Human gliomas represent the most common primary brain tumours in adults. According to World Health Organization classification, gliomas are divided into astrocytomas with four grades (I, II, III, and IV), oligodendrogliomas with two grades (II and III), and oligoastrocytomas with two grades (II and III) based on the tumor cell phenotype. Pathological classification remains controversial due to the lack of specific immunohistochemical biomarker to recognize gliomas. Also, due to their natural propriety to infiltrate the normal parenchyma and to migrate far from the first location, total surgical resection remains often impossible then adjuvant treatment is needed. The established therapies for gliomas include surgery, radiotherapy and chemotherapy. Despite this arsenal of therapies, median survival of the most malignant grade glioblastoma is approximately 15 months. This is why the attempts to better understand the molecular biology of gliomas in the aim to define new molecular targets is a holy grail. Using conventional and molecular cytogenetic approaches and molecular genetic methods, we have investigated patients bearing gliomas and followed at CHUS. Our results display that the codeletion 1p/19q (1p-/19-) is not only a prognostic and predictive biomarker of oligodendrogliomas but also a diagnostic tool of this tumor. Our study has allowed us to build a glioma-bank containing around 150 samples of patients, which we continued to populate. We have also defined the cut-off positivity of FISH on touch preparation slides, which is 20%. In addition, we have developed a new, fast and reliable method to retrieve the 1p-/19q- in all samples 24 hours after sampling. This method was transferred to the clinical lab. Furthermore, we have successfully cultured the brain tumor samples and analyzed their caryotypes. This has permitted us to discover a new alternative translocation, which is responsable of 1p deletion in one oligoastrocytoma case. Since glioblastoma is characterized by genomic instability, and telomere disruption is a main cause of genomic instability, we investigated the nuclear telomere architecture in this type of tumour. We found that nuclear telomeric architecture could be a biomarker of glioblastoma since it can subdivide glioblastoma patients in three categories with significantly different outcomes and time to progression. We used high-throughput methods (one manual and one semi-automatic) to characterize the nuclear telomeric architecture in glioblastoma. The semi-automatic method can be transfer to the clinical lab since it can deliver the results nine hours after sampling. Then, this approach is usable to monitor this tumor and to evaluate the impact of different treatment options. We need to search the putative tumor suppressor genes on chromosomes 1 and 19. Furthermore, trying to understand the molecular basis of nuclear telomeric architecture will bring up new molecular target therapies.

Le développement embryonnaire précoce des mammifères femelles s'accompagne de l'inactivation transcriptionnelle d'un de leurs deux chromosomes X. Cet évènement est initié suite à l'expression mono-allélique de l'ARN non codant Xist, qui est contrôlée par de nombreux éléments cis-régulateurs présents dans le centre d'inactivation du chromosome X (Xic) - tel son anti-sens répresseur Tsix. Mon travail de thèse a consisté à développer des approches permettant d'appréhender le paysage structural dans lequel s'exerce cette régulation. La caractérisation de l'architecture tridimensionnelle du Xic, par des techniques basées sur la capture de conformation chromosomique (3C) et l'hybridation in situ en fluorescence (FISH), m'a permis de mettre en évidence que les promoteurs respectifs de Xist et Tsix sont engagés dans des interactions physiques intimes avec des loci distaux, localisés au sein du Xic, et de montrer qu'au moins certaines de ces régions exercent un effets régulateurs à longue-distance. Les éléments du Xic contactés par les régions promotrices de Xist et de Tsix sont en outre fondamentalement différents, chacune engageant des associations chromosomiques sur plusieurs centaines de kilobases dans leur direction 5' respective.Ce travail a également permis de révéler des propriétés insoupçonnées de l'architecture chromosomiques. En effet, le Xic apparaît scindé en plusieurs sous-régions, couvrant chacune entre 200kb et 1Mb, à l'intérieur desquelles les interactions chromosomiques sont préférentiellement établies. L'existence de ces domaines d'interaction s'intègre avec d'autres propriétés structurales du génome, tels la composition de la chromatine sous-jacente et l'association à la lamine nucléaire, mais n'apparaît pas en dépendre directement. En étudiant la dynamique de la conformation chromosomique du Xic au cours de la différenciation cellulaire, j'ai pu constater la robustesse de cette organisation, sauf sur le chromosome X inactif, qui se distingue par la perte des contacts chromosomiques préférentiels détectables sur son homologue actif.Enfin, j'ai pu mettre en évidence que la variabilité du repliement général du chromosome X amène à un instant donné chaque allèle de Tsix à contacter physiquement des jeux de séquences distales différents, suggérant que l'environnement structural instantané de chacun de ces allèles à l'orée de l'activation mono-allélique de Xist est différent. Ce travail, combinant des approches à l'échelle de la population cellulaire d'une part et de la fibre de chromatine unique d'autre part, apporte une nouvelle vision du paysage structural et régulateur dans lequel s'inscrit le contrôle de l'activité transcriptionnelle de Xist, et fourni de nouvelles perspectives concernant les principes fondamentaux de l'organisation topologique des chromosomes chez les mammifères.

