elle estactivée par le nickel. Ces caractéristiques permettent de proposer que, chez les archées, la multiplication et la spécialisation des enzymes TETs seraient associées au caractère hétérotrophes alors que le système des archées autotrophes se réduirait à une TET unique apte à assurer une fonction de « ménage ». / Aminopeptidases represent a group of enzymes displaying key cellular function inphysiological and pathological mechanisms. They are involved in the enzymatic cascade beyond the action of endoproteases, in homeostasis through the renewal of the amino acid pool, in the energy metabolism, in the regulation of bioactive peptide activities, in the antigen presentation and in a diversity of pathological mechanisms such as neurological diseases as well as viral and parasitic infections. Aminopeptidases TET are able of forming tetrahedral macro-assemblies built by twelve subunits. In order to better understand their biological function and their mode of action, we studied the functional and structural properties of two novel TET complexes derived from hyperthermophilic archaea. The hyperthermophilic archaeon Methanocaldococcus jannaschii has only one version of TET (MjTET) that was produced in Escherichia coli and purified as dodecameric macromolecule. The search for its enzymatic activity and peptide substrates by using chromogenic/fluorogenic assays and reverse phase HPLC studies, demonstrated that this enzyme is a cobalt-activated leucine aminopeptidase, discriminated from other M42 aminopeptidases by its very broad activity spectrum, that extends to aromatic residues. Complete structure of this aminopeptidase was determined by combining X-ray crystallography (2.4 Å) and cryo-electron microscopy (4.1 Å). Analysis of MjTET specificity pocket indicated possible molecular bases for substrate discrimination in TET peptidases. In depth investigation of the particle internal structure allowed to propose a novel peptide trafficking mechanism for the TET family tetrahedral particles. Three types of TET complexes are present in the hyperthermophilic archaea, Pyrococcus horikoshii. The study of an unassigned protein displaying ~20% identity with the PhTETs systems allowed us to identify a fourth version of TET complex in this organism: PhTET4. The recombinant protein was purified. It formed tetrahedral dodecameric complex. Biochemical studies indicated that the enzyme has a very narrow hydrolytic specificity directed exclusively toward the peptide N-terminal glycine residues. In addition, this enzyme is activated by nickel ions. These features allowed proposing that, in archaea, the multiplicity of specialized TET systems could be associated with heterotrophy while unique TET system displaying “housekeeping” function is present in autotrophic organisms.

Les transferts horizontaux de gènes (THG) ont été démontrés pour jouer un rôle important dans l'évolution des procaryotes. Leur impact a été le sujet de débats intenses, ceux-ci allant même jusqu'à l'abandon de l'arbre des espèces. Selon certaines études, un signal historique dominant est présent chez les procaryotes, puisque les transmissions horizontales stables et fonctionnelles semblent beaucoup plus rares que les transmissions verticales (des dizaines contre des milliards). Cependant, l'effet cumulatif des THG est non-négligeable et peut potentiellement affecter l'inférence phylogénétique. Conséquemment, la plupart des chercheurs basent leurs inférences phylogénétiques sur un faible nombre de gènes rarement transférés, comme les protéines ribosomales. Ceux-ci n'accordent cependant pas autant d'importance au modèle d'évolution utilisé, même s'il a été démontré que celui-ci est important lorsqu'il est question de résoudre certaines divergences entre ancêtres d'espèces, comme pour les animaux par exemple. Dans ce mémoire, nous avons utilisé des simulations et analyser des jeux de données d'Archées afin d'étudier l'impact relatif des THG ainsi que l'impact des modèles d'évolution sur la précision phylogénétique. Nos simulations prouvent que (1) les THG ont un impact limité sur les phylogénies, considérant un taux de transferts réaliste et que (2) l'approche super-matrice est plus précise que l'approche super-arbre. Nous avons également observé que les modèles complexes expliquent non seulement mieux les données que les modèles standards, mais peuvent avoir un impact direct sur différents groupes phylogénétiques et sur la robustesse de l'arbre obtenu. Nos résultats contredisent une publication récente proposant que les Thaumarchaeota apparaissent à la base de l'arbre des Archées. / Horizontal gene transfer (HGT) had been demonstrated to play an important role in the evolution of prokaryotes. Their impact on phylogeny was the subject of a heated debate, with some proposing that the concept of a species tree should be abandoned. The phylogeny of prokaryotes does contain a major part of the historical signal, because stable and functional horizontal transmissions appear to be by far rarer than vertical transmissions (tens versus billions). However, the cumulative effect of HGT is non-negligible and can potentially affect phylogenetic inference. Therefore, most researchers base their phylogenetic inference on a low number of rarely transferred genes such as ribosomal proteins, but they assume the selection of the model of evolution as less important, this despite the fact that it has been shown of prime importance for much less deep divergences, e.g. like animals. Here, we used a combination of simulations and of real data from Archaea to study the relative impact of HGT and of the inference methods on the phylogenetic accuracy. Our simulations prove that (1) HGTs have a limited impact on phylogeny, assuming a realistic rate and (2) the supermatrix is much more accurate than the supertree approach. We also observed that more complex models of evolution not only have a better fit to the data, but can also have a direct impact on different phylogenetic groups and on the robustness of the tree. Our results are in contradiction to a recent publication proposing that the Thaumarchaeota are at the base of the Archaeal tree.

