[EN] Any living cell needs to maintain adequate levels of nutrients and ions to ensure the continuity of its functions. The first step in the maintenance of both ion and nutrient homeostasis is their uptake from the extrenal environment, where plasma membrane transporter proteins play an important role. The regulation of both the activity and abundance of permeases in the plasma membrane is a pivotal aspect of the cellular response to different environmental conditions. Therefore, deciphering the pathways that regulate the function or the presence of these transport proteins is important for a better understanding of cell physiology and stress responses. Transcriptional regulation is a contributor to the control of the abundance of plasma membrane transporters, and more specifically in the yeast model Saccharomyces cerevisiae a strong transcriptional regulation of the hexose transporters has been demonstrated. However, there are other important levels for the control and maintenance of glucose homeostasis, such as post-translational regulation of glucose transporters, which are still being defined. Ubiquitination, as a signal for endocytosis of membrane proteins, mediated by the E3 ubiquitin ligase Rsp5 has been demonstrated for many transporters, including the HXT family. In recent years, several studies have shown the involvement of the ART protein family (Arrestin-Releated Trafficking proteins) in this process, acting as adapters for Rsp5 and providing specificity to the ubiquitination of permeases in response to changes in environmental conditions. In turn, the members of this family of adapter proteins are targets of post-translational modifications, such as phosphorylation or ubiquitination, affecting their activity and adding an additional level in the regulation of transporter interactions. Previous studies have demonstrated the existence of a genetic interaction between the high affinity glucose transporter Hxt6 and the Rsp5 adapter protein, Rod1 (Art4). In turn, the Snf1 kinase was shown to be involved in the phosphorylation of this adapter protein, suggesting a possible role in the regulation of its activity. With this background, and taking into consideration the interaction of 14-3-3 proteins with other adapter proteins, in this study the biochemical characterization of the Art4-Snf1-14-3-3 signaling pathway involved in the regulation of the endocytosis of the glucose transporter Hxt6 and the effect of Snf1 and 14-3-3 proteins (Bmh2) on intracellular traffic of the Hxt6-Art4 complex will be investigated. Similarly, the effect of Art4, and its paralogue Rog3 (Art7), on Hxt6 levels and the phenotypes of other glucose transporter mutants, such as hxt1 and hxt3 will be analyzed to determine whetherthese transporters display a common regulatory mechanism also involving Art4 and Art7. In short, this thesis aims to provide new data on the post-translational regulation of the HXT transporters through the Rsp5 adapter family of ART proteins, with emphasis on biochemical aspects, such as phosphorylation, and molecular and cellular aspects, such as intracellular trafficking and permease stability / [ES] Cualquier célula viva necesita mantener niveles adecuados de iones y nutrientes para asegurar la continuidad de sus funciones. El primer paso en la conservación de la homeostasis de iones como el potasio o nutrientes como la glucosa, es la toma de los mismos desde el medio externo, teniendo los transportadores de membrana un papel básico en este proceso. La regulación de estos transportadores tiene una función fundamental en la respuesta de las células a diferentes condiciones ambientales, siendo esenciales tanto la modulación de su actividad como la abundancia de permeasas en la membrana plasmática. Por esto, el estudio de las rutas que regulan la función o la presencia de dichos transportadores en la membrana plasmática es importante para un mejor conocimiento de la fisiología celular y la respuesta de las células al estrés. La regulación transcripcional supone un nivel importante en el control de la abundancia de transportadores en la membrana plasmática, y más concretamente en la levadura modelo Saccharomyces cerevisiae se ha demostrado que los transportadores de hexosas poseen una fuerte regulación a nivel transcripcional. Sin embargo, existen otros niveles importantes para el control y el mantenimiento de la homeóstasis de hexosas, como la regulación postraduccional, y que en el caso de los transportadores de glucosa es menos conocida. La ubiquitinación como señal para la endocitosis de proteínas de membrana a través de la E3 ubiquitín ligasa Rsp5 ha sido demostrada para gran número de transportadores, incluidos los de la familia HXT. En los últimos años, varios estudios han demostrado la implicación de la familia de proteínas ART (Arrestin Releated Trafficking proteins) en este proceso, actuando como adaptadores de Rsp5 y aportando especificidad a la ubiquitinación de transportadores en respuesta a cambios en las condiciones del medio. A su vez, esta