Telomeres play an important role in carcinogenesis. They assure immortalization of tumor cells by maintaining their length through the activation of telomerase or the alternative lengthening of telomere. Despite these mechanisms, telomeres of tumor cells are generally shorter than those of normal cells. In cancer cells, short telomeres promote chromosomal instability, which is one of the aggravating factors of neoplastic process. Also, the nuclear architecture of telomeres can be altered during carcinogenesis and cause genomic instability. To further understand the roles of telomeres in cancer, we studied the length of individual telomeres and their nuclear architecture in neoplastic cells. Using chronic myeloid leukemia (CML) as a model, we established the first length profile of all individual telomeres in cancer. We found that telomeres on chromosome arms Xp, 18p and 5p were among the longest while the shortest were on 21p and 21q . Also, by comparing with normal cells, we established that individual telomeres of CML cells had different shortening rates. Moreover, we noted the presence of long telomeres on some specific chromosome arms in CML cells. These data led us to explore different mechanisms of telomere length maintenance in CML cells and we showed that both telomerase and the ALT can be used to maintain their telomere length. Finally, the use of LoVo cell line, from colon carcinoma, allowed us to show that the profile of individual telomere length can be dissimilar in different cancers; and specific mutations of TP53 influence this profile in a same cancer cell. Therefore, the profile of individual telomere length of a cancer cell is defined by the genetic background of the individual, the tumor type, and the nature of the mutations. The study of nuclear architecture of telomeres was done in three different settings. First, we explored impacts on nuclear architecture of telomeres after exposing normal cells to DNA-damaging agents. We particularly observed the presence of telomeric aggregates and a change in the position of telomeres in response to UVB exposure. Next, we showed that remodeling of the nuclear architecture of telomeres could occur as early as the first clinical phase of CML. Moreover, we categorized CML cells into two groups according to the number of telomeric aggregates. Finally, we showed that the mutation TP53-R175H lead to greater alteration of the nuclear organization of telomeres and a genomic instability than the other studied TP53 mutations. The work, presented here, fosters our understanding on the involvement of telomeres in carcinogenesis and will serve as foundation for future studies on length of individual telomeres and their nuclear architecture in cancers.