La reconstruction et la résurrection moléculaire de protéines ancestrales est au coeur de cette thèse. Alors que les données moléculaires fossiles sont quasi inexistantes, il est possible d'estimer quelles étaient les séquences ancestrales les plus probables le long d'un arbre phylogénétique décrivant les relations de parentés entre séquences actuelles. Avoir accès à ces séquences ancestrales permet alors de tester de nombreuses hypothèses biologiques, de la fonction des protéines ancestrales à l'adaptation des organismes à leur environnement. Cependant, ces inférences probabilistes de séquences ancestrales sont dépendantes de modèles de substitution fournissant les probabilités de changements entre acides aminés. Ces dernières années ont vu le développement de nouveaux modèles de substitutions d'acides aminés, permettant de mieux prendre en compte les phénomènes biologiques agissant sur l'évolution des séquences protéiques. Classiquement, les modèles supposent que le processus évolutif est à la fois le même pour tous les sites d'un alignement protéique et qu'il est resté constant au cours du temps lors de l'évolution des lignées. On parle alors de modèle homogène en temps et en sites. Les modèles récents, dits hétérogènes, ont alors permis de lever ces contraintes en permettant aux sites et/ou aux lignées d'évoluer selon différents processus. Durant cette thèse, de nouveaux modèles hétérogènes en temps et sites ont été développés en Maximum de Vraisemblance. Il a notamment été montré qu'ils permettent d'améliorer considérablement l'ajustement aux données et donc de mieux prendre en compte les phénomènes régissant l'évolution des séquences protéiques afin d'estimer de meilleurs séquences ancestrales. A l'aide de ces modèles et de reconstruction ou résurrection de protéines ancestrales en laboratoire, il a été montré que l'adaptation à la température est un déterminant majeur de la variation des taux évolutifs entre lignées d'Archées. De même, en appliquant ces modèles hétérogènes le long de l'arbre universel du vivant, il a été possible de mieux comprendre la nature du signal évolutif informant de manière non-parcimonieuse un ancêtre universel vivant à plus basse température que ses deux descendants, à savoir les ancêtres bactériens et archéens. Enfin, il a été montré que l'utilisation de tels modèles pouvait permettre d'améliorer la fonctionnalité des protéines ancestrales ressuscitées en laboratoire, ouvrant la voie à une meilleure compréhension des mécanismes évolutifs agissant sur les séquences biologiques / The molecular reconstruction and resurrection of ancestral proteins is the major issue tackled in this thesis manuscript. While fossil molecular data are almost nonexistent, phylogenetic methods allow to estimate what were the most likely ancestral protein sequences along a phylogenetic tree describing the relationships between extant sequences. With these ancestral sequences, several biological hypotheses can be tested, from the evolution of protein function to the inference of ancient environments in which the ancestors were adatapted. These probabilistic estimations of ancestral sequences depend on substitution models giving the different probabilities of substitution between all pairs of amino acids. Classicaly, substitution models assume in a simplistic way that the evolutionary process remains homogeneous (constant) among sites of the multiple sequence alignment or between lineages. During the last decade, several methodological improvements were realised, with the description of substitution models allowing to account for the heterogeneity of the process among sites and in time. During my thesis, I developed new heterogeneous substitution models in Maximum Likelihood that were proved to better fit the data than any other homogeneous or heterogeneous models. I also demonstrated their better performance regarding the accuracy of ancestral sequence reconstruction. With the use of these models to reconstruct or resurrect ancestral proteins, my coworkers