familia de proteínas adaptadoras es diana de modificaciones postraduccionales, como la ubiquitinación o la fosforilación, que repercuten en su actividad y suman un nivel adicional en la regulación de los transportadores con los que interaccionan. Estudios anteriores demostraron la existencia de una interacción genética entre el transportador de glucosa de alta afinidad Hxt6 y la proteína adaptadora de Rsp5, Rod1 (Art4). A su vez, la quinasa Snf1 fue implicada en la fosforilación de esta proteína adaptadora, sugiriendo una posible función en la regulación de su actividad. Con estos precedentes, y teniendo en consideración la interacción de las proteínas 14-3-3 con otras proteínas adaptadoras, en el presente estudio se llevará a cabo la caracterización bioquímica de la ruta de señalización Art4-Snf1-14-3-3 implicada en la regulación por endocitosis del transportador de glucosa Hxt6 y se estudiará el efecto de Snf1 y las proteínas 14-3-3 (Bmh2) sobre el tráfico intracelular del complejo Hxt6-Art4. Del mismo modo, se analizará el efecto de Art4, y de su parálogo Rog3 (Art7), sobre los niveles de Hxt6 y se caracterizarán los fenotipos de mutantes para otros transportadores de glucosa, como Hxt1 y Hxt3, por la posibilidad de que presenten un mecanismo regulador común que implique también a Art4 y Art7. En definitiva, la presente tesis doctoral pretende aportar nuevos datos acerca de la regulación postraduccional de transportadores de la familia HXT a través de las proteínas ART, adaptadoras de Rsp5, haciendo hincapié en aspectos bioquímicos como la fosforilación y la ubiquitinación, y en aspectos moleculares y celulares, como el tráfico intracelular o la estabilidad de permeasas. / [CA] Qualsevol cèl-lula viva necessita mantindre nivells adequats d'ions i nutrients per tal d'assegurar la continuïtat de les seues funcions. El primer pas en la conservació de l'homeòstasi d'ions com el potassi o nutrients com la glucosa, és la pressa dels mateixos des del medi extern, tot i tenint els transportadors de membrana un paper bàsic en este procés. De manera directa, la regulació d'aquests transportadors té una funció fonamental en la resposta de les cèl-lules a diferents condicions ambientals, tot i sent processos essencials tant la modulació de la seua activitat com l'abundància de permeases a la membrana plasmàtica. Per això, entendre les rutes que regulen la funció o la presència dels transportadors a la membrana és important per a un millor coneixement de la fisiologia cel-lular i la resposta a l'estrés. La regulació transcripcional suposa un nivell important en el control de l'abundància de transportadors a la membrana plasmàtica, i més concretament en el rent model Saccharomyces cerevisiae s'ha demostrat que les permeases d'hexoses tenen una forta regulació a nivell transcripcional. A banda d'aquest tipus de regulació, existeixen altres nivells importants per al control i el manteniment de l'homeòstasi de la glucosa, com la regulació postraduccional, i , que en el cas dels transportadors de glucosa, és menys coneguda. L'ubiquitinació com a senyal per a l'endocitosi de proteïnes de membrana a través de l'E3 ubiquitina ligasa Rsp5, ha sigut demostrada per a un gran nombre de transportadors, inclosos els de la família HXT. En els últims anys, diversos estudis han posat de manifest la implicació de la família de proteïnes ART (Arrestin Releated Trafficking proteins) en este procés, tot i actuant com adaptadores de Rsp5 i aportant especificitat a l'ubiquitinació de transportadors en resposta a canvis en les condicions del medi. Al mateix temps, aquesta família de proteïnes és diana de modificacions postraduccionals, com l'ubiquitinació o la fosforilació, que tenen un efecte en la seua activitat i sumen un nivell addicional a la regulació dels transportadors amb els quals interaccionen. Estudis anteriors demostraren l'existència d'una interacció genètica entre el transportador de glucosa d'alta afinitat Hxt6 i la proteïna adaptadora de Rsp5, Rod1 (Art4). De la mateixa manera, la quinasa Snf1 va ser involucrada en la fosforilació d'aquesta proteïna adaptadora, tot i suggerint una possible funció en la regulació de la seua activitat. Amb estos precedents, i tenint en compte la interacció de les proteïnes 14-3-3 amb altres proteïnes adaptadores, en el present estudi es durà a terme la caracterització bioquímica de la ruta de senyalització Art4-Snf1-14-3-3 implicada en la regulació per endocitosi del transportador de glucosa Hxt6, i s'estudiarà l'efecte de Snf1 i les proteïnes 14-3-3 (Bmh2) sobre el tràfic intracel-lular del complex Hxt6-Art4. Per altra banda, s'analitzarà l'efecte de Art4, i del seu paràleg Rog3 (Art7), sobre els nivells de Hxt6 i es caracteritzaran els fenotips de mutants per a altres transportadors de glucosa, tals com Hxt1 i Hxt3, per la possibilitat que presenten un mecanisme regulador comú que també implique a Art4 i Art7. En definitiva, la present tesi doctoral pretén aportar noves dades al voltant de la regulació postraduccional dels transportadors de la família HXT a través de les proteïnes ART, adaptadores de Rsp5, tot i aprofundint en aspectes bioquímics com la fosforilació i l'ubiquitinació, i en aspectes moleculars i cel-lulars, com el tràfic intracel-lular o l'estabilitat de permeases / Llopis Torregrosa, V. (2016). Mecanismos de regulación de transportadores de iones y nutrientes a través de proteínas de tráfico relacionadas con las arrestinas [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/60149