Le développement embryonnaire précoce des mammifères femelles s’accompagne de l’inactivation transcriptionnelle d’un de leurs deux chromosomes X. Cet évènement est initié suite à l’expression mono-allélique de l’ARN non codant Xist, qui est contrôlée par de nombreux éléments cis-régulateurs présents dans le centre d’inactivation du chromosome X (Xic) – tel son anti-sens répresseur Tsix. Mon travail de thèse a consisté à développer des approches permettant d’appréhender le paysage structural dans lequel s’exerce cette régulation. La caractérisation de l’architecture tridimensionnelle du Xic, par des techniques basées sur la capture de conformation chromosomique (3C) et l’hybridation in situ en fluorescence (FISH), m’a permis de mettre en évidence que les promoteurs respectifs de Xist et Tsix sont engagés dans des interactions physiques intimes avec des loci distaux, localisés au sein du Xic, et de montrer qu’au moins certaines de ces régions exercent un effets régulateurs à longue-distance. Les éléments du Xic contactés par les régions promotrices de Xist et de Tsix sont en outre fondamentalement différents, chacune engageant des associations chromosomiques sur plusieurs centaines de kilobases dans leur direction 5’ respective.Ce travail a également permis de révéler des propriétés insoupçonnées de l’architecture chromosomiques. En effet, le Xic apparaît scindé en plusieurs sous-régions, couvrant chacune entre 200kb et 1Mb, à l’intérieur desquelles les interactions chromosomiques sont préférentiellement établies. L’existence de ces domaines d’interaction s’intègre avec d’autres propriétés structurales du génome, tels la composition de la chromatine sous-jacente et l’association à la lamine nucléaire, mais n’apparaît pas en dépendre directement. En étudiant la dynamique de la conformation chromosomique du Xic au cours de la différenciation cellulaire, j’ai pu constater la robustesse de cette organisation, sauf sur le chromosome X inactif, qui se distingue par la perte des contacts chromosomiques préférentiels détectables sur son homologue actif.Enfin, j’ai pu mettre en évidence que la variabilité du repliement général du chromosome X amène à un instant donné chaque allèle de Tsix à contacter physiquement des jeux de séquences distales différents, suggérant que l’environnement structural instantané de chacun de ces allèles à l’orée de l’activation mono-allélique de Xist est différent. Ce travail, combinant des approches à l’échelle de la population cellulaire d’une part et de la fibre de chromatine unique d’autre part, apporte une nouvelle vision du paysage structural et régulateur dans lequel s’inscrit le contrôle de l’activité transcriptionnelle de Xist, et fourni de nouvelles perspectives concernant les principes fondamentaux de l’organisation topologique des chromosomes chez les mammifères. / Early development of female mammals is accompanied by transcriptional inactivation of one of their two X chromosomes. This event is initiated following mono-allelic expression of the Xist non-coding RNA – what is achieved by the interplay of numerous cis-regulatory elements present within the X inactivation center (Xic), such as its repressive antisense Tsix. Our work aimed at throwing light on the structural landscape that underlies such long-range regulation. Characterization of the three-dimensional architecture of the Xic, by the means of Chromosome Conformation Capture (3C)-based techniques and in situ fluorescence hybridization (FISH), revealed that the respective promoters of Xist and Tsix contact many distal genomic elements within the Xic, and that at least one of such interacting region exerts long-range cis-transcriptional control. Noticeably, Xist and Tsix promoters associate with different sets of elements in their respective 5’ direction that are spread out over several hundreds of kilobases These experiments also revealed unforeseen properties of chromatin architecture. Indeed, the Xic appears to be partitioned in several sub-regions, each spanning between 200kb and 1Mb, inside which chromosomal interactions are preferentially established. The existence of these interaction domains integrates with other structural features of the genome, such as underlying chromatin composition and association with the nuclear lamina, but does not seem to directly depend on them. By analyzing chromosome conformation of the Xic during cell differentiation we document the robustness of this organizational principle, with the noticeable exception of the inactive X chromosome that assumes a folding pattern that is more random than its active homolog. Finally we also bring evidence that variability in the folding pattern of the two X chromosomes in the same cell brings each Tsix allele in association with different sets of chromosomal partners at a given moment, suggesting that the instantaneous structural environment of each allele at the onset of mono-allelic Xist up-regulation is different.By combining approaches at the scale of cell populations on the one hand, and at the single chromatin fiber level on the other, this study provides a first vision of the structural landscape in which Xist regulation takes place, and brings new insights concerning fundamental properties of chromosome organization in mammals.