and I showed the adapation to temperature is a major determinant of evolutionary rates in Archaea. Furthermore, we also deciphed the nature of the phylogenetic signal informing substitution models to infer a non-parsimonious scenario for the adaptation to temperature during early Life on Earth, with a non-hyperthermophilic last universal common ancestor living at lower temperatures than its two descendants. Finally, we showed that the use of heterogeneous models allow to improve the functionality of resurrected proteins, opening the way to a better understanding of evolutionary mechanisms acting on biological sequences

La pseudouridylation, l'isomérisation du résidu urine (U) en pseudouridine ([PSI]) est la modification post-transcriptionnelle la plus fréquemment retrouvée dans les ARN. Elle est catalysée par une enzyme ARN:PSI-synthase. Chez les archées et les eucaryotes, cette activité est également portée par des particules ribonucléoprotéiques à boîtes H/ACA (RNP H/ACA). Chez les archées, le complexe comprend quatre protéines invariables dont l'ARN:PSI-synthase aCBF5 et trois protéines partenaires L7Ae, aNOP10 et aGAR1, ainsi qu'un ARN guide qui cible par appariement de bases la position de l'uridine à modifier de l'ARN substrat. Le rôle des partenaires a pu être identifié par des analyses structure-fonction basées sur des approches biochimiques, biophysiques et radiocristallographiques. Au cours de ce travail, nous avons démontré l'existence de disparités fonctionnelles entre les ARN guides d'un même organisme, et l'importance de l'interaction entre L7Ae et aNOP10 pour le positionnement correct de l'ARN substrat. Nous avons testé in vitro l'assemblage et l'activité de particules reconstituées en présence d'ARN guides non conventionnels. L'étude sur la dynamique de l'ARN substrat lors de la pseudouridylation a également été abordée et a permis de déterminer que aGAR1 n'était pas nécessaire pour le mécanisme de turnover de la particule, que la température jouait un rôle crucial pour cette activité, et que la nature du nucléotide cible ainsi que la longueur de l'ARN substrat étaient des éléments importants pour la sélection de cet ARN. Nous avons également mis au point une nouvelle technique basée sur le phénomène de FRET permettant de suivre l'association de l'ARN substrat à la RNP H/ACA / Pseudouridylation reaction that consists in the isomerization of uridines (U) into pseudouridines (PSI) is the most frequent post-transcriptional modification found in RNAs. It is catalyzed by enzymes with RNA:PSI-synthase activity. In Archaea and Eukarya, ribonucleoprotein particles, the so-called box H/ACA RNPs, possess such activity. In Archaea, the box H/ACA complex comprises four invariable proteins namely the RNA:PSI-synthase aCBF5 and three protein partners L7Ae, aNOP10 and aGAR1, and specific to each RNP, an RNA acting as a guide to secure by base pairing the RNA substrate and define the position to be modify. During these last years, several crystal structures of components of archaeal H/ACA RNP and fully assembled RNP have been resolved. Complementary biochemical and biophysical studies allowed detailed structure-function analyses to identify the role of the different components. During this work we identified functional differences between two RNA guides expressed in the same archaea, and demonstrated that the interaction between L7Ae and aNOP10 is important for a correct positioning of substrate RNA. We also tested in vitro the assembly and activity of RNP reconstituted on H/ACA-like guide RNAs. We investigated dynamics of substrate RNA during the pseudouridylation. We found that aGAR1 was not necessary for the turnover of the particle, that the temperature was crucial for such activity, and that the chemical structure of the targeted residue and length of the substrate RNA were important determinants for substrate selectivity. Finally, we have also developed a new technic based on FRET adapted to monitor binding of the susbtrate RNA to the box H/ACA RNP enzyme