Níveis elevados de hormônios tireoidianos (HTs) são comumente associados à ativação do sistema renina angiotensina local e ao desenvolvimento da hipertrofia cardíaca. O envolvimento do receptor de angiotensina II tipo 1 (AT1R) nos efeitos hipertróficos dos HTs fora descrito previamente. No entanto, os mecanismos subjacentes a essa interação ainda são desconhecidos. O AT1R pertence à família dos receptores acoplados à proteína G e, portanto, promove a transdução de sinal por mecanismos dependentes e independentes de proteína G. Recentemente, a sinalização dependente de beta-arrestinas (independente de proteína G) tem sido descrita por contribuir com a resposta hipertrófica em diferentes modelos experimentais. Assim, no presente estudo investigou-se o envolvimento da sinalização dependente de beta-arrestinas nos efeitos hipertróficos dos HTs, mediados pelo AT1R, bem como a participação de ERK½ nesse processo. Culturas primárias de cardiomiócitos foram estimuladas com T3 (triiodotironina; 15nM) para indução da hipertrofia. O tratamento dos cardiomiócitos com T3 por tempos rápidos (5-30 min) resultou na ativação transiente de ERK½, a qual foi parcialmente atenuada quando da administração de Losartan (1µM), antagonista do AT1R. A contribuição de ERK½ na hipertrofia dos cardiomiócitos foi verificada através do uso de PD98059 (20µM), inibidor de MEK½, o qual preveniu a transcrição de marcadores hipertróficos. Ensaios de imunoprecipitação revelaram o aumento da interação entre AT1R e beta-arrestina 2 sob estímulo do T3, sugerindo o recrutamento de beta-arrestina 2 e, possível, internalização do AT1R. Através de ensaios de imunofluorescência e fracionamento subcelular, foi demonstrado que o T3 estimula a translocação do AT1R, amentando sua expressão no núcleo dos cardiomiócitos. Além disso, tanto a ativação de ERK½ quanto a hipertrofia cardiomiocítica mostraram-se sensíveis à inibição da endocitose, a qual foi avaliada através de Concanavalina A (0,5µg/ml). Ensaios de silenciamento gênico por RNA de interferência foram eficientes em demonstrar o envolvimento de beta-arrestina 2 na ativação de ERK½ e na hipertrofia cardiomiocítica induzida por T3. Desta forma, os resultados evidenciam o envolvimento da sinalização dependente de beta-arrestina 2 na ativação de ERK½, através do AT1R, a qual contribui com a hipertrofia cardiomiocítica promovida pelo T3. / Elevated levels of thyroid hormones (THs) are commonly associated with activation of the local renin angiotensin system and the development of cardiac hypertrophy. The involvement of the angiotensin II receptor type 1 (AT1R) in the hypertrophic effects of the THs was previously described. However, the mechanisms underlying this interaction are still unknown. AT1R belongs to the G-protein coupled receptor family and promotes its signal transduction by G-protein dependent and independent mechanisms. Recently, beta-arrestin signaling (G-protein independent) has been described as contributing to the hypertrophic response in different experimental models. Thus, the present study investigated the involvement of beta-arrestin signaling in the hypertrophic effects of THs mediated by AT1R, as well as the participation of ERK½ in this process. Primary cardiomyocytes cultures were stimulated with T3 (triiodothyronine; 15nM) for the induction of hypertrophy. Cardiomyocytes acutely treated with T3 (5-30 min) resulted in transient activation of ERK½, which was partially attenuated upon Losartan (1µM) administration, an AT1R antagonist. The contribution of ERK½ to cardiomyocyte hypertrophy was verified by using PD98059 (20µM), a MEK½ inhibitor, which prevented the transcription of hypertrophic markers. Immunoprecipitation assays revealed increased interaction between AT1R and beta-arrestin 2 under T3 stimulation, suggesting the recruitment of beta-arrestin 2 and, possibly, the internalization of AT1R. Through immunofluorescence and subcellular fractionation assays, T3 has been shown to stimulate AT1R translocation, enhancing its expression in the cardiomyocyte nucleus. In addition, both ERK½ activation and cardiomyocyte hypertrophy were sensitive to the inhibition of endocytosis, which was assessed by Concanavalin A (0.5µg/ml). Interfering RNA assays were efficient in demonstrating the involvement of beta-arrestin 2 in ERK½ activation and in T3-induced cardiomyocyte hypertrophy. Therefore, the results evidenced the involvement of beta-arrestin-2-dependent signaling in the activation of ERK½, through the AT1R, which contributes to the cardiomyocyte hypertrophy promoted by T3.