Depuis les 15 dernières années, de nombreuses études ont mis en évidence le rôle majeur de l’architecture nucléaire dans la régulation de l’expression des gènes et ceci dans une grande diversité de processus biologiques. Bien que la réponse immunitaire soit un de ces processus, peu de données existent sur l’organisation spatiale du génome dans les cellules immunitaires et son impact sur la régulation des gènes dans le contexte d’une réponse à l’infection bactérienne. En utilisant le porc comme organisme modèle, nous avons concentré notre étude sur les macrophages dérivés de monocytes, premières lignes de défense contre les pathogènes. Les cellules immunitaires étant les cibles des mycotoxines, nous nous sommes également intéressés aux effets de la toxine T-2 sur les macrophages et leur réponse induite par les récepteurs TLR. Un effet cytotoxique de la T-2 à une dose de 10 nM, ainsi que des effets inhibiteurs sur certaines réponses liées aux récepteurs TLR ont été mis en évidence. Nous avons ensuite examiné si les changements dans l'expression des gènes dus à l'activation impliquent un repositionnement dans l'espace nucléaire. Une analyse du transcriptome a permis d’identifier les gènes différentiellement exprimés dans les macrophages activés par le mélange LPS-IFNγ et de mettre en évidence des réseaux de gènes impliqués lors de l’activation. Les 4 gènes les plus sur-exprimés (IL1β, IL8, CXCL10 et TNFα) et les 4 gènes les plus sous-exprimés (VIM, LGALS3, TUBA3 et IGF2) ont été sélectionnés pour analyser leur comportement dans l'espace nucléaire au cours de l’activation des macrophages en utilisant la technique FISH 3D. Parmi les 4 gènes sur-exprimés, 3 présentent des modifications de leur position durant le processus d'activation alors que les 4 gènes sous-exprimés ne montent pas de variation de leur position. L'analyse de la position des gènes par rapport à leurs territoires chromosomiques (TC) a été étendue à un second type de cellules immunitaires : les neutrophiles. Des résultats similaires ont été obtenus. Les analyses ont été ensuite complétées par l'étude des 4 gènes sur-exprimés dans un type cellulaire indépendant de la réponse immunitaire (fibroblastes). Nos données suggèrent que les relocalisations dans l'espace nucléaire des gènes différentiellement exprimés dans les cellules immunitaires activées sont gène spécifique, type cellulaire spécifique et concernent essentiellement ceux qui sont sur-exprimés. / For the past 15 years, numerous studies have highlighted the role of nuclear architecture in regulating gene expression in a variety of biological processes. Although the immune response is one of these processes, few data exist on the spatial organization of the genome in immune cells and its impact on gene regulation in the context of a response to bacterial infection. Using pigs as a model organism, we focused our study on monocytederived macrophages, the first lines of defence against pathogens. As immune cells are the targets of mycotoxins, we also studied the effects of T-2 toxin on macrophages and on their responses induced by TLRs. A cytotoxic effect of T-2 at a dose of 10 nM, and an inhibitory effect on some responses related to TLRs have been demonstrated. We then examined whether changes in gene expression due to activation involve a repositioning within the nuclear space. A transcriptome analysis allowed us to identify differentially expressed genes in macrophages activated by LPS-IFNγ and to analyze gene networks involved during activation. The top 4 up-regulated genes (IL1 beta, IL-8, CXCL10 and TNF) and the top 4 down-regulated ones (VIM LGALS3, TUBA3 and IGF2) have been selected to analyze their behaviour in nuclear space during macrophages activation using 3D FISH technique. Among the 4 up-regulated genes, 3 show changes in their position during the activation process while the 4 down-regulated ones did not reposition. The analysis of gene behaviours towards their chromosome territories (CT) was extended to neutrophils and similar results were obtained. The analyses were then completed by the study of the 4 up-regulated genes in a non immune cell type (fibroblast). Our data suggest that relocation in the nuclear space of genes differentially expressed in activated immune cells is gene and cell type specific and mostly concerns those that are up-regulated.

L'ADN peut être endommagé par des facteurs environnementaux ou intrinsèques au fonctionnement des cellules. Ces facteurs induisent différents types de lésions dont les cassures double brins (CDBs). Les CDBs sont particulièrement dangereuses pour les cellules et une réparation inefficace ou non précise de ces cassures peut entraîner des mutations ou des translocations qui peuvent être à l'origine de cancer. Afin d'éviter l'instabilité génétique que peuvent induire les CDBs, les cellules ont développé deux principaux mécanismes de réparation: la ligature d'extrémités non homologues (NHEJ pour non homologous end joining) et la recombinaison homologue (HR pour homologous recombination). L’utilisation de l’un ou de l’autre de ces mécanismes est finement régulée et une dérégulation de cet équilibre induit une importante instabilité génomique.Tous ces mécanismes ont lieu dans le noyau des cellules qui, chez les mammifères est fortement hétérogène, comportant différents compartiments et des régions où la chromatine est plus ou moins compacte. Cette hétérogénéité implique que la réparation de l’ADN doit pouvoir être efficace dans différents contextes nucléaires. Au cours de ma thèse, j’ai étudié l’influence de l’architecture nucléaire sur le choix des mécanismes de réparation des CDBs. J’ai montré d’une part que la protéine appartenant au pore nucléaire Nup153 influence l’équilibre entre HR et NHEJ et d’autre part que la position d’une CDB influe sur le choix du mécanisme de réparation.Mes résultats démontrent que l’organisation des gènes dans le noyau est un nouveau paramètre à prendre en compte dans l’étude des mécanismes de réparation de l’ADN et de tumorigénèse. / DNA is constantly assaulted by various damaging agents, leading to different types of lesions including double-strand breaks (DSBs). DSBs are the most harmful lesions to the cells and their inaccurate or inefficient repair can trigger genomic instability and tumorigenesis. To cope with DSBs, cells evolved several repair pathways, including non-homologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). A fine regulation of the balance between these two pathways is necessary to avoid genomic instability.All of these mechanisms happen in the nucleus, which is highly heterogeneous in mammalian cells. Indeed, it encompasses several compartments and regions of various chromatin compaction levels. My PhD project focused on the influence of nuclear architecture on DNA repair pathway choice. I demonstrated on one hand that the nuclear pore protein Nup153 influences the balance between HR and NHEJ and on the other hand that the position of a DSB influences the choice of the repair pathway that will be used.My results demonstrate that gene positioning is a new important parameter in the study of DNA repair and tumorigenesis.

Les noyaux des cellules eucaryotes contiennent différents compartiments définis fonctionnellement ou structurellement et à multiples échelles qui présentent une distribution spatiale très ordonnée. Un défi majeur est alors d'identifier les règles selon lesquelles les compartiments nucléaires sont organisés dans l'espace et de décrire comment ces règles peuvent varier en fonction des conditions physiologiques ou expérimentales. Les statistiques spatiales ont rarement été utilisées à cette fin et se sont généralement limitées à l'évaluation de l'aléatoire complet. Ici, nous développons une approche de statistiques spatiales qui combine la cytologie, l'analyse d'image et la modélisation spatiale pour mieux comprendre les configurations spatiales à l'intérieur du noyau. Notre première contribution est un cadre méthodologique qui permet de tester des modèles d'organisation spatiale au niveau de la population. Plusieurs modèles spatiaux ont été proposés et mis en œuvre, en particulier l'aléatoire, l'aléatoire orbitale, la régularité maximale, l'aléatoire territoriale et l'aléatoire territoriale orbitale, pour analyser la distribution d'objets biologiques dans des domaines 3D finis et de formes arbitraires. De nouveaux descripteurs spatiaux, combinés aux descripteurs classiques, sont utilisés pour comparer les motifs observés à des configurations attendues sous les modèles testés. Une version non biaisée d'un test statistique publié précédemment est proposé pour évaluer la qualité de l'ajustement des modèles spatiaux sur les distributions observées. Après, nous étudions les propriétés de l'approche proposée à partir de données réelles et simulées. La robustesse de l'approche proposée aux erreurs de segmentation et la fiabilité des évaluations spatiales sont examinées. En outre, la base d'une méthode pour comparer les distributions spatiales entre différents groupes expérimentaux est proposée. Dans la dernière partie de ce travail, notre approche est appliquée à des images de noyaux cellulaires de la feuille chez A. thaliana, pour analyser la distribution spatiale de compartiments dynamiques et plastiques d'hétérochromatine, les chromocentres, qui ont un rôle important dans la structure du génome. Des noyaux isolés et des cryo-sections provenant de plantes de type sauvage ont été analysés. Nous montrons que les chromocentres présentent une distribution très régulière, ce qui confirme les résultats publiés précédemment. En utilisant nos nouveaux descripteurs, nous démontrons pour la première fois, objectivement et quantitativement, que les chromocentres présentent une localisation préférentielle périphérique. En employant un nouveau modèle spatial, nous rejetons l'hypothèse selon laquelle l'organisation régulière observée est uniquement expliquée par un positionnement périphérique. Nous démontrons en outre que les chromocentres affichent une régularité spatiale proche de la régularité maximale à l'échelle globale, mais pas à l'échelle locale. Enfin, nous utilisons des simulations pour tester un modèle selon lequel le positionnement des chromocentres est déterminé par les territoires chromosomiques et par des interactions avec l'enveloppe nucléaire. Nous avons ensuite vérifié s'il la distribution des chromocentres pouvait être modifiée par différentes mutations. Nous avons analysé les données de noyaux des mutants crwn et kaku, qui sont connus pour influencer la morphologie nucléaire. Les résultats suggèrent que ces mutations impactent en effet la morphologie nucléaire et les caractéristiques de l'hétérochromatine, mais ne modifient pas la régularité de la distribution des chromocentres même si la distance à la frontière du noyau est affectée. La généricité du cadre proposé pour analyser les distributions d'objets dans des domaines 3D finis et la possibilité d'ajouter de nouveaux modèles et descripteurs spatiaux devrait permettre d'analyser des organisations spatiales au sein de différents systèmes biologiques et à différentes échelles. / Eukaryotic cell nuclei contain distinct functionally or structurally defined compartments at multiple scale that present a highly ordered spatial arrangement. Several studies in plants and animals have pointed out to links between nuclear organization and genome functions. A key challenge is to identify rules according to which nuclear compartments are organized in space and to describe how these rules may vary according to physiological or experimental conditions. Spatial statistics have been rarely used for this purpose, and were generally limited to the evaluation of complete spatial randomness. In this Thesis, we develop a spatial statistical approach, which combines cytology, image analysis and spatial modeling to better understand spatial configurations inside the nucleus. Our first contribution is a methodological framework that allows to test models of spatial organization at the population level. Several spatial models have been developed and implemented, including randomness, orbital randomness, maximum regularity, territorial randomness or orbital territorial randomness of biological objects within finite 3D domains of arbitrary shape. New spatial descriptors, in combination with classical ones, are used to compare observed patterns to expected configurations under the tested models. An unbiased version of a previously published statistical test is proposed to evaluate the goodness-of-fit of spatial models over populations of observed patterns. In the second part of this Thesis, we investigate the properties of the proposed approach using simulated and real data. The robustness of the proposed approach to segmentation errors and the reliability of the spatial evaluations are examined. Besides, the basis for a method to compare spatial distributions between different experimental groups is proposed. In the last part of this work, the proposed approach is applied on A. thaliana leaf cell nuclei images to analyze the spatial distribution of chromocenters, which are dynamic and plastic heterochromatic compartments that have an important structural role in the genome. A first application was to analyze isolated and cryo-section nuclei from wild type plants. We show that chromocenters present a highly regular distribution, confirming previously published results. Using new spatial statistical descriptors, we then demonstrate objectively and quantitatively, for the first time, that chromocenters exhibit a preferentially peripheral localization. Employing a new spatial model, we then reject the hypothesis that the regular organization is explained solely by the peripheral positioning. We further demonstrate that chromocenters organization displays a close-to-maximum spatial regularity at the global scale, but not at the local one. Lastly, we use simulations to examine a model according to which chromocenters positioning is constrained by chromosome territories and by interactions with the nuclear boundary. The second application was to elucidate whether chromocenters distribution could be altered under different mutations. We analyze nuclei data from crwn and kaku mutants, which are known to affect nuclear morphology. The results suggest that these mutations impact on nuclear morphology and on heterochromatin features but do not alter the regularity of chromocenters distribution even when the relative distance to the border is affected. The genericity of the proposed framework to analyze object distributions in finite 3D domains and its expandability to add more spatial models and spatial descriptors should be of interest to decipher spatial organizations within biological systems at various scales.